Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generasjon av Plasmidvektorer Uttrykke FLAG-merket Proteiner Under forordning of Human Forlengelse Factor-1α Arrangøren Bruke Gibson Assembly

Published: February 9, 2015 doi: 10.3791/52235
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center

Abstract

Gibson sammenstilling (GA) kloning gir en hurtig, pålitelig og fleksibelt alternativ til konvensjonelle DNA-kloningsfremgangsmåter. Vi brukte GA til å lage tilpassede plasmider for uttrykk av eksogene gener i mus embryonale stamceller (mESCs). Ekspresjon av eksogene gener under kontroll av SV40 eller human cytomegalovirus promotorer avtar raskt etter transfeksjon inn mESCs. En løsning på dette redusert ekspresjon er å bruke den humane elongeringsfaktor-1 alfa (hEF1α) promotor for å drive genekspresjon. Plasmidvektorer inneholder hEF1α er ikke så lett tilgjengelig som SV40- eller CMV-holdige plasmider, spesielt de også inneholder N-terminale 3xFLAG-tags. Protokollen er beskrevet her er en rask metode for å skape plasmider uttrykker FLAG-merket CstF-64 og CstF-64 mutant under expressional regulering av hEF1α promoter. GA bruker en blanding av DNA-eksonuklease, DNA-polymerase og DNA-ligase for å gjøre kloningen av overlappende ender av DNA-fragmenter som mulig.Basert på malen DNA vi hadde tilgjengelig, designet vi våre konstruksjoner for å settes sammen til en enkelt sekvens. Vår konstruksjon benyttes fire DNA-fragmenter: pcDNA 3.1 vektorryggraden, hEF1α promoter del 1, hEF1α promoter del 2 (som inneholdt 3xFLAG-tag kjøpes som et dobbeltkjedet syntetisk DNA-fragment), og enten CstF-64 eller spesifikk CstF-64-mutant. Sekvensene til disse fragmentene ble lastet opp til en primer generasjon verktøy for å utforme egnede PCR-primere for å generere DNA-fragmenter. Etter PCR, ble DNA-fragmentene blandes med vektoren som inneholder den selektive markør og GA kloning reaksjonen ble satt sammen. Plasmider fra enkelt forvandlet bakteriekolonier ble isolert. Første skjermen av plasmidene ble utført ved restriksjonsspaltning, etterfulgt av sekvensering. I konklusjonen, GA tillatt oss å lage tilpassede plasmider for genuttrykk i fem dager, inkludert konstruere skjermer og verifikasjon.

Introduction

Konvensjonelle DNA-kloningsfremgangsmåter baserer seg på bruk av restriksjonsenzymer for å spalte DNA og DNA-ligase for å slutte seg til DNA-fragmentene sammen. Generering av tilpassede ekspresjonskonstruksjoner som inneholder forskjellige DNA-fragmenter er en sekvensiell prosedyre som innbefatter spalting av DNA med en og / eller flere restriksjonsendonukleaser, og etterfølgende innsetting av DNA-fragmenter ved ligering. Den store ulempen med denne fremgangsmåten er at egnede restriksjonsenzymer for en av de DNA-fragmenter som kan være vanskelig å identifisere (dvs. kan ha flere spaltningsseter) rende vellykket DNA kloning av full-lengde proteinet av interesse umulig. Derfor generasjon av tilpassede uttrykk konstruerer under transkripsjonen regulering av effektiv celletypespesifikke arrangører med tilpassede protein-tags krever svært forsiktig design. Det er også en tids- og arbeidskrevende teknikk. Nylig, flere rapporter beskrevet metoder for å montere multiple forskjellige syntetiske DNA-fragmenter i en kontinuerlig sekvens på samme tid i enten ett- eller to-trinns reaksjoner uten bruk av restriksjonsenzymene 1-3. Den ett-trinns kloning reaksjon (unntatt alle forberedende trinn), avhenger av bruken av en blanding av DNA-eksonuklease, DNA-polymerase, DNA-ligase, 2,3 og de ​​overlappende ender av DNA-fragmenter (figur 1). Siden det er ingen bruk av restriksjonsenzymer, kan DNA-fragmenter av hvilken som helst størrelse og sekvenssammensetning (med unntak av sterkt repeterende sekvenser) smeltes sammen i en sømløs konstruksjon. Nylig, et kommersielt kit (Gibson forsamlingen; GA) for ett-trinns kloning reaksjoner ble tilgjengelig. Dette settet gir rask og kostnadseffektiv montering av eventuelle DNA-fragmenter i en enkelt vektor med tilpassede arrangører og protein tags.

