Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Abstract

La conversione della luce in impulsi elettrici avviene nella retina esterna e si realizza in gran parte da coni e bastoncelli fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) cellule. RPE fornisce il supporto critico per fotorecettori e la morte o la disfunzione delle cellule RPE è caratteristico di età degenerazione maculare (AMD), la principale causa di perdita permanente della vista nelle persone 55 anni in su. Mentre è stato identificato alcuna cura per AMD, l'impianto di RPE sana in occhi malati potrebbe rivelarsi essere un trattamento efficace, e un gran numero di cellule RPE può essere facilmente generato da cellule staminali pluripotenti. Molte domande interessanti per quanto riguarda la sicurezza e l'efficacia della consegna delle cellule RPE possono ancora essere esaminate in modelli animali, e sono stati sviluppati protocolli ben accettate utilizzati per iniettare RPE. La tecnica qui descritta è stata utilizzata da più gruppi in vari studi e implica prima la creazione di un foro in un occhio con un ago tagliente. Poi una siringa con un blunt ago caricato con cellule viene inserito attraverso il foro e attraverso il vitreo fino a toccare delicatamente il RPE. Usando questo metodo di iniezione, che è relativamente semplice e non richiede attrezzatura minima, otteniamo integrazione coerente ed efficiente di cellule RPE cellule staminali derivate tra RPE host che impedisce quantità significativa di fotorecettori degenerazione in modelli animali. Pur non parte del protocollo attuale, abbiamo anche descritto come determinare l'entità del trauma indotto dall'iniezione, e come verificare che le cellule sono state iniettate nello spazio sottoretinico usando modalità di imaging in vivo. Infine, l'uso di questo protocollo non è limitato alle cellule RPE; può essere utilizzato per iniettare qualsiasi composto o cella nello spazio sottoretinico.

Protocol

NOTA: Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida etiche stabilite dalla Scripps Research Institute.

1. Preparazione di materiali per l'iniezione (~ 20 min)

1. Soluzione dissociazione cellulare Pre-caldo (preferibilmente uno che è inattivato tramite diluizione, non con siero), PBS sterile, e mezzi di coltura (Tabella 1).
2. Sterilizzare la siringa con un ago smussato smontando e bollendo le parti in acqua per 15 min.

2. Preparazione delle cellule RPE per iniezione (~ 30 minuti a 1 ora)

1. Staccare le cellule RPE utilizzando soluzione dissociazione delle cellule pre-riscaldato per 5-8 minuti a 37 ° C.
2. Raschiare le cellule delicatamente per rilasciare qualsiasi che sono ancora attaccato.
3. Diluire le cellule con un grande volume di coltura (riempire una provetta da 15 ml) per inattivare la soluzione di dissociazione e contarli.
4. Centrifugare a 800 xg per 5 minuti per far sedimentare le cellule.
5. Risospendere le cellule a 200.000 cellule / microlitro (per fornire 100.000 cellule in un volume di 0,5 ml) in PBS sterile preriscaldata e trasferirli in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
6. Facoltativamente, aggiungere un marcatore fluorescente transitoria cellule vive e incubare a 37 ° C per 30-45 min.
7. Caricare la siringa con un ago senza punta con 0,5 ml di cellule. Iniettare le cellule appena possibile.

3. Sub-retinica Injection (~ 5 min per iniezione)

NOTA: Se possibile, imparare la tecnica con ratti albini adulti, poiché le imbarcazioni limbus sono molto più facili da visualizzare. Iniettare veloce soluzione verde quando l'apprendimento (prima di tentare di iniettare le cellule) per agevolare più facilmente la visualizzazione del sito di iniezione.

