Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

Abstract

A conversão de luz em impulsos eléctricos ocorre na retina exterior e é feito em grande parte por bastonetes e cones da retina e fotorreceptores células epiteliais de pigmento (RPE). RPE oferecer apoio crucial para fotorreceptores e morte ou disfunção de células RPE é característica da relacionada com a idade degeneração macular (DMRI), a principal causa de perda permanente da visão em pessoas com 55 anos ou mais velhos. Enquanto nenhuma cura para a AMD tenha sido identificado, o implante de RPE doentes saudáveis ​​em olhos pode provar ser um tratamento eficaz, e um grande número de células EPR pode ser prontamente gerado a partir de células estaminais pluripotentes. Várias questões interessantes em relação à segurança e eficácia da distribuição de célula EPR podem ainda ser examinados em modelos animais, e protocolos bem aceites utilizados para injectar RPE foram desenvolvidos. A técnica descrita aqui tem sido utilizado por vários grupos em vários estudos e envolve a criação de um primeiro furo no olho com uma agulha fina. Em seguida, uma seringa com um blunt agulha carregada com células, é inserido através do orifício e passado através do vítreo até tocar suavemente o RPE. Usando este método de injecção, o que é relativamente simples e requer um equipamento mínimo, que a integração coerente e eficiente de células derivadas de células RPE em tronco entre a EPR hospedeiro que impede quantidade significativa de degeneração de fotorreceptores em modelos animais. Embora não faça parte do protocolo real, que também descrevem a forma de determinar a extensão do trauma induzido pela injecção, e como para verificar que as células foram injectados no espaço sub-retiniano através de modalidades de imagiologia in vivo. Finalmente, a utilização deste protocolo não está limitada a células RPE; ele pode ser utilizado para injectar qualquer composto ou célula para o espaço sub-retiniano.

Protocol

NOTA: Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Instituto de Pesquisa Scripps.

1. Elaboração de Materiais para Injecção (~ 20 min)

1. Solução de dissociação de células pré-aquecida (de preferência um que é inactivado através da diluição, não com soro), PBS estéril e meio de cultura (Tabela 1).
2. Esteriliza-se a seringa com uma agulha romba de desmontá-lo e ferver as peças em água durante 15 min.

2. Preparação das células de RPE para Injecção (~ 30 min a 1 h)

1. Separar as células RPE usando solução de dissociação de células pré-aquecido para 5-8 min a 37 ° C.
2. Raspe as células suavemente para liberar qualquer que ainda estão presos.
3. Dilui-se as células com um grande volume de meios de cultura (encher um tubo de 15 ml) para inactivar a solução de dissociação e contá-las.
4. Centrifugar a 800 xg durante 5 min para sedimentar as células.
5. Ressuspender as células em 200.000 células / ul (para entregar 100.000 células num volume de 0,5 ul) em PBS estéril pré-aquecida e transferi-los para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
6. Opcionalmente, adicionar um marcador fluorescente transiente de células vivas e incubar a 37 ° C durante 30-45 min.
7. Carregar a seringa com uma agulha romba com 0,5 ul de células. Injectar as células mais rapidamente possível.

3. Sub-retinal Injection (~ 5 min por Injection)

NOTA: Se possível, aprender a técnica com ratos albinos adultos vez que os navios límbicas são muito mais fáceis de visualizar. Injetar solução Verde Rápido quando aprender (antes de tentar injetar células) para facilitar mais facilmente a visualização do local da injeção.

