Abstract
Gibson samenstel (GA) klonering biedt een snelle, betrouwbare en flexibele alternatief voor conventionele DNA klonering werkwijzen. We gebruikten GA voor afgestemde plasmiden voor de expressie van exogene genen in de muis embryonale stamcellen (mESCs) te creëren. Expressie van exogene genen onder controle van de SV40 of humaan cytomegalovirus promoters vermindert snel na transfectie in mESCs. Een oplossing voor dit verminderde expressie de menselijke verlengingsfactor-1 alfa (hEF1α) promoter om genexpressie. Plasmide vectoren die hEF1α niet zo ruim SV40 en CMV-bevattende plasmiden, vooral ook die N-eindstandige 3xFLAG-markeringen. De hier beschreven protocol is een snelle methode om plasmiden die FLAG-tagged CstF-64 en CstF-64 mutant onder de expressional regulering van de hEF1α promotor te creëren. GA gebruikt een mengsel van DNA exonuclease, DNA polymerase en DNA-ligase klonen overlappende uiteinden van DNA-fragmenten mogelijk.Op basis van de template-DNA's die we beschikbaar hadden, hebben we onze constructies te worden samengevoegd tot een enkele sequentie. Ons ontwerp gebruikte vier DNA-fragmenten: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1α promotor deel 1, hEF1α promotor deel 2 ofwel CstF-64 of specifieke CstF-64 mutant (die 3xFLAG-tag gekocht als een dubbelstrengs synthetisch DNA-fragment bevatte), en. De sequenties van deze fragmenten werden geupload naar een primer generatie tool geschikte PCR primers te ontwerpen voor het genereren van DNA-fragmenten. Na PCR werden DNA- fragmenten gemengd met de vector die het selectieve marker en GA klonering reactiemengsel werd geassembleerd. Plasmiden uit afzonderlijke getransformeerde bacteriële kolonies werden geïsoleerd. Beginscherm van de plasmiden werd uitgevoerd door restrictiedigestie, gevolgd door sequencing. Tot slot, GA liet ons toe om op maat gemaakte plasmiden voor gen-expressie te creëren in 5 dagen, inclusief de bouw van schermen en verificatie.
Introduction
Conventionele DNA klonering procedures afhankelijk van het gebruik van restrictie-enzymen om het DNA en DNA ligase aanhangen de DNA-fragmenten samen te voegen. Generatie van aangepaste expressieconstructen met verschillende DNA fragmenten is een sequentiële procedure die splitsing van het DNA omvat met een en / of meerdere restrictie-endonucleasen en daaropvolgende insertie van DNA-fragmenten door ligatie. Het grote nadeel van deze procedure is dat geschikte restrictie-enzymen voor één van de DNA-fragmenten moeilijk te identificeren kunnen zijn (dwz kan enkele splitsingsplaatsen hebben) waardoor succesvolle DNA klonering van het volledige-lengte eiwit van interesse mogelijk. Derhalve genereren van aangepaste expressieconstructen onder de transcriptionele regulatie van efficiënte celtype-specifieke promotors aanpassen met eiwit-markeringen vereist zeer zorgvuldig ontwerp. Het is ook een tijds- en arbeidsintensieve techniek. Onlangs heeft een aantal rapporten beschreven methoden om multip assemblerenle verschillende synthetische DNA-fragmenten na elkaar tegelijkertijd in enkelzijdige of stappen reacties zonder het gebruik van restrictie enzymen 1-3. De eenstaps klonen reactie (exclusief alle voorbereidende stappen), afhankelijk van het gebruik van een mengsel van DNA exonuclease, DNA-polymerase, DNA-ligase 2,3 en de overlappende uiteinden van DNA-fragmenten (Figuur 1). Aangezien er geen gebruik van restrictie-enzymen, DNA fragmenten kunnen van elke grootte en sequentiesamenstelling (exclusief zeer repetitieve sequenties) tezamen gefuseerd in een naadloze constructie. Onlangs heeft een commerciële kit (Gibson vergadering; GA) voor de een-stap klonen reacties beschikbaar kwam. Deze kit maakt een snelle en kostenefficiënte assemblage van een DNA-fragmenten in een enkele vector met aangepaste promotors en eiwit-tags.
