Medicine

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

Published: January 23, 2015 doi: 10.3791/52247

Peter D. Westenskow^1,2, Toshihide Kurihara¹, Stephen Bravo¹, Daniel Feitelberg¹, Zack A. Sedillo², Edith Aguilar¹, Martin Friedlander^1,2

¹Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, ²Lowy Medical Research Institute

Abstract

電気インパルスへの光の変換は、網膜の外側で発生し、桿体および錐体光受容体および網膜色素上皮（RPE）細胞によって主に達成される。 RPEは、光受容体と死亡またはRPE細胞の機能障害、加齢黄斑変性症（AMD）、人々の年齢55歳以上で永久的な失明の主要な原因の特徴であるための重要なサポートを提供します。 AMDの治療法は同定されていないが、罹患した眼における健康RPEの移植が有効な治療であることを証明することができ、RPE細胞の多数は容易に多能性幹細胞から生成することができる。 RPE細胞送達の安全性および有効性に関するいくつかの興味深い問題は、依然として動物モデルにおいて試験することができ、RPEを注入するために使用される広く受け入れられたプロトコルが開発されている。ここに記載された技術は、様々な研究に複数のグループによって使用されており、最初の鋭い針で目に穴を作成することを含む。ブルーレイとシリンジ細胞を装填した針が穴を通って挿入され、それは穏やかにRPEに接触するまで、硝子体を通過するのnt。比較的単純であり、最小限の設備を必要とするこの注入法を用いて、動物モデルにおける光受容体変性のかなりの量を防止するホストRPEとの間に幹細胞由来のRPE細胞の一貫性のある効率的な統合を達成する。実際のプロトコルの一部ではないが、我々はまた、注射によって誘導外傷の程度を決定する方法について説明し、どのように細胞は、生体内の画像診断法で使用して網膜下腔に注入したことを確認します。最後に、このプロトコルの使用は、RPE細胞に限定されるものではない。それが網膜下腔への任意の化合物又は細胞を注入するために使用することができる。

Protocol

注：すべての動物は、スクリップス研究所によって確立倫理指針に従って処理した。

注射用材料の作製（〜20分）

前加温細胞解離溶液（好ましくは血清を、希釈によって不活性化されているもの）、滅菌PBS、および培養培地（ 表1）。
それを分解し、15分間水で部品を沸騰させることによりブラントニードル付きシリンジを殺菌する。

注射用RPE細胞の調製（1時間に約30分）

37℃で5-8分間予め温め細胞解離溶液を使用してRPE細胞を切り離す。
まだ接続されているものを解放するために静かに細胞をこすり。
解離溶液を不活性化し、それらをカウントする（15mlチューブを埋める）培地の大容量で細胞を希釈する。
細胞をペレットに5分間800×gで遠心分離する。
無菌予め温めPBSに（0.5μlのボリュームに100,000細胞を提供するために）/μL200,000細胞で細胞を再懸濁し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにそれらを転送する。
必要に応じて、生細胞一過性の蛍光マーカーを追加し、30〜45分間37℃でインキュベートする。
細胞の0.5μlの鈍針で注射器をロードします。できるだけ早く細胞を注入する。

3.網膜下注射（注射当たり〜5分）

注：可能であれば、輪部の血管が視覚化する方がはるかに簡単であるため、大人のアルビノラットとテクニックを学ぶ。より簡単に注射部位の視覚化を容易にするために、（細胞を注入しようとする前に）学習するときにファストグリーンソリューションを注入。