1. Anestetizzare il roditore. Utilizzare iniezioni intraperitoneali di 100 mg / ml ketamina e 10 mg / ml xilazina (20 microlitri / 10 g corpo wotto) su inalazione isofluorano poiché è difficile da manovrare il roditore e iniettare nell'occhio col muso nella inalatore.
   1. Assicurarsi che l'animale è profondamente anestetizzato pizzicando una delle sue zampe. Se indietreggia, attendere alcuni minuti e riprovare prima di iniziare l'iniezione sottoretinico.
2. Posizionare il roditore su un lato in modo che l'occhio che verrà iniettata è rivolto verso il soffitto.
3. Sotto un microscopio da dissezione allungare delicatamente la pelle così l'occhio si apre un po 'fuori dal socket (proptosi temporaneo) e diventa più accessibile tenendo la testa con due dita appena sopra l'orecchio e per la sua mascella e allungare delicatamente la pelle parallela alle palpebre in modo che l'occhio si apre un po 'fuori dal socket (Vedi Figura 1C). Non afferrare il roditore troppo vicino alla gola.
4. Con un forte ago pre-sterilizzato monouso 30 G, fare un buco immediatamente sotto il limbus (se le navi sono colpiti, sanguinamento si ball'e significativo e che sia difficile trovare il foro di seguito) e un angolo per evitare di toccare la lente con l'ago (Figura 1D). Evitare di toccare l'obiettivo con l'ago affilato (o spuntato) o immediata formazione di cataratta si verificherà.
   NOTA: Le iniezioni funzionano meglio con due persone. In questo modo una persona può passare la siringa con l'ago smussato alla persona che esegue l'iniezione dopo aver creato il primo foro con l'ago monouso affilato per mantenere la concentrazione sul dove il foro.
5. Allontanare l'ago appuntito monouso dall'occhio mantenendo la presa sulla testa. Ricorda esattamente dove il buco è.
6. Dopo il montaggio o la siringa pre-caricato con un ago senza punta su un micromanipolatore o tenendolo per mano, inserire la punta della siringa con l'ago senza punta attraverso il foro, prendendo di nuovo attenzione a non toccare l'obiettivo e spingere delicatamente attraverso l'occhio molto delicatamente fino a sentire resistenza (Figura 1D).
7. Keeping tutti i movimenti al minimo, iniettare attentamente le cellule RPE lentamente nello spazio sottoretinico.
   NOTA: il distacco RPE / retina sarà indotta; questo è inevitabile. Tuttavia, una iniezione di detergente minimizza il distacco e migliora notevolmente le possibilità di riattacco (Figura 1E). Eventuali movimenti esagerati possono spostare l'ago nella retina, e movimenti laterali possono danneggiare la retina. L'impiego di una pompa di iniezione è opzionale ma permette una consegna molto precisa.
8. Ritrarre la siringa lentamente. Applicare idratante collirio per mantenere l'occhio idratato.
9. Continuare a monitorare l'animale fino a che riacquista decubito sternale. Non lasciare animali incustoditi o tornare a una gabbia con altri animali allarme fino a quando riacquista decubito sternale.

Representative Results

Possiamo fornire una sospensione di cellule RPE nello spazio sottoretinico di roditori rapidamente e costantemente usando la tecnica descritta in questo manoscritto. Anche se non richiesto, traumi possono essere notevolmente ridotti al minimo con la configurazione mostrata con un micromanipolatore in Figura 1A & B. Mantenere il roditore come mostrato nella Figura 1C per proptosis temporanea. I passaggi sono gli stessi, se eseguita con micromanipolatore oa mano; questi sono rappresentati nel cartone animato in Figura 1D. Quando eseguito in modo pulito fluorescenza dalle cellule RPE etichettati possono essere rilevati utilizzando un cSLO e il distacco della retina indotta può essere visto utilizzando un sistema i PTOM (Figura 2). In figura 3 un cSLO è stato utilizzato per catturare immagini multiple in tutto l'intero sito di iniezione (le immagini dalla Figura 2 e Figura 3 sono stati catturati subito dopo l'iniezione sottoretinico). Notare il distacco che è most profonda (ma non grave) nelle immagini centro (3-5).

Figura 1. La piattaforma di iniezione sottoretinico e una rappresentazione del cartone animato della tecnica di iniezione. (A) fori sono stati perforati in una piastra metallica di apporre il microscopio da dissezione. (B) Un micromanipolatore su un supporto magnetico può essere spostato dentro e fuori posizione durante le iniezioni. (C) Tenere il roditore come mostrato per proptosis temporanea. ( D) Rappresentazione delle strutture principali dell'occhio (D;. punto 3.4) Un foro è fatto nel occhio con un ago monouso tagliente appena sotto il limbus e la lente (D;. Fase 3.6) Un ago smussato viene inserito nel foro e attraverso la retina diametralmente opposta fino a toccare delicatamente la RPE (D; Fase 3.8). L'iniezione di cellule induce una ret temporaneainale distacco. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Fundus immagini scattate subito dopo l'iniezione sottoretinico. (A) La fluorescenza verde osservata nel pannello di destra (sovrapposizione delle immagini IR e FAF) emette iPS-RPE cellule marcate con un marcatore fluorescente transitorio. (B) Distacco della retina della retina neurale e RPE si osserva nei pressi di iniezione sito dopo l'iniezione sottoretinico (segnato con la freccia). Asterisk in (A) etichette il nervo ottico. (Questa cifra viene ripubblicato nel formato originale da Krohne et al. ²¹⁾ bar Scala = 200 micron Cliccate here per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. In imaging in vivo utilizzando ottobre intorno al sito di iniezione immediatamente dopo l'iniezione. Uso di un dispositivo ottobre possiamo catturare immagini multiple intorno al sito di iniezione per determinare sia l'efficacia dell'iniezione e l'entità del distacco. In questo esempio, il distacco minimo (visto come gonfiore soprattutto nelle immagini 3-5) si osserva. Bar Scala = 200 micron