De alom verkrijgbare plasmide expressievectoren gebruikt voor exogene eiwitten in zoogdierlijke celkweek modellen expressie vaak onder de transcriptionele regning van de virale cytomegalovirus (CMV) of Simian virus 40 (SV40) promoters. Deze virale promotoren sterke kortstondige expressie van de exogene eiwitten in de meeste zoogdierlijke celkweek gebaseerde modellen. Echter, het maken van cellijnen die stabiel exogene eiwitten vaak mislukt omdat transcriptionele silencing van de CMV of SV40 promoters tijdens het vestigingsproces 4,5. Daarnaast zal de SV40 en CMV virale promoters onvoldoende bevorderen de expressie van exogene eiwitten in cellen van de lymfoïde oorsprong of embryonale stamcellen 6,7. De oplossing voor de inherente beperking van virale promoters sterke constitutieve niet-virale promoters 8-10 gebruiken. Een goed gekarakteriseerd sterke constitutieve niet- virale promotor van humane oorsprong is de verlengingsfactor 1α (hEF1α) promoter (hEF1α is betrokken bij de katalyse van de GTP-afhankelijke associatie van aminoacyl-tRNA aan ribosomen 11). Echter,expressievectoren die de hEF1α promotor niet zo ruim de virale promoter bevattende plasmiden, vooral die waarin 3 x FLAG aan het amino-uiteinde van het eiwit van interesse.
De 64.000 MW splitsing stimulatie-eiwit (CstF-64) is betrokken bij het 3 'uiteinde verwerking van de meeste mRNAs 12,13, waaronder replicatie-afhankelijke histon mRNA 14,15. CstF-64 expressie wordt gebracht in alle somatische weefsels 12. Het RNA herkenningsmotief bindt aan GU-rijke RNA sequenties op ontluikende transcripten stroomafwaarts van de splitsing en polyadenylatie plaats 16. Deze binding van CstF-64 van de pre-mRNA bevordert efficiënt endonucleolytische splitsing van de ontluikende transcript.
Hier wordt een protocol beschreven die PCR amplificatie van de DNA fragmenten gebruikt, een Gibson samenstel klonering kit (die chemisch competente bacteriële cellen bevat) aangepaste vectoren van 3xFLAG-gelabeld m producerenOuse CstF-64 of mutant CstF-64 om hun amino-uiteinde onder de uitdrukking van hEF1α promotor 1.
Protocol
1. In Silico Ontwerp van het plasmide en de Generatie van de overlappende Primers
Opmerking: Het doel van deze stap is om volledige nucleotidesequentie van construct monteren en het ontwerp van de primers worden gebruikt om fragmenten met overlappende uiteinden GA klonen te genereren.
- Ontwerp een continue nucleotidesequentie de uiteindelijke plasmide vertegenwoordigen.
- Verkrijgen of lijst van feitelijke plasmiden en DNA-fragmenten die zullen worden gebruikt als sjablonen bij PCR.
OPMERKING: DNA-fragmenten die niet direct beschikbaar zijn - zoals verschillende combinatie van labels en promotors - kunnen worden besteld als een enkele of meerdere synthetische dubbelstrengs DNA-fragmenten (SDNA). Deze fragmenten zijn in de handel verkrijgbaar bij betrekkelijk lage kosten en kunnen tot 2 kb in lengte (zie tabel of Materials). - Verdeel de continue nucleotidesequentie van het construct samengesteld in stap 1.1 in DNA-fragmenten die geschikt zijn voor PCR. Bevesm die de fragmenten overeenkomen beschikbare plasmiden en SDNA fragmenten. Vermijd DNA fragmenten kleiner dan 200 nt.
- Toegang tot de primer generatie tool (zie tabel van apparatuur). Selecteer het menu "Set Preferences". Kies de juiste instellingen door te klikken op de tab "CHANGE PREFS" in het "Change Gibson Vergadering Instellingen" pop-up venster.
OPMERKING: Primer ontwerp kan ook worden uitgevoerd zonder het gebruik van de primer generatie tool. Echter, het gebruik van de primer generatie tool vereenvoudigt het proces. - Beginnen met de bouw van de constructie door het selecteren van het menu "Build Construct". Plaats de splitsing van DNA-fragmenten in de primer generatie tool achtereenvolgens van 5 'naar 3' uiteinde.