De allment tilgjengelige plasmid ekspresjonsvektorene brukes til å uttrykke eksogene proteiner i pattedyrcellekultur modeller er ofte under transkripsjonen regbefolkningen av viral cytomegalovirus (CMV) eller Simian virus 40 (SV40) arrangører. Disse viruspromotere gir robust forbigående uttrykk for eksogene proteiner i de fleste pattedyrcellekulturbaserte modeller. Imidlertid er generering av cellelinjer som stabilt uttrykker eksogene proteiner ofte mislykket på grunn av transkripsjonen stanse av CMV-SV40-promotere eller under etableringsprosessen 4,5. I tillegg vil SV40 og CMV virale promotorer ikke i tilstrekkelig grad å fremme ekspresjon av eksogene proteiner i celler fra lymfoidlinjen eller embryonale stamceller 6,7. Løsningen på den iboende begrensning av virale promotorer er å anvende sterke konstitutive ikke-virale promotere 8-10. En godt karakterisert sterk konstitutiv ikke-virale promoter av human opprinnelse er elongeringsfaktor 1α (hEF1α) promoter (hEF1α er involvert i katalyse av GTP-avhengig assosiasjon av aminoacyl-tRNA til ribosomer 11). Imidlertidekspresjonsvektorer inneholdende den hEF1α promoteren er ikke så lett tilgjengelig som det virale promoter-inneholdende plasmider, særlig de som også inneholdt 3 x FLAG ved den aminoterminale enden av proteinet av interesse.

Den 64.000 MW spalting stimuleringsfaktor protein (CstF-64) er involvert i den 3 'ende behandling av de fleste mRNA 12,13, inkludert replikasjonsavhengig histonmRNAer 14,15. CstF-64 er uttrykt i alle somatiske vev 12. Sin RNA anerkjennelse motiv binder seg til GU-rike RNA sekvenser på begynnende transkripsjoner nedstrøms cleavage og polyadenyleringssete 16. Denne bindingen av CstF-64 til den pre-mRNA fremmer effektiv endonucleolytic spalting av den gryende karakterutskriften.

Her er en protokoll som er beskrevet som benytter PCR-amplifisering av DNA-fragmenter, i en Gibson montering kloningssett (som inkluderer kjemisk kompetente bakterieceller) produserer tilpassede vektorer av 3xFLAG-merket mOuse CstF-64 eller mutant CstF-64 til deres aminoterminal ende under uttrykk for hEF1α promoter en.

Protocol

1. I Silico Design av Plasmid og generasjon av Overlapp Primere

MERK: Formålet med dette trinnet er å montere fullstendige nukleotidsekvens av konstruksjonen og designe primere for å brukes til å generere fragmenter med overlappende ender for kloning GA.

  1. Utforme en kontinuerlig nukleotidsekvens for å representere den endelige plasmid.
  2. Innhente eller liste de faktiske plasmider og DNA-fragmenter som vil bli brukt som maler i PCR.
    MERK: DNA-fragmenter som ikke er lett tilgjengelig - for eksempel ulike kombinasjoner av koder og arrangører - kan bestilles som en enkelt eller flere syntetiske dobbel-strandet DNA-fragmenter (sDNA). Disse fragmentene er kommersielt tilgjengelig på relativt lave kostnader og kan være opp til 2 kb i lengde (se tabell for material).
  3. Fordel den kontinuerlige nukleotidsekvens av konstruksjonen sammenstilt i trinn 1.1 til DNA-fragmenter som er egnet for PCR. Confirm at fragmentene sams tilgjengelige plasmider og sDNA-fragmenter. Unngå DNA fragmenter mindre enn 200 nt.
  4. Åpne primer generasjons verktøy (se tabell av utstyr). Velg "Set Preferences" -menyen. Velg riktige innstillinger ved å klikke på "ENDRE prefs" kategorien i "Endre Gibson Monterings Settings" pop-up vindu.
    MERK: Primer utforming kan også utføres uten anvendelse av primeren generasjon. Men bruk av primeren generasjons verktøy forenkler prosessen.
  5. Begynne å bygge konstruksjonen ved å velge "Bygg Construct" -menyen. Sett i de splittede DNA-fragmenter i primeren generasjons verktøy sekvensielt fra 5 'til 3' enden.
    MERK: DNA-fragment anvendt som et plasmid ryggrad kan hensiktsmessig deles i to stykker. I den endelige PCR-produkt 5'-enden av denne første fragment og 3'-enden av det siste fragmentet er knyttet sammen i en kontinuerlig DNEt fragment som representerer vektor ryggrad.
  6. Lime det første DNA-fragment som representerer den 5 'ende av vektor-DNA i FASTA format (en tekstbasert representasjon av nukleotidsekvensen) i "Enter Vector eller inn Fragment" pop-up-vindu. Nevne DNA-fragmentet. Velg den riktige måten å få DNA fragment, enten som PCR, RE Digest eller Synthesis. Klikk på "FORTSETT" -kategorien.
  7. Dersom det er behov for å legge til ekstra nukleotider / restriksjonsseter i krysset av den endelige konstruksjonen bruke "Fwd eller Rev primer spacer" klikk på "Legg til et innstikk fragment til forsamlingen" -vinduet. Legge til ekstra nukleotider / restriksjonsseter til bare én av DNA-fragmenter og ikke til begge fragmenter. Klikk på "FERDIG" -kategorien.
  8. Gjenta for alle fragmentene til konstruksjonen er ferdig. Velg "Vis Primere" -menyen og gjennomgå primersekvensene.
  9. Gjenta for alle konstruksjoner (vektor backbones og innsatser), eller for DNA-fragmenter som er annerledes.

