Medicine

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

Published: January 23, 2015 doi: 10.3791/52247

Peter D. Westenskow^1,2, Toshihide Kurihara¹, Stephen Bravo¹, Daniel Feitelberg¹, Zack A. Sedillo², Edith Aguilar¹, Martin Friedlander^1,2

¹Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Lowy Medical Research Institute

Abstract

전기 자극으로 광 변환 외측 망막에서 발생 콘로드와 감광체와 망막 색소 상피 (RPE) 세포에 의해 주로 수행된다. RPE는 감광체 및 사망 또는 RPE 세포의 기능 장애 연령 관련 황반 변성 (AMD), 명 55 세 이상에서 영구 실명의 주요 원인의 중요 특성 인 지원을 제공한다. AMD에 대한 치료법이 발견되지 않은 반면, 병변 RPE 건강한 눈 주입은 효과적인 치료를 증명할 수 있고, RPE 세포의 다수 용이 다 능성 줄기 세포로부터 생성 될 수있다. RPE 세포 전달의 안전성과 효능에 관한 몇 가지 흥미로운 질문 여전히 동물 모델에서 시험 될 수 있고, RPE를 주입하기 위해 사용되는 잘 용인 프로토콜이 개발되었다. 여기에 기재된 기술은 다양한 여러 연구 그룹에 의해 사용 된과 제 날카로운 바늘의 눈 구멍을 만드는 것을 포함한다. 블루와 다음 주사기세포로드 NT 바늘 구멍을 통해 삽입하고 부드럽게 RPE에 닿을 때까지 유리체를 통과한다. 비교적 간단하며 최소한의 설비를 필요이 주입 방법을 사용하여, 우리는 동물 모델에서 광 수용체 변성증의 상당량을 방지 호스트 RPE 사이에서 줄기 세포 유래 RPE 세포를 효율적이고 일관성있게 통합을 달성. 실제 프로토콜의 일부 있지만, 우리는 또한 주입하는 방법과 세포가 생체 내 이미징을에 사용하여 망막 하 공간에 주입되었는지 확인하는 방법에 의해 유도 된 외상의 범위를 결정하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로,이 프로토콜의 사용은 RPE 세포에 한정되지 않는다; 이는 망막 하 공간에 임의의 화합물 또는 세포를 주입하는 데에 이용 될 수있다.

Protocol

참고 : 모든 동물이 스크립스 연구소에 의해 설립 된 윤리 지침에 따라 처리 하였다.

사출 용 재료 1. 준비 (~ 20 분)

사전 따뜻한 세포 분리 솔루션 (바람직하게는 혈청 희석을 통해 비활성화되어 하나), 멸균 PBS, 문화 미디어 (표 1).
그것을 분해하고 15 분 동안 물에 부품을 끓여 무딘 바늘과 주사기를 소독.

사출에 대한 RPE 세포의 2. 준비 (~ 30 분 내지 1)

37 ℃에서 5-8 분 동안 예열 세포 분리 용액을 사용하여 RPE 세포를 분리.
여전히 연결되어 있는지 어떤을 해제 부드럽게 세포를 긁어.
배양액 대용량 (15ml의 튜브를 기입) 해리 용액을 비활성화하고 카운트하기로 세포를 희석.
펠릿 세포 5 분 동안 800 XG에 원심 분리기.
멸균 미리 예열 PBS에서 / μL 200,000 세포 (0.5 μL 볼륨에서 10 만 셀을 제공하기 위해)에서 세포를 재현 탁하고 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로 전송합니다.
선택적으로, 살아있는 세포 과도 형광 마커를 추가하고 30 ~ 45 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
세포의 0.5 μL와 무딘 바늘과 주사기를로드합니다. 가능한 빨리 세포 주입한다.

3. 하위 망막 사출 (~ 사출 당 5 분)

참고 : 가능하면 윤부 선박 시각화 훨씬 용이하기 때문에, 성인 흰쥐와 기술을 배웁니다. 보다 쉽게 주사 부위의 시각화를 용이하게하기 위해 (세포를 주입하기 전에) 배울 때 빠른 그린 용액을 주입한다.