Opmerking: Het DNA-fragment als plasmideskelet kan gemakkelijk worden verdeeld in twee delen. In het uiteindelijke PCR product uiteinde van deze eerste fragment en het 3 'uiteinde van het laatste fragment van de 5 met elkaar verbonden in een continue DNEen fragment die de vector backbone. - Plak de eerste DNA-fragment vertegenwoordigen eind van de vector DNA in FASTA formaat (een op tekst gebaseerde representatie van nucleotidesequentie) in de "Enter Vector of Insert Fragment" pop-up venster van de 5 '. Noem het DNA-fragment. Kies de juiste manier om het DNA-fragment te verkrijgen, hetzij als PCR, RE Digest of Synthese. Klik op het tabblad "VERDER".
- Indien er behoefte aan extra nucleotiden / restrictieplaatsen toe op de kruising van het uiteindelijke construct de "vooruit of achteruit primer spacer" ruimten die in het venster "een insert fragment aan het samenstel". Voeg extra nucleotiden / restrictieplaatsen slechts één van de DNA fragmenten en niet beide fragmenten. Klik op "DONE" tab.
- Herhaal voor alle fragmenten totdat het construct is voltooid. Selecteer het menu "View Primers" en bekijk de primer sequenties.
- Herhaal dit voor alle constructies (vector backbones en inserts), of voor DNA-fragmenten die anders zijn.
2. Amplificatie van de DNA fragmenten door PCR met behulp van Hot Start proeflezen DNA Polymerase (2x Master Mix)
OPMERKING: De doelstelling deze stap voldoende DNA voor de montage reactie middels PCR verkregen.
- Koop de PCR primers in de vorige stap als ontzout producten en op de kleinst mogelijke schaal. Verdun ze 10 uM in water of TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 1 mM EDTA).
- Aanschaffen DNA-fragmenten die niet direct beschikbaar als SDNA fragmenten zijn.
- Verdun alle DNA-fragmenten, waaronder de SDNA fragmenten die wordt gebruikt als mal voor de PCR tot 1 ng / ul in water.
- Monteer de PCR reacties bij kamertemperatuur. Kort gebruik 2,5 pl (10 uM voorraadoplossing) van elke respectieve primer van het primerpaar, 1 ui (van 1 ng / ul voorraadoplossing) van de matrijs-DNA-fragment, 25 μl van warme start proeflezen DNA polymerase (DNA pol; 2x master mix; zie tabel van Materialen) en 19 pi water. Meng de buis door zachtjes tikken en het verzamelen van de vloeibare druppels door kort centrifugeren.
- Gelijktijdig amplificeren in afzonderlijke buisjes DNA-fragmenten van vergelijkbare grootte volgens de aanbevelingen van de DNA pol. Uitvoeren 25-28 PCR-cycli of bepalen van het aantal cycli dat er voldoende DNA-opbrengst te produceren.
- Run 10% van het PCR-reactievolume (5 ui) op een standaard agarose gel elektroforese gekleurd met ethidiumbromide (0,2 ug / ml eindconcentratie). Stellen een enkele DNA-band die het PCR product zichtbaar. Bepaal de grootte en de relatieve hoeveelheid van de DNA-fragmenten met behulp van DNA molecuulgewichtstandaarden. Herhaal eventueel de PCR voldoende hoeveelheid DNA-fragmenten te verkrijgen.
3. DpnI Digestie van de PCR producten
Opmerking: Het doel van deze stap is om Digest resterend plasmide template DNA van de PCR's in hoofdstuk 2. DpnI plasmide-DNA zal verteren alleen als het gemethyleerd, zoals het zich voordoet om DNA gegroeid in dam + bacteriestammen plasmide. Daarom niet behandelen met DpnI als plasmide-DNA wordt gebruikt als een DNA-fragment in de GA reactie.
- Voeg 2 ui Dpnl restrictie-enzym voor 45 gl van de PCR producten die in hoofdstuk 2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Ga verder met deel 4 of bevriezen bij -20 ° C totdat het nodig is.
4. Zuivering en concentratie van de DNA fragmenten op DNA Purification Magnetic Beads
Opmerking: Het doel van deze stap is het zuiveren en concentreren van de verkregen punten 2 en 3. Andere PCR zuiveringswerkwijzen PCR-producten kunnen eveneens worden gebruikt.