1. Anestesiar o roedor. Use injecções intraperitoneais de 100 mg / ml de cetamina e 10 mg / ml de xilazina (20 mL / 10 g de corpo woito) ao longo de inalação de isofluorano, uma vez que é difícil de manobrar o roedor e injectar no olho com o focinho no inalador.
   1. Certifique-se de que o animal é anestesiado profundamente por beliscar uma das suas patas. Se ele se encolhe, esperar mais alguns minutos e tente novamente antes de iniciar a injeção sub-retiniana.
2. Posicionar o roedor para o lado, de modo que o olho que vai ser injectado é virado para o tecto.
3. Sob um microscópio de dissecação esticar suavemente a pele de modo que o olho aparece ligeiramente para fora do socket (proptose temporária) e torna-se mais acessível, segurando sua cabeça com apenas dois dedos acima da orelha e por sua mandíbula e se estendem suavemente a pele paralelo às pálpebras de modo que o olho aparece ligeiramente para cima para fora do soquete (Figura 1C). Não segure o roedor muito perto da garganta.
4. Com uma agulha afiada pré-esterilizadas descartáveis ​​30 G, faça um buraco logo abaixo do limbo (se os vasos são atingidos, o sangramento vai bum e significativa e que seja difícil encontrar o buraco mais tarde) e a um ângulo para evitar tocar na lente com a agulha (Figura 1D). Evite tocar na lente com a agulha fina (ou cega) ou formação de catarata imediato ocorrerá.
   NOTA: Injeções trabalhar melhor com duas pessoas. Desta forma, uma pessoa pode passar a seringa com a agulha romba para a pessoa que executa a injeção depois de terem criado o primeiro buraco com a agulha descartável afiada para manter o foco no que o buraco é.
5. Retirar a agulha afiada descartável do olho, mantendo o controle sobre a cabeça. Lembre-se exatamente onde o buraco é.
6. Depois de tanto montagem da seringa pré-carregada com uma agulha cega em um micromanipulator ou segurando-o pela mão, insira a ponta da seringa com a agulha romba através do buraco, tendo o cuidado de novo para não tocar na lente, e empurre suavemente através do olho muito delicadamente até sentir resistência (Figura 1D).
7. Keeping todos os movimentos a um mínimo, cuidadosamente injectar as células RPE lentamente no espaço sub-retiniano.
   NOTA: RPE / retina desapego será induzida; isso é inevitável. No entanto, uma injeção de mais limpo minimiza o desprendimento e melhora consideravelmente as chances de reinserção (Figura 1E). Quaisquer movimentos exagerados podem mover a agulha de volta para a retina, e movimentos laterais pode danificar a retina. A utilização de uma bomba de injecção é opcional, mas permite uma entrega muito preciso.
8. Retirar a seringa lentamente. Aplicar hidratante colírio para manter o olho hidratado.
9. Continue a acompanhar o animal até que ele recupere decúbito esternal. Não deixe animais autônoma ou voltar para uma gaiola com outros animais de alerta até que ele recupere a decúbito esternal.

Representative Results

Podemos fornecer uma suspensão de células de RPE para o espaço sub-retiniano de roedores rapidamente e de forma consistente utilizando a técnica descrita neste manuscrito. Embora não seja obrigatório, traumas pode ser bastante minimizado utilizando a configuração mostrada com uma micromanipulator na Figura 1A & B. Segurar o roedor tal como mostrado na Figura 1C para a proptose temporária. Os passos são os mesmos se realizado com a micromanipulator ou à mão; estes estão representados nos desenhos animados na Figura 1D. Quando realizada de forma limpa de fluorescência a partir das células RPE marcados podem ser detectados utilizando um cSLO e o descolamento da retina induzida pode ser vista usando um sistema de outubro (Figura 2). Na Figura 3 um cSLO foi utilizado para capturar imagens múltiplas em torno de todo o local de injecção (as imagens a partir da Figura 2 e Figura 3 foram capturados imediatamente após a injecção sub-retiniana). Observe que o distanciamento é most profunda (mas não grave) nas imagens center (3-5).

Figura 1. A plataforma de injecção sub-retiniana e uma descrição dos desenhos animados da técnica de injecção. (A) Os furos foram perfurados na placa de metal para afixar o microscópio de dissecação. (B) Um micromanipulador num suporte magnético pode ser movido para dentro e para fora de posição durante as injecções. (C) Segurar no roedor, como mostrado para a proptose temporária. ( D) A representação das estruturas fundamentais do olho (D;. Passo 3.4) Um buraco é feito no olho com uma agulha descartável afiada apenas debaixo do limbo e da lente (D;. Passo 3.6) Uma agulha romba está inserida no furo e através da retina diametralmente oposta, até tocar suavemente o RPE (D; Passo 3.8). A injeção de células induz uma ret temporáriainal desapego. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. imagens de fundo de olho levado diretamente após a injeção sub-retiniana. (A) A fluorescência verde observada no painel direito (sobreposição das imagens IR e FAF) é emitida a partir de IPS-RPE células marcadas com um marcador fluorescente transiente. (B) Deslocamento de retina neural da retina e EPR é observado perto da injecção local após injecção sub-retiniana (indicado pela seta). Asterisk em (A) rotula o nervo óptico. (Este valor está sendo republicado em seu formato original de Krohne et al. ²¹⁾ Barra de escala = 200 mm Por favor, clique here para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Na imagem in vivo utilizando outubro em torno do local da injecção após a injecção. Utilizando um dispositivo de outubro que pode capturar imagens múltiplas em torno do local da injecção para se determinar a eficácia da injecção e da extensão da separação. Neste exemplo descolamento mínimo (como inchaço visto particularmente nas imagens 3-5) é observada. Barras de escala = 200 pm