쥐를 마취. 100 ㎎ / ㎖ 케타민 10 ㎎ / ㎖ 자일 라진 (xylazine) (20 μL / 10g 본체 w의 복강 내 주사를 사용하여이소 플루오 란 흡입을 통해 여덟)는 설치류를 기동 흡입기의 주둥이와 눈에 주입하기 어렵 기 때문에.
1. 동물 깊이 그것의 발 중 하나를 집어 마취되어 있는지 확인합니다. 이 flinches 경우, 몇 분 이상 기다린 후 망막 주입을 시작하기 전에 다시 시도하십시오.
주입되는 눈이 천장을 향하도록 옆에 쥐를 놓습니다.
눈 소켓 (임시 안구 돌출)에서 튕겨 나올 그냥 귀 위의 턱으로 가볍게 눈꺼풀에 피부 평행 스트레칭 두 손가락으로 머리를 잡고 더 접근하기가되도록 해부 현미경 부드럽게 피부를 스트레칭 그래서 눈이 약간 소켓에서 팝업됩니다 (그림 1C 참조). 목에 너무 가까이 쥐를 잡지 마십시오.
30 G 날카로운 일회용 사전 멸균 바늘, 선박이 충돌하는 경우, 출혈입니다 b (즉시 윤부 아래에 구멍을중요한 전자와 나중에 구멍을 찾기 어려울 수)과 각도로 바늘 (그림 1D)으로 렌즈에 손이 닿지 않도록. 발생 날카로운 (또는 무딘) 바늘 또는 즉시 백내장으로 렌즈를 만지지 마십시오.
참고 : 주사는 두 사람이 잘 작동. 이런 식으로 한 사람은 구멍이 어디에 초점을 유지하기 위해 날카로운 일회용 바늘로 첫 번째 구멍을 만든 후 주입 작업을하는 사람이 무딘 바늘 주사기를 전달할 수 있습니다.
머리에 그립을 유지하면서 눈에서 일회용 날카로운 바늘을 집어 넣으십시오. 구멍이 정확히 기억하십시오.
중 미세 조작기에 무딘 바늘로 사전로드 된 주사기를 장착하거나 손을 잡고, 렌즈를 만지지 조심스럽게 눈을 통해 밀어 다시는주의하면서 구멍을 통해 무딘 바늘 주사기의 끝 부분을 삽입 한 후 아주 부드럽게 느낌 저항 (그림 1D)까지.
케이최소한으로 모든 움직임을 eeping, 조심스럽게 천천히 망막 하 공간에 RPE 세포를 주입.
참고 : RPE / 망막 박리가 유도 될 것이다; 이 불가피하다. 그러나, 청소기 주입 박리를 최소화 크게 재 부착 (도 1E)의 기회를 향상시킨다. 모든 과장된 움직임은 망막에 다시 바늘을 이동 할 수 있으며, 옆으로 움직임이 망막에 손상을 줄 수 있습니다. 분사 펌프의 사용은 선택적이지만, 매우 정확한 전달을 허용한다.
천천히 주사기를 집어 넣으십시오. 눈 보습을 적용하는 것은 수화 눈을 떼지 삭제합니다.
이 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지 동물을 모니터링하기 위해 계속합니다. 무인 동물을 떠나거나 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지 다른 경고 동물 케이지에 반환하지 않습니다.

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Representative Results

우리는이 논문에서 기재된 기술을 사용하여 신속하고 지속적으로 설치류 망막 하 공간 내로 RPE 세포의 현탁액을 제공 할 수있다. 필요한 것은 아니지만, 외상은 크게 그림 1A & B의 미세 조작기와 같은 설정을 사용하여 최소화 할 수 있습니다. 일시적인 안구 돌출 그림 1C에서와 같이 쥐를 잡으십시오. 미세 조작기 또는 손에 의해 수행되는 경우에 단계는 동일; 이 그림 1D의 만화에 묘사되어있다. 표지 RPE 세포로부터 완전히 수행하면 형광 cSLO과의 OCT 시스템 (도 2)를 사용하여 알 수있는 유도 망막 박리를 이용하여 검출 될 수있다. 그림 3에서 cSLO은 (망막 주입 후 즉시 캡처 한 그림 2와 그림 3에서 이미지) 여러 전체 주사 부위 주변의 이미지를 캡처하는 데 사용되었다. m은 박리 참고중앙 이미지 (3-5)의 심오한 (하지만 심한 경우도 있음) OST.

그림 1. 망막 주입 플랫폼 및 사출 기술의 만화 묘사입니다. (A) 홀은 해부 현미경을 부착하는 금속 플레이트에 드릴 하였다. (B) 자기 스탠드에 미세 조작기가와 주사하는 동안 위치에서 이동 될 수 있습니다. (C) 설치류를 잡아 일시적인 안구 돌출에 대한 그림과 같이. ( 눈의 키 구조 D) 묘사 (D;. 구멍이 바로 윤부와 렌즈 아래에 날카로운 일회용 바늘로 눈 제조) 3.4 단계 (D;. 3.6 단계) 무딘 바늘 구멍에 삽입 와 정반대의 망막을 통해 부드럽게 RPE을 터치 할 때까지 (D; 단계 3.8)가. 세포의 주입 임시 RET을 유도원고 판 분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 안저 이미지는 망막 주사 후 직접 촬영. (A) 우측 패널 (IR 및 FAF 영상 오버레이)에서 관찰 된 녹색 형광 (B) 신경 망막의 망막 박리. 과도 형광 마커로 표지 만능-RPE 세포로부터 방출되고, RPE는 주입 근처 관찰 (화살표 표시) 망막 주사 후 사이트. (A)의 별표는 시신경 레이블. (이 수치는 KROHNE 등의 원본 형식으로 게시되고있다. ²¹⁾ 스케일 바 = 200 μm의 시간을 클릭 해주세요감수는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 3
우리는 주사 부위 주변에 다수의 이미지를 캡처 할 수의 OCT 장치를 사용하여 직접 주사 후 주사 부위 주위 OCT를 사용하여 생체 내 이미징. 그림 3은 박리의 주입 및 범위의 효율성을 모두 결정한다. 이 예 최소한의 분리에서 관찰된다 (이미지 3-5 특히 부종으로 간주). 스케일 바 = 200 μm의