- Equilibreer de DNA-zuivering magnetische korrels tot kamertemperatuur. Resuspendeer de kralen door kort vortexen.
- Breng de PCR's pre-verteerd with DpnI naar 1,5 ml buisjes en voeg 81 ul van DNA-zuivering magnetische korrels aan elke buis. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Plaats de buizen op de magnetische collector gedurende ongeveer 2 min. Gooi de heldere vloeistof met een pipet. Tweemaal wassen met 200 pl 80% ethanol gedurende 30 sec.
- Laat de pellets te drogen. Houd het deksel van de buizen open, met de kranen in de magnetische collector.
- Resuspendeer de gedroogde korrels in 10 ui 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Spin kort naar de vloeistof verzamelen op de bodem van de buizen.
- Plaats de buizen op de magnetische collector gedurende 2 min. Verwijder 8,5-10 pl van de heldere oplossing en plaats deze in een nieuwe pre-label buis. Bepaal de concentratie van de DNA fragmenten door UV-spectroscopie (zie Tabel Equipment).
5. Montage Klonen Reaction en Transformatie van de producten in E. coli
<p class = "jove_content"> LET OP: Het doel van deze stap is om 3 te berekenen: 1 verhouding van insert: vector en uitvoeren van de montage reactie.- Gebruik minimaal 100 ng DNA-fragment die de vector backbone of DNA fragment dat de selectiemarker. Bereken de 3-voudige molaire overmaat van de DNA-fragmenten die zullen worden gebruikt als inserts.
- Zetten de molaire-overschot in nodig van elk afzonderlijk insert NG.
OPMERKING: Een handige manier om de berekeningen te doen is om een web-based applicatie te gebruiken (zie tabel van apparatuur). - Meng berekende hoeveelheden DNA-fragmenten in een PCR-buis, het volume tot 10 pi passen. Voeg 10 ul van de GA master mix (2x, zie tabel van Materialen). Incubeer het reactiemengsel bij 50 ° C gedurende 1 uur voor de montage van 4-6 fragmenten of 15 minuten voor de montage 2-3 fragmenten in een PCR thermal cycler.
- Ga verder met de transformatie van de assemblage product in competente E. coli of de producten te bevriezen bij -20° C, totdat het nodig is.
- Volg de transformatie procedure dat de chemische of elektro competente cellen begeleidt. Meestal gebruiken 2 pl van de assemblage reactie per transformatie reactie.
- Na de transformatie compleet, spreid het getransformeerde cellen op agarplaten aangevuld met de selectieve antibioticum.
6. Plasmide isolatie, restrictie-enzymdigestie en sequencing
Opmerking: Het doel van deze stap is om plasmide-DNA uit E. isoleren coli, vervolgens het construct door restrictiedigestie en sequentiebepaling controleren.
- Propageren meerdere afzonderlijke kolonies voor mini preps en plasmide isolatie. Gebruik 2-5 ml overnacht LB vloeibare cultuur aangevuld met een geschikte antibiotica. Isoleer de bijbehorende plasmiden door de procedure die wordt beschreven in de mini-prep kit die wordt gebruikt.
- Bepaal de hoeveelheid en concentratie van de plasmiden verkregen met spectrofotometer.
- Voer restrictiedigestie met één of meer restrictie-endonucleasen naar ~ 0,5 ug van het gezuiverde plasmiden. Met restrictie-enzymen die duidelijk patroon van digestie karakteristiek voor de DNA-constructen.
- Bevestig DNA klonering succes door DNA-sequentiebepaling met gebruikmaking van specifieke primers of standaard. Analyseer de sequencing gegevens juist zijn.