2. Forsterkning av DNA fragmenter etter PCR hjelp Hot Start Korrektur DNA Polymerase (2x Master Mix)

MERK: Målet til dette trinnet er å skaffe tilstrekkelig DNA for forsamlingen reaksjon ved hjelp av PCR.

  1. Kjøpe PCR-primerne utformet for i det foregående trinn som avsaltes produkter og på den minst mulige skala. Fortynne dem til 10 uM i vann eller TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 1 mM EDTA).
  2. Kjøpe DNA-fragmenter som ikke er lett tilgjengelig som sDNA fragmenter.
  3. Fortynn alle DNA-fragmenter, inkludert sDNA-fragmenter som vil bli brukt som templater for PCR til 1 ng / mL i vann.
  4. Monter PCR-reaksjonene ved romtemperatur. Kort beskrevet, bruke 2.5 ul (fra 10 mM stamløsning) av hver respektive primer av primer-par, 1 pl (fra 1 ng / mL stamløsning) av templat-DNA-fragment, 25 μl av varmt start korrekturlesing DNA polymerase (DNA pol, 2x mester mix, se tabell of Materials) og 19 mikroliter vann. Bland røret ved forsiktig flicking og samle væskedråper etter kort sentrifugering.
  5. Forsterke samtidig i separate rør DNA-fragmenter av tilsvarende størrelse i henhold til anbefalingene for DNA pol. Utføre 25-28 PCR-sykluser eller bestemme antall sykluser som produserer tilstrekkelig DNA yield.
  6. Kjør 10% av PCR-reaksjonsvolumet (5 ul) på en standard agarose-gelelektroforese farget med etidiumbromid (0,2 mg / ml sluttkonsentrasjon). Sørg for at en enkelt DNA-band som representerer PCR produktet er synlig. Bestemme størrelsen og den relative mengde av de DNA-fragmenter ved hjelp av DNA-molekylvektstandarder. Om nødvendig, gjenta PCR for å oppnå tilstrekkelig mengde DNA-fragmenter.

3. DpnI Fordøyelse av PCR-produktene

MERK: Målet med dette trinnet er å Digest rest plasmid templat DNA fra PCRs i kapittel 2. DpnI vil fordøye plasmid DNA bare hvis det er denaturert, som oppstår til plasmid DNA vokst i dam + bakteriestammer. Derfor ikke behandle med DpnI hvis plasmid DNA vil bli brukt som et DNA-fragment i den GA-reaksjonen.

  1. Tilsett 2 ul av DpnI restriksjonsenzym til 45 pl av PCR-produktene fremstilt i avsnitt 2. Inkuber ved 37 ° C i 1 time. Fortsett med punkt 4 eller fryse ved -20 ° C inntil nødvendig.

4. Rensing og konsentrasjonen av DNA-fragmentene i løpet av DNA-rensing Magnetisk Beads

MERK: Målet med dette trinnet er å rense og konsentrere PCR produkter fremstilt i kapittel 2 og 3. Andre PCR rensemetoder kan brukes i tillegg.