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Discussion

이 문서에서 우리는 쥐와 생쥐에서 부유 망막 색소 상피 세포의 망막 주사를 수행하기위한 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 적은 외상에 번역 할 기술로 쉽게 배울 수 많은 경험이다 (그림 3, 이것은 더 나은 주사 중 하나를 나타냅니다) 미세 조작기는 (그림 1A)를 사용하는 경우에는 특히. 모든 외상은 cSLO 간섭 단층 시스템 (그림 2) 가능한 경우와 생체 내에서 모니터링 할 수 있습니다. 해상도가 높고 잡음이 적은 화상이 요구되는 경우, 당해 촬상 플랫폼 상태 뮤린 질병 모델에서 ^39-41 OCT를 행하는 우수한 프로토콜과 함께 사용 가능하다.

이 기술과 관련된 가장 흔한 합병증은 맥락막 출혈을 야기 과도한 망막 박리를 유도, 수술 중에 동물의 부적절한 위치에서 발생하고, 바늘에서 RPE 세포의 환류. 위치하는 경우부적절하게, 제 구멍을 만드는 어려운 것, 심지어 어렵게 후 그것을 찾을. 눈의 이동하는 것은 산술적으로 불가능 무딘 바늘로 침투하고, 구멍을 모호하게 할 수있다. 그것은 날카로운 바늘로 다른 구멍을 만들 수 있지만,이 더 외상을 만듭니다. 발음 망막 박리는 심한 시력 상실을 초래할 수 있습니다. 박리는 망막 신경 세포와 아교 세포의 특성을 형태 학적 변화를 유도; 반응성 신경교 증 및 망막 리모델링의 이러한 조합은 광 수용체 세포 사멸 ^(42)를 홍보 할 수 있습니다. 너무 많은 압력이 무딘 팁 주사기가인가되면 마지막으로, 맥락막 출혈이 발생 될 수있다. 너무 많은 압력이 적용되는 경우 이러한 경우가 드물지만, RPE 발생할 수 있습니다 부르크 막과 일부 만능 줄기-RPE의 돌파구, 맥락막에서 관찰 할 수있다. 망막 유리체 내에 주입 RPE 세포의 역류성 더 자주 발생하고 피하기 어렵다. 이것은 syrin 후퇴함으로써 최소화 될 수있다GE는 주입 후 아주 천천히 무딘 바늘로 (이 점에서 미세 조작기는 매우 유용합니다).

현장에서 사용되는 다른 기술은보다 정교하지만 (검토를 위해 Ramsden 등. ^{30 참조)} 또한 훨씬 더 많은 도전이다. 그것은 공막, 맥락막, 및 RPE를 통해 반대 방향으로 날카로운 바늘을 삽입하여 망막 하 공간 내로 현탁액 중의 세포를 주입하는 것이 가능하다. 이 기술은 훨씬 더 많은 연습과 전문 지식을 필요로; 마스터까지, 망막 색소 상피 세포의 대부분은 맥락막 또는 망막에 주입하고, 망막 공간으로 통합하지됩니다. (또한, 눈의 제한된 액세스로 인해이 방법은 인간 환자에 사용하기에 적합하지 않다.) 그것은 편광 RPE ^(43)의 단층을 그대로 이식하는 것도 가능하다. 이 슬릿을 망막 아래, 또는 인공 다공성 기판과 insertin에 세포를 성장시킴으로써 RPE 세포 시트를 줄이기로 이루어진다망막 하 공간에 g 모두 세포와 보철. 이러한 기술의 이점은 RPE 세포에 주입 "repolarize"하지 않아도 명백하며, 망막 탈출 RPE 세포의 색소 분야의 형성 가능성은 크게 ^16,44을 회피 할 수있다. 그러나 이러한 수술 기법은 본질적 더욱 복잡하다. 또한, 인간, RPE와 보철 레이저 소작되어야 슬릿을 황반 밑에 삽입 될 필요가있을 것이다. 이 괴사 된 지역 주변 망막 변성 발생합니다.

여기에 설명 된 프로토콜을 사용하는 장점은, 신뢰성을 수행 배우기 쉽고, 그리고 RPE 외에 다른 화합물 또는 세포를 제공하기 위해 이용 될 수 될 수 있다는 것이다. 또한, (세포를 전달하는 무딘 바늘보다는 날카로운 바늘을 사용하여) 약간의 수정이 같은 기술은 강내 세포 또는 약물을 전달하기 위해 사용될 수있다. 우리이 기술로 일관된 결과를 chieve, 경험을 통해 생체 내 이미징 모니터링을 통해 기술과 관련된 외상을 최소화하기 위해 배웠습니다.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1