Representative Results
Een werkstroom van het protocol dat werd gevolgd wordt getoond in figuur 2A. We wilden CstF-64 en mutant CstF-64 eiwitten gefuseerd met 3xFLAG-tag onder de expressional regulatie van hEF1α promotor (Figuur 2B en figuur 3) te klonen. Een plasmide dat hEF1α gevolgd door 3xFLAG-tag was niet beschikbaar voor ons. De volgende plasmiden zijn beschikbaar: pcDNA 3.1 myc-His (A, een gulle gift van Michaela Jansen), hEF1α bevattende plasmide (een gulle gift van Mladen Yovchev) en muis CstF-64 plasmiden 12 (figuur 3). De hele reeks voor het construct (s) werd samengesteld met behulp van de nucleotide en tekstredactie toepassingen (figuur 3; zie tabel van apparatuur). Vervolgens wordt de sequentie (s) is gesplitst in vier geschikte stukken (figuur 2B, rode blokken en figuur 3) die overeenkomen met de plasmide DNA's. Versterking primers werden ontworpen met behulp van primer generatie tool (zie tabel van apparatuur) met beperkingen van 4-6 fragmenten met een minimale overlap van 25 nt, opgericht in de "Change Gibson Vergadering Instellingen" pop-up venster. NheI en NotI restrictieplaatsen waren opgenomen in de primer ontwerp voor het identificeren van correct aangebracht plasmiden. Nhel plaats is gelegen in de primer sequentie tussen pcDNA 3.1 en 5 'uiteinde van de hEF1α promoter. Notl plaats bevindt zich na het stopcodon (UGA) van CstF-64 en pcDNA 3.1 vector backbone. Bij gelijktijdige ontsluiting met beide enzymen DNA-fragment dat bestaat uit hEF1α promotor, 3xFLAG en CstF-64 of mutant CstF-64 zal worden vrijgegeven (zie hieronder en figuur 2B). Primers werden besteld in de kleinst mogelijke schaal en ontzout. Het tweede deel van de hEF1α promotor bevat 3xFLAG-tag DNA-fragment (490 bp, Figuur 2B, figuur 3) werd gekocht als een enkele SDNA fragment (enee Tabel van Materialen). DNA-fragmenten gebruikt in de assemblage reactie werden versterkt met behulp van DNA pol (zie tabel van Materialen). DNA-fragmenten van hEF1α promotor deel 1, hEF1α promotor deel 2, volledige lengte en mutante CstF-64 werden tegelijkertijd versterkt in een aparte buizen voor 28 cycli (figuur 4A), naar aanleiding van de aanbevelingen van de leverancier van het DNA pol (zie tabel van Materialen Voor elke cyclus denaturatie was 7 seconden bij 98 ° C, 45 seconden annealing bij 55 ° C, 90 sec verlenging bij 72 ° C). Aanvankelijk werd de pcDNA 3.1 ruggengraat geamplificeerd gedurende 22 cycli (onder dezelfde omstandigheden als hierboven, met uitzondering van de verlengingstijd, die was ingesteld op 3 min bij 72 ° C). De resulterende DNA opbrengst was niet voldoende voor gebruik in een samenstel reactie (Figuur 4A). Daarom werd een extra amplificatie uitgevoerd om voldoende DNA verkregen.
PCR producten te verkrijgened uit een plasmide sjabloon worden gedigereerd met DpnI restrictie-enzym aan het plasmide-DNA, die anders het resulterende samenstel reactieproducten verontreinigen en vals-positief-resistente bacteriële kolonies produceren verwijderen. Daarom werden de PCR producten gedigesteerd met Dpnl restrictie-enzym dat splitst gemethyleerde en hemi-gemethyleerde plasmide-DNA geïsoleerd uit dam + E. coli. PCR producten verkregen met synthetische DNA fragmenten als matrijzen niet te worden geknipt met DpnI sinds chemisch gesynthetiseerde DNA niet gemethyleerd of hemi-gemethyleerde basen bevatten.
