Minimal-invasiv teknikk for Injeksjon i Rat Optic Nerve

Introduction

Synsnerven gir en ideell beliggenhet for sentralnervesystemet (CNS) regenerativ forskning inkludert oftalmologiske forhold som optikusnevritt, glaukom og traumer. Injeksjoner av en rekke stamceller enten har vist effekt eller vist lovende i å erstatte tapt myelin, øke aksonal teller og / eller forebygge degenerative sykdommer. ^1,2

Den menneskelige synsnerven inneholder ca 1,2 millioner parallelle aksoner reiser fra netthinnen til chiasm med en diameter på ca 3,0-3,5 mm. ³ For å modellere menneskelige sykdommer i laboratoriet, har rotta vært brukt ofte. Den voksne rotteoptisk nerve inneholder omtrent 100.000 aksoner innenfor en diameter på ca. 0,5 mm. ⁴ En av de store begrensningene i CNS regenerative forskning er direkte benfrie tilgang. Komplikasjoner og kirurgisk risiko for dyret er høyere når hodeskallen eller vertebrae er fjernet. I likhet med fordeleneminimal-invasive tilnærminger i ryggraden, ⁵ direkte synsnerven injeksjoner uten å åpne skallen tilby reduserte komplikasjoner og en raskere bedring.

Denne teknikken har blitt anvendt i tidligere studier. ⁶ I dette manuskriptet og tilhørende video demonstrerer vi en minimalt invasiv prosedyre for å injisere stamceller i rotte synsnerven.

Protocol

MERK: Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Johns Hopkins Animal Care og bruk komité. Anestesi maskiner krever årlig inspeksjon og kalibrering som nødvendig.

1. Anestesi og posisjonering

1. Anestesi.
   1. Utfør alle kirurgiske prosedyrer under narkose med 2-3% isofluorane. Bekreft riktig nivå av anestesi ved tå klype og pustefrekvens. Kontroller at rotten ikke vike som respons på en tå klemme.
      MERK: En vike indikerer anestesi som er for sent, og kan kreve lengre bedøvelse før begynnelsen eller høyere isofluorane konsentrasjon. En pust mindre enn en pust hvert 2 sek er for treg indikerer bedøvelsen er for høy og kan kreve lightening av isofluorane konsentrasjon.
   2. Sikre dyret som nødvendig for å unngå bevegelse av hodet under prosedyren. Plassere en dråpe av lidokain på den kirurgiske øyet. Bruke kunstige tårer hver 10 min for å hindre tørrhet mens under anestesi. Gien injeksjon av buprenorfin på 0,01 mg / kg SC pre-operativt og deretter hver 6-8 time etter behov.
2. Posisjonering.
   1. Plasser rotter i en stereotaxic ramme og holde varmen med en varmepute. Fukt hodebunnen pels med alkohol å ta vare å unngå eksponering på øynene. Bruk sterile verktøy og steril teknikk for å minimere risikoen for postoperative infeksjoner.

2. øyestyring

1. Plasser en 4-0 sutur i side konjunktiva og bind den med nok sutur for å tillate forsiktig trekkraft.

3. Dissection

1. Initial Dissection.
   1. Lag en ~ 1 tomme snitt i huden overliggende orbital ryggen ved hjelp av en størrelse 10 skalpell, som vist i figur 1. Trekk huden og det underliggende fascia og nøye dissekere bort fascia. For å hindre overdreven blødning inn i kirurgisk, unngå å kutte blodårene mens dissekere fascia. Bruk strategisk placed bomull tips å gi hemostase.
2. Dypere Dissection.
   MERK: Med milde trekkraft på konjunktiva trekke øyet ned og ut av kontakten, vil den overlegne orbital muskelen kommer til syne. For å avdekke synsnerven, må denne muskelen kuttes og retro-orbital fett fjernes. Fettet kan kastes og skal ikke erstattes etter injeksjon. Fra dette punktet, bør synsnerven fascia være synlig som en bunt av synsnerven selv, sammen med blodårer innpakket i dura (figur 1).
   1. Lag et lite snitt i dura med skalpell eller en 31 måler skrå nål for å lage piercing mindre traumatisk.