  1. Balanser DNA rensing magnetiske kuler til romtemperatur. Re-suspen perlene av kort virvling.
  2. Overfør PCRs pre-fordøyd with DpnI til et 1,5 ml rør og tilsett 81 ul av DNA-rensing magnetiske kuler til hvert rør. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 10 min.
  3. Plasser røret på den magnetiske kollektoren i ca. 2 min. Kast den klare væske ved hjelp av en pipette. Vask to ganger med 200 ul 80% etanol til 30 sek.
  4. Tillate pelletene å tørke. Holde lokket av rørene åpen, med rørene som er plassert på det magnetiske samleren.
  5. Re-suspen de tørkede perler i 10 pl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Inkuber ved romtemperatur i 2 min. Spinn lett for å samle væsken i bunnen av rørene.
  6. Plasser rørene på magnet samleren for 2 min. Fjern 8,5 til 10 mL av den klare løsningen og legg den i en ny pre-merket rør. Bestemme konsentrasjonen av DNA-fragmentene ved hjelp av UV-spektroskopi (se tabell over Equipment).

5. Montering Cloning Reaction og transformasjon av Produktene i E. coli

<p class = "jove_content"> MERK: Målet til dette trinnet er å beregne 3: 1-forhold mellom innsats: vektor og utfører montering reaksjon.

  1. Bruk minst 100 ng av DNA-fragmentet som representerer vektorryggraden eller DNA-fragment som bærer den selektive markør. Beregn 3-ganger molart overskudd av DNA-fragmentene som skal brukes som omslag.
  2. Konvertere den molare-overskudd i ng nødvendig for hvert enkelt innlegg.
    MERK: En praktisk måte å gjøre beregningene er å bruke en web-basert applikasjon (se tabell av utstyr).
  3. Bland beregnede mengder av DNA-fragmenter i en PCR rør, justere volumet til 10 pl. Tilsett 10 mL av GA mester mix (2x, se tabell for material). Inkuber reaksjonen ved 50 ° C i 1 time for montering av 4 - 6 fragmenter eller 15 min for montering av 2-3-fragmenter i en PCR-thermal cycler.
  4. Fortsett med transformasjon av forsamlingen produktet i kompetente E. coli eller fryse produktene ved -20° C, inntil det er behov.
  5. Flg transformasjonsprosedyren som følger den kjemiske eller elektrokompetente celler. Vanligvis bruker 2 pl av forsamlingen reaksjon per transformasjon reaksjon.
  6. Etter transformasjonen er fullført, spre de transformerte celler på agarplater supplert med passende selektive antibiotikum.

6. Plasmid Isolation, restriksjonsenzymspaltning og Sequencing

MERK: Målet med dette trinnet er å isolere plasmid DNA fra E. coli, og deretter til å bekrefte konstrukt ved restriksjonsspaltning og sekvensering.

  1. Forplante flere enkeltkolonier for mini forbereder og plasmid isolasjon. Bruk 2-5 ml natten LB flytende kultur supplert med passende antibiotika. Isolere de tilsvarende plasmider ved å følge fremgangsmåten som er beskrevet i mini prep kit som brukes.
  2. Bestemme mengden og konsentrasjonen av plasmidene oppnådd ved anvendelse Spectrofotometer.
  3. Utføre restriksjons spaltning med ett eller flere restriksjonsendonukleaser til ~ 0,5 pg av den rensede plasmider. Bruke restriksjonsenzymer som gir tydelig mønster av fordøyelsen karakteristisk for DNA-konstruksjonene.
  4. Bekreft DNA kloning suksess ved DNA-sekvensering ved hjelp av spesifikke eller vanlige primere. Analysere sekvense data for nøyaktighet.