DNA-fragmenten werden gezuiverd en geconcentreerd via DNA-zuivering magnetische korrels (zie Tabel Materials) zoals beschreven in het protocol stap 4. De PCRs voor de pcDNA 3.1 vector backbone werden gecombineerd en de hoeveelheid DNA zuivering magnetische kralen gebruikt werd aangepast. De DNA-opbrengst werd bepaaldmet een spectrofotometer (Tabel 1 en Tabel Equipment). Assemblage reacties voor CstF-64 en mutant CstF-64 constructen werden gemonteerd op ijs (tabel 1). Een 3-voudige molaire overmaat van de DNA-fragmenten als "inserts" gebruikt (Tabel 1, Figuur 3). Het eindvolume van de gemengde DNA-fragmenten werd op 10 pl met water en 10 ui samenstel master mix (2x) werd toegevoegd. De reacties werden gemengd en geïncubeerd bij 50 ° C gedurende 1 uur. Positieve controle reactie werd ook gemonteerd volgens de aanbeveling van de GA-kit handleiding en tegelijkertijd geïncubeerd met het CstF-64 en mutant CstF-64 reacties. Zoals aanbevolen in het protocol, werden 2 pi van de elk van de assemblage reacties getransformeerd in de chemisch competente E. coli geleverd met de montage kloneringskit (zie tabel van Materialen). De transformatie werd uitgevoerd zoals beschreven in de kithandleiding. Positieve klonen werden geselecteerd op ampicilline agar / LB platen. 6 kolonies per elke assemblage reactie werden willekeurig geselecteerd om te worden vermeerderd. Plasmide-DNA's werden geïsoleerd met behulp van een plasmide isolatie mini-kit (zie tabel van Materialen). In silico spijsvertering van de constructen met de restrictie-enzymen Nhel en Notl resulteerde in twee fragmenten met een grootte van 4590 bp, 3032 bp voor CstF-64 en 4590 bp, 2711 bp voor mutant CstF-64 (Figuur 2B en Figuur 4B). Knippen met de restrictie-enzymen HindIII en Notl resulteerde in drie fragmenten met de volgende afmetingen: 5872 bp, 1005 bp en 745 bp (CstF-64) en 5872 bp, 1005 bp en 424 bp (mutant CstF-64, Figuur 2B en Figuur 4C). Inderdaad, digestie van het geïsoleerde plasmiden toonde de verwachte karakteristieke patronen (Figuur 4B, C). Merk op dat het 424 bp DNA-fragment geproduceerd door digestie met HindIII en Notl van de CstF-64 mutantplasmiden op Figuur 4C is zwak gekleurd door zijn kleine formaat. 2 van de 6 geïsoleerde plasmiden werden gestuurd voor sequencing. We sequentie de hEF1α promoter en CstF-64 of mutant CstF-64 delen van de constructen te verifiëren dat er geen deleties, inserties of substituties. We sequencing van het DNA-constructen die voortvloeien uit dit of een PCR-gebaseerde protocol sterk aanbevelen. De sequentiebepaling toonde aan dat een van elke sequentie plasmide bevatte de verwachte sequentie regio hEF1α, 3xFLAG-tag en CstF-64 of mutant CstF-64. Elk van de andere plasmiden hadden een puntmutatie die tijdens de amplificatie van de overeenkomstige DNA-fragment. Expressie van het plasmide dat CstF-64 in muis embryonale stamcellen, produceerde overvloedige hoeveelheid exogeen eiwit vergelijkbaar met wildtype expressie 17.
Figuur 1. Schematische weergave van de Gibson Assembly mechanisme. DNA-fragmenten met overlappende uiteinden werden isotherm samengebracht in een enkele continue sequentie. De overlappende uiteinden eerste worden gekauwd terug met 5 'exonuclease, dat is geleidelijk verwarmen geïnactiveerd. Bijgevolg zullen verschillende DNA-fragmenten met overlappende uiteinden isothermisch gloeien. DNA-polymerase zal in de gaten en thermostabiele DNA-ligase ligates de nicks te vullen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. (A) Stroomschema van het protocol beschreven voor montage klonen. (B) Vertegenwoordiging van het plasmide, pGA-CstF-64 gegenereerd met behulp van GA kit Rood - DNA-fragmenten gebruikt in de assemblage reactie:. PcDNA3.1; hEF1α promotor deel 1 (hEF1a - 1); hEF1α promotor deel 2 (hEF1a - 2) besteld als een synthetisch DNA; muis CstF-64 (mCstF-64). Blauw - open reading frames. Violet - virale en niet-virale promotors. Groen -. Splitsing en polyadenylatie regio Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Het ontwerp van de Gibson assemblage CstF-64 plasmide. Zwarte dozen vertegenwoordigen