4. Pipette Injector

1. Trekk et glass mikropipette til en diameter på 50-100 um. For å gi stabilitet, montere mikropipette på en micromanipulator og fest til en Hamilton sprøyte koblet til en infusjonspumpe.
2. Trekk opp perlene (eller stamceller)rekonstituert i en 0,5 til 1,0 ul volum inn mikropipette retrograd sammen med 0,5 ul volum av metyl-blå løsning før og etter.
   MERK: En infusjonshastigheten satt til 0,5-2 mL per min hindrer traumer på synsnerven.

5. Injeksjon

1. Senk tuppen av mikropipette på synsnerven like over bretter dura.
   MERK: En liten, men livlig bevegelse av glass spissen inn i synsnerven resultater i minst skade. Som infusjonspumpen begynner, bør metyl blått fargestoff markere det området av den injiserte synsnerven. Fargestoffet bør forbli lokalisert innenfor synsnerven uten å lekke ut i subaraknoidalrommet.
2. Følg den andre bånd av metyl-blått for å bestemme når stamcelle injeksjonen er ferdig og slå av infusjonspumpen seg og den andre dosen av metyl-blått er injisert. Hold mikropipette fortsatt innenfor synsnerven for 2 min for hver en fil volum injiseres i å forebygge høytpress utstøting ved uttak av mikropipette.
   MERK: En alternativ tilnærming er å koble pipettespissen til en luftfylt sprøyte som kan manipuleres manuelt. Uansett, unngå overdreven makt for å minimere skade på synsnervene. Vi anbefaler å injisere mer enn 2 mL av volumet i hver synsnerven.

6. Følg opp

1. Umiddelbar.
   1. Når injeksjonen er fullført, fjerner mikropipette sammen med noen bomulls tips brukes til å gi hemostase. Sutur huden med 3-0 silke og fjern konjunktival sutur.
   2. Hold rotter varm på en varmepute før de dukker opp fra anestesi. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke returnere et dyr som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre dyr før fullt restituert.
   3. Hvis dyret blir vist tegn på smerte, inkludert overdreven apati, ataksi, eller anstrengt pusterg, gi hensiktsmessig analgesi med intramuskulær buprenorfin (0,05 mg / kg) opp til tre ganger daglig.
2. Lang sikt.
   1. For neste 24-48 timer, observere rotte for komplikasjoner av kirurgi inkludert hevelse eller utflod fra såret eller andre tegn på smerte som mjauing, sammenkrøket utseende, ikke-grooming, eller ikke spiser. Vurdere samråd med veterinær eller etisk avlivning etter behov.

Representative Results

Ved avslutningen av forsøket ble rottene avlivet og perfusert med 4% paraformaldehyd. Synsnervene ble forsiktig dissekert og montert for kryostaten snitting. Figur 2 viser et eksempel på en hel rotteoptisk nerve ved lav effekt, hvor Evans blå fargestoff ble injisert for å visualisere området. Pilen identifiserer den nøyaktige plasseringen av injeksjonen. Dette disseksjon ble gjort i løpet av et par minutter for injeksjonen som indikert ved begrenset diffusjon av fargestoffet ned nerve. Med andre injeksjoner, har vi observert en langsom diffusjon av fargestoff mot chiasma i løpet av flere timer.

Figur 1:. Kirurgisk synsfelt Rotten blir plassert med å få tilgang til det venstre øyet i dette tallet. Et snitt er gjort over orbital møne og fascialvev dissekeres ned bak øyet. En konjunktival sutur gjør at føreren kan bruke milde trekkraft som trekker intrakranielle synsnerven til syne uten å åpne skallen.

Figur 2:. Gross disseksjon av injisert synsnerven Utnytte Evans blått fargestoff, kan injeksjonsstedet i synsnerven bli grovt visualisert under en disseksjon mikroskop. I dette bildet, ble den optiske nerven kuttes på injeksjonsstedet for å vise fargestoffet integrert i den optiske nerven vev.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lewis rat	Charles River	4	Any rat strain will work.
Anesthesia machine	Surgivet	CDS9000	CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount
Infusion pump	Stoelting	53129
Dissection microscope	National Optical	409-411-1105
Fiber-optic light source	Fisher Scientific	12-562-21
Dissection and Stereotaxic Instrument	Stoelting	51400
Pipette Puller	Kopf	750
Pipettes	World Precision Instruments	18150-6
Disposable scalpel blades	Harvard Apparatus	810-15-021
Iridectomy scissors	Electron Microscopy Sciences	Uniband LA-4XF