Representative Results

En arbeidsflyt av protokollen som ble fulgt, er vist i figur 2A. Vi ønsket å klone CstF-64 og mutante CstF-64 proteiner smeltet til 3xFLAG-tag under expressional regulering av hEF1α promoter (figur 2B og figur 3). En plasmid som inneholder hEF1α fulgt av 3xFLAG-tag var ikke tilgjengelig for oss. Men følgende plasmider var tilgjengelige: pcDNA 3.1 myc-His (A, en generøs gave fra Michaela Jansen), hEF1α inneholder plasmid (en sjenerøs gave fra Mladen Yovchev) og mus CstF-64 plasmider 12 (figur 3). Hele sekvensen for konstruksjonen (e) ble satt sammen ved hjelp av nukleotid og tekstredigeringsprogrammer (figur 3, se tabell av utstyr). Deretter ble sekvensen (e) delt i fire praktiske stykker (figur 2B, røde blokker og figur 3) som tilsvarer de tilgjengelige plasmid-DNA. Forsterkning primers ble utformet ved hjelp av primer generasjons verktøy (se tabell av utstyr) med begrensninger av 4 - 6 fragmenter med minimal overlapping av 25 nt, satt opp i "Endre Gibson Monterings Settings" pop-up vindu. NheI og Notl-restriksjonssetene ble inkludert i primeren utforming i den hensikt å identifisere korrekt montert plasmider. Nhel området ligger i primersekvensen mellom pcDNA 3.1 og 5 'enden av hEF1α promoteren. NotI området ligger etter stoppcodonet (UGA) av CstF-64 og pcDNA 3.1 vektor ryggrad. Ved samtidig fordøyelse med begge enzymene DNA fragment bestående av hEF1α promoter, 3xFLAG og CstF-64 eller mutant CstF-64 vil bli utgitt (se nedenfor og figur 2B). Primere ble bestilt i minst mulig skala og avsaltet. Den andre delen av hEF1α promoter inneholdende 3xFLAG-tag-DNA-fragment (490 bp, figur 2B, Figur 3) ble innkjøpt som en enkelt sDNA-fragment (ree Table of Materials). DNA-fragmenter som brukes i forsamlingen reaksjon ble forsterket ved hjelp av DNA pol (se tabell for material). DNA-fragmenter av hEF1α promoter del 1, hEF1α promoter del 2, full lengde og mutant CstF-64 ble forsterket samtidig i et eget rør for 28 sykluser (Figur 4A), følge anbefalingene fra leverandøren av DNA pol (se tabell for material For hver syklus denaturering var 7 sek ved 98 ° C, annealing 45 sek ved 55 ° C, forlengelse 90 sek ved 72 ° C). Innledningsvis ble det pcDNA 3.1 ryggrad amplifisert for 22 sykluser (ved hjelp av de samme betingelser som ovenfor, med unntak av forlengelsestiden, som ble satt til 3 minutter ved 72 ° C). Imidlertid, det resulterende DNA-utbyttet var ikke tilstrekkelig til å brukes i en sammenstilling reaksjonen (Figur 4A). Derfor ble en ytterligere forsterkning utføres for å oppnå tilstrekkelig DNA.

PCR produktene innhenteed fra et plasmid som templat må spaltet med DpnI restriksjonsenzym for å fjerne det plasmid-DNA, som ellers ville forurense de resulterende sammenstillingen reaksjonsproduktene og vil produsere falske positive medikament-resistente bakteriekolonier. Derfor, ble PCR-produktene spaltet med DpnI restriksjonsenzym som spalter metylert og hemi-metylert plasmid DNA isolert fra dam + E. coli-stammer. PCR-produkter erholdt ved anvendelse av syntetiske DNA-fragmenter, som maler ikke trenger å bli spaltet med DpnI siden kjemisk syntetisert DNA ikke inneholder metylerte eller hemi-metylert baser.