de DNA-fragmenten die beschikbaar zijn voor een enkele Gibson assemblage CstF-64 ontwerpen in silico volgorde waren. Vervolgens werd de sequentie verdeeld in vier DNA delen, die werden geamplificeerd met PCR. Merk op dat als gevolg van geringe omvang van de 3xFLAG-tag de sequentie werd ontworpen als een SDNA samen met de hEF1α pr omoter deel 2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. PCR van de DNA-fragmenten in de klonering reacties en representatieve restrictie-enzymdigestie van de verkregen plasmiden (A) Representatieve PCR middels hot start high-fidelity 2x master mix voor de DNA-fragmenten die bij het opstellen reacties. (B) Representatieve plasmiden van hEF1α, volledige lengte CstF-64, pcDNA 3.1 construct (PGA-CstF-64) en hEF1α, mutant CstF-64, pcDNA 3.1 construct (PGA-mutCstF-64) geknipt met Nhel en Notl. (C) hetzelfde als in B plasmiden geknipt met HindIII en Notl enzymen."_blank"> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Naam van DNA-fragmenten | Verwachte grootte (bp) | Concn. (Ng / ul) | Verdund tot (ng / ul) | ul gebruikt in Georgië CstF-64 van Verwaterde | ul gebruikt in Georgië mutCstF-64, uit Verwaterde | Molverhouding (ins: vec) |
| pcDNA 3.1 (vector) | 4618 | 158 | onverdund | 1 | 1 | |
| hEF1_ promotor deel 1 | 825 | 213 | 75 | 1 | 1 | 3: 1 |
| hEF1_ promotor deel 2 voor CstF-64 | 516 | 229 | 50 | 1 | 3: 1 | |
| CSTF-64 | 1.796 | 161 | onverdund | 1 | 3: 1 | |
| hEF1_ promotor deel 2 voor mutant CstF-64 | 516 | 199 | 50 | 1 | 3: 1 | |
| mutant CstF-64 | 1.448 | 201 | 171 | 1 | 3: 1 |
Tabel 1. Opbrengst van DNA-fragmenten na concentratie op magnetische kralen, verdunning en het opzetten van de assemblage reacties.
Discussion
Succesvol gebruik van GA klonen moet altijd worden voorafgegaan door een zorgvuldig ontwerp van het volledige construct (Figuur 2 en Figuur 3).
Zorgvuldige controle van de primer sequenties ontworpen door de primer generatie tool is ook zeer aan te bevelen. Primers voor GA kunnen worden gegenereerd zonder het gebruik van de primer generatie tool. Echter, het gebruik van het gereedschap is zeer raden omdat vereenvoudigt het proces. In het algemeen moet de primer voor klonering GA twee functioneel verschillende sequenties. De eerste sequentie DNA-fragment specifiek en laat de amplificatie van het fragment met PCR. De tweede sequentie overlapt met de aangrenzende fragment, die nodig is voor GA montage. Een typische DNA-fragment-specifieke sequentie zou 18-22 nt in lengte. DNA fragment specifieke sequenties gebruikt om hetzelfde DNA amplificeren moeten soortgelijke smelttemperaturen en GC-gehalte hebben. Overlappende volgorde moet minstens 15nt in lengte met een smelttemperatuur van ten minste 48 ° C. Het samenstel van meer dan 4 DNA fragmenten overlappende sequentie vereisen ten minste 20 nt is. Langere overlapping zal verhoogde specificiteit van de hybridisatie resulteert in meer correct geassembleerde DNA-fragmenten. Aanbevolen sequenties die scheef in hun GC of AT gehalte ontwikkeling overlappende sequenties, omdat scheve sequenties juiste DNA samenstel gevaar kan brengen vermijden.
We stellen ook gebruikt als een negatieve controle, die geen resistente bacteriële kolonies, alleen het DNA-fragment overeenkomt met de vector backbone in een GA reactie zou veroorzaken. Ook een van de DNA-fragmenten omvattende de "inserts" worden weggelaten uit de GA reactie moet tevens leiden tot niet-resistente bacteriële kolonies. De reden geen kolonies groeien zal het ontbreken van overlappende einden van de aangrenzende DNA-fragmenten, die de montage van een compl zal makenete plasmide.
In het beschreven protocol overlappende sequenties van 25 nt genereren de primer sets gebruikt, omdat het aantal DNA-fragmenten gebruikt (figuur 3). De aanbeveling van de primer generatie tool website (zie tabel van Equipment) is om ten minste 20 nt overlappende sequenties gebruiken om 4 te monteren - 6 DNA-fragmenten. Bovendien langere overlappende sequentie zodat de goede complementatie van de DNA strengen (zie figuur 1) waardoor het aantal nauwkeurig geassembleerde producten.