Discussion

In questo articolo si descrive un metodo relativamente semplice per eseguire iniezioni subretiniche di cellule RPE in sospensione in ratti e topi. Il protocollo è facile da imparare e più esperienza con la tecnica si tradurrà in un minor numero di traumi (Figura 3, che rappresenta una delle iniezioni migliori), specialmente se viene utilizzato un micromanipolatore (Figura 1A). Qualsiasi trauma può essere monitorata in vivo con un sistema cSLO e PTOM (Figura 2) se disponibile. Se si desiderano immagini a risoluzione più elevata e meno rumorosi, lo stato delle piattaforme di imaging arte sono disponibili, insieme a eccellenti protocolli per l'esecuzione di ottobre in modelli di malattia murini ^39-41.

Le complicanze più comuni associati con questa tecnica derivano dal posizionamento improprio dell'animale durante l'intervento chirurgico, inducendo eccessivo distacco della retina, causando emorragie coroide, e reflusso di cellule RPE dal ago. Se posizionatoimpropriamente, sarà difficile creare il primo foro, e ancora più difficile trovare dopo. Spostamento degli occhi potrebbe oscurare il buco, rendendo la penetrazione con l'ago smussato impossibile. Mentre è possibile fare un foro con un ago appuntito, questo crea ulteriori traumi. Distacchi di retina Pronunciate può causare grave perdita visiva. Distaccamenti inducono caratteristici cambiamenti morfologici nei neuroni della retina e glia; queste combinazioni di gliosi reattiva e il rimodellamento della retina possono promuovere la morte cellulare dei fotorecettori ^42. Infine, se troppa pressione viene applicato con la siringa con la punta smussata, emorragie coroidale può essere indotta. Se viene applicato troppo pressione limite del RPE e membrana di Bruch può verificarsi e alcuni IP-RPE può essere osservato nella coroide, anche se questi casi sono rari. Reflusso di cellule RPE iniettate nella retina e del vitreo si verifica più frequentemente, ed è difficile da evitare. Questo può essere minimizzata ritraendo il Syringe con l'ago senza punta molto lentamente dopo l'iniezione (a questo proposito il micromanipolatore è incredibilmente utile).

Altre tecniche utilizzate nel campo sono più sofisticati, ma sono anche molto più impegnativa (per una rassegna vedi Ramsden et al. ^30). È possibile iniettare cellule in sospensione nello spazio sottoretinico inserendo un ago appuntito nella direzione opposta attraverso la sclera, coroide, ed RPE. Questa tecnica richiede molta più pratica e competenza; fino masterizzato, la maggior parte delle cellule RPE sarà iniettato nella coroide o retina e mai integrare nello spazio sottoretinico. (Inoltre, a causa di un accesso limitato dell'occhio, questo approccio non è adatto per l'uso in pazienti umani.) È anche possibile impiantare monostrati intatte RPE polarizzato ^43. Ciò avviene srotolando un foglio di cellule RPE sotto la retina attraverso una fessura, o coltivando le cellule su un substrato poroso artificiale e inserting sia le cellule e protesi nello spazio sottoretinico. I vantaggi di queste tecniche sono evidenti le cellule RPE non devono "ri-polarizzare" Dopo l'impianto, e il potenziale di formazione di sfere pigmentate di cellule RPE che sfuggono nella retina possono essere in gran parte evitati ^16,44. Tuttavia, queste tecniche chirurgiche sono intrinsecamente ancora più complicata. Inoltre, nell'uomo, RPE e protesica dovranno essere inserito sotto la macula attraverso una fessura che deve essere cauterizzato con un laser. Ciò comporta la degenerazione retinica intorno alla regione cauterizzato.

Il vantaggio di usare il protocollo descritto qui è che può essere eseguita affidabilità, è il più facile da imparare, e può essere utilizzato per fornire altri composti o cellule oltre RPE. Inoltre, con lievi modifiche (utilizzando l'ago appuntito piuttosto che l'ago smussato per fornire le cellule), la stessa tecnica può essere utilizzata per fornire cellule o farmaci per via intravitreale. Abbiamo unChieve risultati coerenti con questa tecnica, e hanno imparato a minimizzare il trauma associato con la tecnica attraverso l'esperienza e attraverso il monitoraggio in vivo imaging.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1