DNA-fragmentene ble renset og konsentrert i løpet av DNA-rensing magnetiske kuler (se tabell of Materials) som beskrevet i protokollen trinn 4. De PCR for pcDNA 3.1 vektorryggraden ble blandet sammen, og mengden av DNA-rensing magnetiske kuler som ble anvendt ble justert tilsvarende. DNA-utbyttet ble bestemtved hjelp av et spektrofotometer (tabell 1 og tabell av utstyret). Monterings reaksjoner for CstF-64 og mutante CstF-64 konstruksjoner ble montert på is (tabell 1). En 3-gangers molart overskudd av DNA-fragmentene som anses som "inserts" ble benyttet (tabell 1, figur 3). Det endelige volum av den blandede DNA-fragmenter ble justert til 10 ml med vann og 10 pl av sammenstillingen masterblanding (2x) ble tilsatt. Reaksjonene ble blandet og inkubert ved 50 ° C i 1 time. Positiv kontroll reaksjon ble også montert i henhold anbefaling fra GA kit manuell og inkuberes samtidig med CstF-64 og mutante CstF-64 reaksjoner. Som anbefalt i protokollen, ble 2 mL av hver av monterings reaksjoner forvandlet i kjemisk kompetente E. coli leveres med monterings kloning kit (se tabell for material). Transformasjonen ble utført som beskrevet i settethåndboken. Positive kloner ble selektert på ampicillin-agar / LB-plater. 6 kolonier pr hver sammenstilling reaksjonen ble tilfeldig utvalgt for å bli forplantet. Plasmid DNA ble isolert ved anvendelse av et plasmid isolert mini kit (se tabell of Materials). In silico fordøyelse av konstruksjonene med restriksjonsenzymene Nhel og NotI resulterte i to fragmenter med størrelse på 4590 bp, 3032 bp for CstF-64 og 4590 bp, 2711 bp for mutant CstF-64 (figur 2B og 4B). Fordøyelse med restriksjonsenzymene HindIII og NotI resulterte i tre fragmenter med følgende størrelser: 5872 bp, 1005 bp, og 745 bp (CstF-64) og 5872 bp, 1005 bp, og 424 bp (mutant CstF-64, figur 2B og Figur 4C). Faktisk fordøyelse av de isolerte plasmider viste de forventede karakteristiske mønstre (figur 4B, C). Legg merke til at det 424 bp DNA-fragment produsert ved fordøyelse med Hindlll og NotI for CstF-64-mutantplasmider på Figur 4C er svakt farget på grunn av sin lille størrelse. 2 av de 6 isolerte plasmider ble sendt til sekvensering. Vi sekvensert hEF1α promoter, og CstF-64 eller mutant CstF-64 deler av konstruksjoner for å kontrollere at det ikke er noen slettinger, innskudd eller erstatninger. Vi anbefaler sekvensering av DNA-konstruksjonene som følge av dette eller noen PCR-basert protokoll. Sekvenseringen viste at en av hver sekvensert plasmid inneholdt den forventede sekvens i området av hEF1α, 3xFLAG-tag og CstF-64 eller mutant CstF-64. Hver av de andre plasmider hadde en punktmutasjon introdusert i løpet av amplifisering av det tilsvarende DNA-fragmentet. Ekspresjon av plasmid inneholdende CstF-64 i mus embryonale stamceller, som produseres rikelig mengde eksogent protein sammenlignes med villtype-ekspresjon 17.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk representasjon av Gibson Assembly mekanismen. DNA-fragmenter med overlappende ender ble isotermisk samlet i en enkelt kontinuerlig sekvens. De overlappende endene først blir tygget tilbake ved 5 'eksonuklease, som er gradvis varmeinaktivert. Følgelig vil forskjellige DNA-fragmenter med overlappende ender anneal isotermisk. DNA polymerase vil fylle i hullene og termostabile DNA ligase ligates de kutt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2 (A) Flytskjema av protokollen beskrevet for montering kloning. (B) Representasjon av plasmidet, PGA-CstF-64 generert ved hjelp GA kit Red - DNA-fragmenter som brukes i forsamlingen reaksjon:. PcDNA3.1; hEF1α promoter del 1 (hEF1a - 1); hEF1α promoter del 2 (hEF1a - 2) organisert som et syntetisk DNA; mus CstF-64 (mCstF-64). Blå - åpne leserammer. Fiolett - viral og ikke-virale arrangører. Green -. Cleavage og polyadenylerings regioner Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Design av Gibson forsamlingen CstF-64 plasmid. Svart bokser viser DNA-fragmenter som var tilgjengelige for å designe et enkelt Gibson montering CstF-64 i silico sekvens. Deretter ble sekvensen delt i fire DNA-stykker, som ble amplifisert ved hjelp av PCR. Legg merke til at på grunn av liten størrelse 3xFLAG-tag sekvensen var utformet som en sDNA sammen med hEF1α pr omoter del 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. PCR av de DNA-fragmenter som brukes i kloningsreaksjoner og representative restriksjonsenzym-kutting av plasmidene erholdt (A) Representative PCR ved bruk av varme begynner hi-fi-2x konsentrat-blanding av DNA-fragmentene som benyttes i monterings reaksjoner:. (B) Representative plasmider av hEF1α, full lengde CstF-64, pcDNA 3.1 konstruksjon (PGA-CstF-64) og hEF1α, mutant CstF-64, pcDNA 3.1 konstruksjon (PGA-mutCstF-64) fordøyd med NheI og NotI. (C) de samme plasmider som i B spaltet med Hindlll og Notl-enzymer."_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Navn av DNA-fragmenter Forventet størrelse (bp) Dvs. valget. (Ng / mL) Fortynnet til (ng / mL) mL brukes i GA CstF-64 fra Fortynnet mL brukes i GA mutCstF-64, fra Fortynnet Molarforhold (ins: VEC)
pcDNA 3.1 (vektor) 4618 158 ufortynnet 1 1
hEF1_ promoter del 1 825 213 75 1 1 3: 1
hEF1_ promoter del 2 for CstF-64 516 229 50 1 3: 1
Cstf-64 1796 161 ufortynnet 1 3: 1
hEF1_ promoter del 2 for mutant CstF-64 516 199 50 1 3: 1
mutant CstF-64 1448 201 171 1 3: 1