Discussion

Neste artigo vamos descrever um método relativamente simples para a realização de injecções subretinal de células EPR em suspensão em ratos e camundongos. O protocolo é fácil de aprender e mais experiências com a técnica irá traduzir em menos trauma (Figura 3, o que representa um dos melhores injecções), especialmente se for usado um micromanipulador (Figura 1A). Qualquer trauma pode ser monitorizada in vivo com um sistema cSLO e outubro (Figura 2) se disponível. Se maior resolução e menos ruidosos imagens são desejados, estado das plataformas de arte de imagem estão disponíveis, juntamente com excelentes protocolos para a realização de outubro em modelos de doenças murino ^39-41.

As complicações mais comuns associados com esta técnica surgem de posicionamento inadequado do animal durante a cirurgia, induzindo descolamento de retina excessiva, causando hemorragias coróide e refluxo das células RPE da agulha. Se posicionadoinapropriada, será difícil criar o primeiro buraco, e ainda mais difícil de encontrá-lo depois. Mudando do olho poderia obscurecer o buraco, fazendo a penetração com a agulha romba impossível. Embora seja possível fazer um outro furo com uma agulha fina, isto cria mais trauma. Descolamentos de retina pronunciadas pode resultar em perda visual grave. Destacamentos induzir alterações morfológicas características nos neurônios da retina e glia; estas combinações de gliose reativa e remodelação da retina pode promover a morte das células fotorreceptoras ^42. Finalmente, se demasiada pressão é aplicado com a seringa com a ponta embotada, a hemorragia pode ser induzida coroidal. Se demasiada pressão é aplicada, avanço do EPR e a membrana de Bruch pode ocorrer e alguns iPS-EPR pode ser observado na coróide, embora estes exemplos são raros. Refluxo de células RPE injetado na retina e vítreo ocorre com mais freqüência, e é difícil de evitar. Isto pode ser minimizado por retracção do Syringe com a agulha sem corte muito lentamente após a injeção (a este respeito a micromanipulator é incrivelmente útil).

Outras técnicas utilizadas no campo são mais sofisticado, mas também são significativamente mais difícil (para revisão ver Ramsden et ai. ^30). É possível injectar células em suspensão no espaço sub-retiniano através da inserção de uma agulha afiada no sentido oposto através da esclerótica, coróide e EPR. Esta técnica requer muito mais práticas e de conhecimentos; até domina, a maioria das células RPE será injectada a coróide ou retina e nunca integrar no espaço sub-retiniano. (Além disso, devido ao limitado acesso do olho, esta abordagem não é adequada para utilização em pacientes humanos). Também é possível implantar as monocamadas intactas de EPR polarizado ^43. Isto é feito desenrolando uma folha de células epiteliais pigmentares da retina por baixo através de uma fenda, ou fazendo crescer as células sobre um substrato poroso e artificial inserting ambas as células e da prótese para o espaço sub-retiniano. As vantagens destas técnicas são óbvias como as células RPE não precisam "repolarizar" em cima do implante, e o potencial de formação de esferas pigmentadas de células RPE que escapam para a retina pode ser em grande parte evitadas ^16,44. No entanto, estas técnicas cirúrgicas são inerentemente ainda mais complicada. Além disso, nos seres humanos, o EPR e da prótese vai precisar de ser inserido sob a mácula através de uma fenda que tem de ser cauterizado com um laser. Isto irá resultar na degeneração da retina em torno da região cauterizado.

A vantagem de usar o protocolo descrito aqui é que ele pode ser realizado fiabilidade, é o mais fácil de aprender, e pode ser usado para administrar outros compostos ou células além RPE. Além disso, com ligeiras modificações (utilizando a agulha afiada em vez de a agulha romba para entregar as células), essa mesma técnica pode ser utilizada para administrar medicamentos por via intravítrea ou células. Nós aChieve resultados consistentes com esta técnica, e aprenderam a minimizar o trauma associado com a técnica através da experiência e in vivo através de monitoramento de imagem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1