齧歯類を麻酔。 100 mg / mlのケタミンおよび10mg / mlのキシラジンの腹腔内注射（20μL/ 10グラムボディWを使用して、イソフルラン吸入以上8個）が、げっ歯類を操縦し、吸入器で鼻と眼の中に注入することが困難であるため。
1. 動物が深く、その足の1をつまんで麻酔をかけていることを確認します。それはフリンチ行動する場合は、さらに数分待ってから網膜下注射を開始する前に、再試行してください。
注入されます目を天井に直面しているように、その側に齧歯類を配置します。
目がソケット（一時的な眼球突出）からわずかに浮き上がるとちょうど耳の上とその顎によると優しくまぶたに皮膚と平行に伸びる2本の指で頭を保持することで、よりアクセス可能になるように解剖顕微鏡下で優しく肌を伸ばす目が（ 図1Cを参照してください）わずかにソケットから飛び出して外れるようにします。喉に近すぎる齧歯類を把握しないでください。
30 Gシャープ使い捨て滅菌済み注射針を使用すると、血管がヒットしている場合は、出血をbします（すぐに輪部の下に穴を作る重要なメールと、後で穴を見つけることは困難である）との角度で針（ 図1D）でレンズに触れないように。発生するシャープ（または鈍い）針または即時白内障形成のレンズに触れないようにしてください。
注：注射は2人とのより良い仕事。このように1人は、彼らが穴がどこに焦点を維持するために、鋭利な使い捨て針で最初の穴を作成した後に注入を行う人に鈍い針で注射器を渡すことができます。
頭の上にグリップを維持しながら、眼から使い捨て鋭い針を撤回。穴がある場所を正確に覚えておいてください。
マイクロマニピュレータに鈍い針で事前にロードされた注射器を取り付けたり、手でそれを保持しているいずれかの後、穴を介して鈍針で注射器の先端を挿入し、レンズに触れないように再び注意しながら、静かに目を通してそれをプッシュするとても優しく感じ抵抗（ 図1D）まで、。
K最小限にすべての動きをeeping、慎重にゆっくりと網膜下腔へのRPE細胞を注入する。
注：RPE /網膜剥離が誘発されます。これは避けられない。しかし、クリーナー注入は剥離を最小限に抑え、大幅に再付着（ 図1E）の可能性を向上させます。任意の誇張された動きが戻って網膜に針を移動させることができる、と横の動きが網膜を損傷することがあります。噴射ポンプの使用は任意であるが、非常に正確な送達を可能にする。
ゆっくりと注射器を撤回。目の保湿を適用することは、水和目を維持するためにドロップされます。
それは胸骨横臥位を取り戻すまで、動物を監視し続ける。それは胸骨横臥位を取り戻すまで、無人の動物を残したり、他の警報動物とケージに戻らないでください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

我々は、この原稿に記載された技術を使用して迅速かつ一貫してげっ歯類の網膜下腔へのRPE細胞の懸濁液を提供することができます。必須ではありませんが、外傷が大幅に図1A＆Bでマイクロマニピュレーターで示した設定を使用して最小限に抑えることができます。一時的な眼球突出については、図1（c）に示すように齧歯類を持ってください。マイクロマニピュレーターで、または手動で実行した場合の手順は同じです。これらは、 図1Dにおける漫画に描かれている。実行したときにきれいに標識されたRPE細胞からの蛍光CSLOを用いて検出することができ、誘導された網膜剥離は、OCTシステム（ 図2）を使用して見ることができる。図3にCSLO（図2および図3からの画像が網膜下注射直後捕獲された）全体の注射部位の周りの複数の画像をキャプチャするために使用した。 mは剥離に注意してください中央の画像（3-5）で深遠な（しかし激しい）OST。

図1.網膜下注射プラットフォームおよび注入技術の漫画の描写。（A）の穴を、解剖顕微鏡を固定するための金属板に開けた。（B）磁気スタンド上にマイクロマニピュレータを内注射剤中の位置から移動させることができる。（C）げっ歯類ホールド一時眼球突出のために示したように（ D）目のキー構造の描写（D;ステップ3.4）穴だけ輪部とレンズの下に鋭い使い捨て針で眼内に作られる（D;ステップ3.6）鈍い針穴に挿入されていると直径方向に対向し、網膜を通して優しくRPEに触れるまで、（D;ステップ3.8）。細胞の注射は、一時的なRETを誘発するノミナル剥離。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.眼底画像は、網膜下注射後に直接採取。（A）右パネル（IR及びFAF画像の重ね合わせ）で観察された緑色蛍光は（B）神経網膜の網膜剥離過渡蛍光マーカーで標識されたiPS-RPE細胞から放出され、RPEは、注射の近くに観察される（矢印でマーク）の網膜下注射後サイト。 （A）中のアスタリスクは、視神経にラベルを付けます。（この図は、Krohne らから元の形式で再公開されている^。21）スケールバー=200μmの時間をクリックしてくださいこの図の拡大版を表示するには、ERE。

我々は、注射部位の周りの複数の画像を取り込むことができるのOCT装置を用いて直接注射後に注射部位の周りにOCTを用いたin vivo画像化。で、図3は、剥離の注射および程度の有効性の両方を決定する。この例では（画像3-5で特に腫れとして見られる）最小限の剥離が観察される。スケールバー=200μmの