Tabell 1. Utbytte av DNA-fragmenter etter konsentrasjon på magnetiske kuler, fortynning og satt opp av monterings reaksjoner.

Discussion

Vellykket bruk av GA kloning bør alltid innledes med en omhyggelig konstruksjon av den komplette konstruksjonen (figur 2 og figur 3).

Forsiktig verifisering av primersekvensene designet av primer generasjons verktøy er også sterkt anbefalt. Primere for GA kan genereres uten anvendelse av primeren generasjon. Imidlertid er bruk av verktøyet anbefaler, fordi det forenkler prosessen. Generelt må primeren for GA kloning har to funksjonelt forskjellige sekvenser. Den første sekvensen er DNA-fragment-spesifikke, og tillater amplifikasjon av fragmentet ved hjelp av PCR. Den andre sekvensen overlapper den tilstøtende fragment, noe som er nødvendig for montering GA. En typisk DNA-fragment-spesifikk sekvens ville være 18 til 22 nt lange. DNA-fragmentet spesifikke sekvenser som benyttes for å amplifisere den samme DNA må ha tilsvarende smeltetemperaturer og GC-innhold. Overlappende sekvens bør være minst 15nt i lengde, med en smeltetemperatur på minst 48 ° C. Monteringen av mer enn fire DNA-fragmenter vil kreve den overlappende sekvens for å være minst 20 nt. Lengre overlapp vil tillate økt spesifisitet av annealing resulterer i mer riktig sammensatte DNA-fragmenter. Det anbefales å unngå sekvenser som er skjeve i sin GC eller AT innhold i utviklingen av overlappende sekvenser, fordi skjeve sekvenser kan kompromittere skikkelig DNA montering.

Vi foreslår også anvendelse som en negativ kontroll som ikke skal gi noen medikament-resistente bakteriekolonier, bare DNA-fragment som tilsvarer vektoren ryggraden i en GA reaksjon. Alternativt kan en av de DNA-fragmenter som omfatter de "inserts" kan utelates fra GA reaksjon, som også bør resultere i ingen medikamentresistente bakteriekolonier. Grunnen ingen kolonier vokser vil være mangel på overlappende ender av de tilstøtende DNA-fragmenter, som vil gjøre monteringen av en komplete plasmid.

I den protokoll som er beskrevet, overlappende sekvenser av 25 nt for å generere primersett ble anvendt, på grunn av antallet av DNA-fragmenter som brukes (figur 3). Anbefaling av primer generasjons verktøy hjemmeside (se tabell av utstyr) er å bruke minst 20 nt overlappende sekvenser for å montere 4 - 6 DNA-fragmenter. I tillegg lengre overlappende sekvens vil sikre riktig komplementering av DNA-trådene (se figur 1) å øke antall nøyaktig sammensatte produkter.

For tiden er en rekke systemer for sømløs kloning er tilgjengelig. Men noen av disse systemene fortsatt bruke restriksjonsenzymer (dvs. Golden Gate kloning 18). Andre bruker proprietære blandinger av enzymer basert på vaccinia virus-DNA-polymerase, og enkeltkjedet DNA-bindende protein fra den samme biologiske kilden 19. Begge systemene er begrenset i forhold til Ga ved shorter lengde av overlappende sekvenser. Fordi kortere overlappende sekvenser som ikke kan tilveiebringe tilstrekkelig spesifisitet til glødetrinn av tilstøtende DNA-fragmenter, hvilket gjør den riktige montering av mer enn 23 DNA-fragmenter problematiske. Disse manglene ikke er til stede i GA-systemet.