Momenteel is een aantal systemen voor naadloze klonen zijn beschikbaar. Sommige van deze systemen nog steeds gebruik restrictie-enzymen (bijv Golden Gate klonen 18). Anderen gebruiken eigen mengsels van enzymen gebaseerd op vacciniavirus DNA polymerase en enkelstrengs DNA-bindend eiwit van dezelfde biologische bron 19. Beide systemen zijn beperkt in vergelijking met GA door shorter lengte van overlappende sequenties. Omdat kortere overlappende sequenties niet mogelijk voldoende specificiteit aan gloeistap van aangrenzende DNA-fragmenten, waardoor de correcte assemblage van meer dan 23 DNA-fragmenten problematisch. Deze tekortkomingen zijn niet aanwezig in het GA-systeem.
De grootte van de DNA-fragmenten te amplificeren moeten worden beschouwd om te voorkomen dat het formaat betrouwbaar amplificeerbare met PCR (dwz minder dan 8 kbp lang) overschrijden. Zelfs met de verbeteringen in de werking van DNA-polymerasen in de afgelopen 10 jaar, zullen grote DNA-fragmenten worden geamplificeerd met minder efficiëntie en nauwkeurigheid. Indien nodig, kunnen grotere DNA-fragmenten worden verkregen uit andere bronnen alternatief voor PCR, bijvoorbeeld door plasmide isolatie en geschikte DNA-digestie met restrictie-enzymen. Specifiek voor de in de huidige manuscript beschreven protocol, onze rationeel gebruik van PCR is gebaseerd op de grootte van de beschikbare DNA-fragmenten, die alle minder waren dan5 kbp. Als er meer dan één PCR product geïdentificeerd door agarose gelelektroforese, wordt gel zuivering van het gewenste fragment maat aanbevolen met een van de beschikbare moleculair biologische technieken of geschikte kits. In het huidige protocol een thermostabiele DNA-polymerase wordt gebruikt (zie Tabel van Materialen). Maar elke DNA polymerase verstrekken high fidelity en de opbrengst zal geschikt om te worden gebruikt met dit Protocol. Als high-fidelity DNA polymerase anders dan beschreven in het protocol beschikbaar zijn, gebruiken de set-up voorwaarden zoals beschreven in de betreffende handleidingen. In het huidige protocol, chemisch competente E. coli-cellen worden gebruikt die zijn geleverd met de GA kit. Als alternatief, chemisch of elektro competente E. coli stammen zoals DH5a of DH10B gebruikt worden.
De assemblage klonen 2x master mix is eenvoudig te gebruiken met minimale hands-on tijd. Echter nauwkeurig pipetteren vereist vanwege de kleine volumes needed elkaar te mengen. Goede moleculaire biologie techniek moet worden uitgeoefend op elk moment ook.
De GA klonen biedt onbeperkte mogelijkheden voor een constructie van DNA-fragmenten, plasmiden en vectoren, die langer dan 3 kbp in omvang zijn. Daarnaast heeft een bredere invloed op de synthetische biologie, omdat hiermee synthese en assemblage van bijvoorbeeld een gehele bacteriële (Mycoplasma mycoides) genoom of gist (Saccharomyces cerevisiae) chromosoom 20,21. De techniek is ook toepasbaar op conventionele klonering moet naadloze constructen.
Concluderend, GA klonen biedt een snelle, betrouwbare en flexibele alternatief voor de conventionele DNA klonering procedure.
Acknowledgments
We willen graag Michaela Jansen bedanken aan de Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX en Mladen Yovchev aan de Universiteit van Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA voor de royaal verstrekken pcDNA 3.1 myc-His (A) en hEF1α promotor bevatten plasmiden . Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development van de National Institutes of Health onder award nummer R01HD037109 (CCM). Extra ondersteuning was van de Laura W. Bush Instituut voor Women's Health (CCM en PNG). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
| DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP - PCR Purification system |
| Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
| DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix |
| DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
| NheI | New England BioLabs | R3131S | |
| NotI | New England BioLabs | R3189S | |
| HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
| EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
| NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
| NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |
References
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
- Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
- Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
- Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
- Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
- Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
- Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
- Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
- Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
- Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
- MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
- Sabath, I., et al. 3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
- Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
- Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
- Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing. Nucleic acids research. , (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
- Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
- Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
- Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).