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

この記事では、ラットおよびマウス中に懸濁したRPE細胞の網膜下注射を実行するための比較的簡単な方法を記載する。プロトコルは、学習が容易で技術に多くの経験が（ 図3;これは、より良い注射のうちの1つを表す）より少ない外傷に翻訳し、マイクロマニピュレーターが（ 図1A）を使用している場合は特に。任意の外傷CSLOおよびOCTシステム（ 図2）利用可能な場合に、in vivoでモニターすることができる。高い解像度とノイズの少ない画像が所望される場合、技術の画像化プラットフォームの状態は、マウス疾患モデル^39-41でOCTを行うための優れたプロトコルと共に利用可能である。

この技術に関連した最も一般的な合併症は、脈絡膜出血を引き起こし、過剰な網膜剥離を誘導手術中に動物の位置ズレに起因し、針からRPE細胞の逆流。配置した場合不適切に、それは最初に穴を作成することは困難、と後にそれを見つけることがさらに困難になります。目のシフトが不可能な鈍針で貫通を作り、穴を不明瞭でした。それは鋭い針で別の穴を作ることが可能であるが、これはより多くの外傷を作成する。発音網膜剥離は、重度の視覚的な損失をもたらすことができます。分遣は、網膜神経細胞とグリアにおける特徴的な形態変化を誘導する。反応性神経膠症と網膜のリモデリングのこれらの組み合わせは、光受容体細胞死^42を促進することができます。過剰な圧力は、鈍い先端を有する注射器で適用されている場合、最終的に、脈絡膜出血を誘導することができる。あまりにも多くの圧力が加えられる場合、RPEとブルッフ膜のブレークスルーが発生することができ、これらの例は稀であるが、いくつかのiPS-RPEは、脈絡膜で観察することができる。網膜および硝子体に注入されたRPE細胞の還流はより頻繁に発生し、回避することは困難である。これはsyrinを後退させることによって最小化することができるGEは、注入後、非常にゆっくりと鈍い針で（この点でマイクロマニピュレーターは信じられないほど便利です）。

分野で使用される他の技術は、より洗練されていますが（レビューのためにラムスデンら ^30を参照^のこと）も大幅により困難である。これは、強膜、脈絡膜、及びRPEを通して反対方向に鋭い針を挿入することにより、網膜下腔への懸濁液中の細胞を注入することができる。この手法は、かなり多くの実践と専門知識を必要とします。習得するまで、RPE細胞のほとんどは脈絡膜または網膜に注入し、網膜下腔に統合することはないであろう。（また、眼の限られたアクセスのために、このアプローチは、ヒト患者での使用には適さない。）これは、偏光のRPE ⁴³のインタクトな単層を注入することも可能である。これは、スリットを介して網膜下に、または人工的な多孔質基材とinsertin上で細胞を増殖させることによって、RPE細胞のシートをアンロールすることによってのいずれかで行われる網膜下腔へのgの両方のセルと補綴。 RPE細胞は、移植の際に「再分極」、および網膜に逃げるRPE細胞の色素沈着球の電位形成が大きく^16,44を回避することが可能にする必要はありませんようにこれらの技術の利点は明白である。しかし、これらの外科技術は、本質的にさらに複雑である。さらに、ヒトでは、RPEと補綴はレーザーで焼灼されなければならないスリットから黄斑の下に挿入する必要があります。これは焼灼領域の周囲網膜変性になります。

ここで概説したプロトコルを使用することの利点は、信頼性が行わ習得するのが最も簡単であり、RPEの他に、他の化合物、または細胞を送達するために使用することができることができることである。また、（細胞を送達する鈍針ではなく、鋭い針を使用して）わずかな変更を加えて、この同じ技術は硝子体内細胞または薬剤を送達するために用いることができる。我々この技術で一貫した結果をキエーヴェ、そして経験を通しておよびin vivoイメージングの監視を通じて技術に関連した外傷を最小限にするために学んできました。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", point 3 (304 stainless steel)	Hamilton	7803-05	Needles x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetic Stand	Leica Biosystems	39430216	Stand x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Syringes without Needles BD (3 ml)	VWR	BD309656	Pack x 1
Specialty-Use Needles BD (30 G, 1")	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100 ml x 1