Størrelsen på DNA-fragmenter som skal forsterkes bør også vurderes, slik at den ikke overskrider størrelsen på en pålitelig forøkbare ved PCR (dvs. mindre enn 8 kbp i lengde). Selv med forbedringene i funksjon av DNA polymeraser i de siste 10 årene, vil store DNA-fragmenter bli forsterket med mindre effektivitet og nøyaktighet. Om nødvendig kan større DNA-fragmenter oppnås fra andre kilder alternativ til PCR, for eksempel, ved å plasmid isolert og passende DNA-spaltning med restriksjonsenzymer. Nærmere bestemt, for protokollen som er beskrevet i den aktuelle manuskript, vår rasjonelt å bruke PCR ble basert på størrelsen av de tilgjengelige DNA-fragmenter, som alle var mindre enn5 kbp. Hvis det er mer enn én PCR-produkt identifisert ved agarosegel-elektroforese, er gelrensing av det ønskelige fragmentstørrelse anbefales å bruke en hvilken som helst av de tilgjengelige molekylære biologiske teknikker eller egnede kits. I den nåværende protokoll en termostabil DNA polymerase er (se tabell of Materials) anvendt. Men noen DNA polymerase gir høy nøyaktighet og utbyttet vil være egnet til å brukes med denne protokollen. Hvis high-fidelity DNA polymeraser annerledes enn beskrevet i protokollen er tilgjengelig, bruker de satt opp forhold som er beskrevet i de respektive håndbøkene. I den aktuelle protokoll, kjemisk kompetent E. coli-celler er brukt som følger med GA kit. Alternativt, kjemisk eller elektro kompetente E. coli-stammer så som DH5a eller DH10B kan benyttes.

Forsamlingen kloning 2x mester mix er enkel å bruke med minimal hands-on tid. Imidlertid er nøyaktig pipettering nødvendig på grunn av de små volumene neerD cEDED som skal blandes sammen. God molekylærbiologi teknikk må utøves til enhver tid også.

GA kloning gir ubegrensede muligheter for konstruksjon av DNA-fragmenter, plasmider og vektorer, som er lengre enn 3 kbp i størrelse. I tillegg har det en bredere innvirkning på området syntetisk biologi, fordi det tillater syntese og montering av for eksempel en hel bakterie (Mycoplasma mycoides) genom, eller en gjær (Saccharomyces cerevisiae) kromosom 20,21. Teknikken kan også anvendes på konvensjonell kloning behov for å generere sømløse konstruksjoner.

Som konklusjon, GA kloning tilbyr rask, pålitelig og fleksibelt alternativ til den konvensjonelle DNA-kloningsprosedyren.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Michaela Jansen ved Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX og Mladen Yovchev ved University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA for sjenerøst gi pcDNA 3.1 myc-His (A) og hEF1α promoter inneholder plasmider . Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development av National Institutes of Health i henhold til pris nummer R01HD037109 (til CCM). Ytterligere støtte var fra Laura W. Bush Institute for kvinners helse (til CCM og PNG). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) Integrated DNA Technologies We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.
DNA purification magnetic beads Beckman Coulter A63880 Agencourt AMPure XP - PCR Purification system
Plasmid Isolation Mini Kit Omega Bio-Tek Inc D6942-01 E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I
Gibson Assembly Cloning Kit New England BioLabs E5510S
DNA polymerase New England BioLabs M0494S Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix
DpnI New England BioLabs R0176S
NheI New England BioLabs R3131S
NotI New England BioLabs R3189S
HindIII New England BioLabs R3104S
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop device
EditSeq DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
SeqBuilder DNASTAR Part of Lasergene Core Suite
Word Microsoft Part of Microsoft Office
NEBuilder New England BioLabs primer generation tool: http://nebuilder.neb.com
NEBioCalculator New England BioLabs ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
  2. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
  3. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
  4. Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
  5. Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
  6. Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
  7. Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
  8. Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
  9. Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
  10. Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
  11. Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
  12. Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
  13. MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
  14. Sabath, I., et al. 3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
  15. Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
  16. Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
  17. Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing. Nucleic acids research. , (2014).
  18. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
  19. Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
  20. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
  21. Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).

Tags

Molecular Biology menneskelig EF1α promoter SV40 promoter CMV promoter Gibson montering embryonale stamceller protein uttrykk FLAG-tag syntetisk biologi
Generasjon av Plasmidvektorer Uttrykke FLAG-merket Proteiner Under forordning of Human Forlengelse Factor-1α Arrangøren Bruke Gibson Assembly
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C.… More

Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1α Promoter Using Gibson Assembly. J. Vis. Exp. (96), e52235, doi:10.3791/52235 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter