Introduction
De oogzenuw biedt een ideale locatie voor het centrale zenuwstelsel (CNS) regeneratief onderzoek met inbegrip van oogheelkundige aandoeningen, zoals optische neuritis, glaucoom en trauma. Injecties van verschillende stamcellen zijn ofwel aangetoonde werkzaamheid of belofte getoond bij het vervangen van verloren myeline, waardoor axonale tellen en / of voorkomen van degeneratieve ziekten. 1,2
De menselijke oogzenuw bevat ongeveer 1.200.000 parallel axonen op weg van de retina naar de chiasm met een diameter van ongeveer 3,0-3,5 mm. 3 Voor menselijke ziekten te modelleren in het laboratorium, is de rat vaak toegepast. De volwassen rat oogzenuw bevat ongeveer 100.000 axonen binnen een diameter van ongeveer 0,5 mm. 4 een van de belangrijkste beperkingen van CNS regeneratieve activiteit is direct been. Complicaties en chirurgische risico's voor het dier hoger wanneer de schedel of wervels verwijderd. Net als de voordelen vanminimaal invasieve benaderingen in de ruggengraat, 5 direct oogzenuw injecties zonder de schedel aanbod verlaagde complicaties en een sneller herstel.
Deze techniek is gebruikt in eerdere studies. 6 In dit manuscript en bijbehorende video, demonstreren we een minimaal invasieve procedure stamcellen injecteren in de ratten optische zenuw.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Johns Hopkins Animal Care en gebruik Comite. Anesthesieapparatuur vereisen jaarlijkse inspectie en kalibratie als dat nodig is.
1. Anesthesie en positionering
- Anesthesie.
- Voer alle chirurgische ingrepen onder narcose met 2-3% isofluorane. Bevestig juiste niveau van de anesthesie door teen knijpen en ademhaling. Controleer of de rat geen krimp als reactie op een teen knijpen.
OPMERKING: Een krimp geeft verdoving dat is te laat en kan langer verdoving vóór begin of een hogere isofluorane concentratie vereisen. Een ademhalingsfrequentie minder dan 1 ademhaling per 2 seconden te laag vermelding van de anesthesie te hoog en kunnen lichter worden van de isofluorane concentratie vereisen. - Bevestig het dier moet worden gehouden met beweging tijdens de procedure te voorkomen. Een druppel van lidocaïne op de chirurgische oog. Met kunstmatige tranen elke 10 min tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Geveneen injectie van buprenorfine van 0,01 mg / kg SC pre-operatief en vervolgens elke 6-8 uur naar behoefte.
- Voer alle chirurgische ingrepen onder narcose met 2-3% isofluorane. Bevestig juiste niveau van de anesthesie door teen knijpen en ademhaling. Controleer of de rat geen krimp als reactie op een teen knijpen.
- Positionering.
- Plaats ratten in een stereotaxische frame en warm te houden met een verwarmingselement. Bevochtig de hoofdhuid vacht met alcohol en zorg ervoor dat de blootstelling aan de ogen te vermijden. Gebruik steriele instrumenten en steriele techniek om het risico op postoperatieve infecties te minimaliseren.
2. Eye-
- Plaats een 4-0 hechtdraad in de laterale bindvlies en bind het met voldoende hechting aan zachte tractie mogelijk te maken.
3. Dissection
- Initial Dissection.
- Wordt ~ 1 inch incisie in de huid die over de orbitale rand via een maat 10 scalpel zoals getoond in figuur 1. Trek de huid en de onderliggende fascia en voorzichtig ontleden weg de fascia. Om te voorkomen dat overmatig bloeden in de chirurgische, vermijd het snijden bloedvaten, terwijl het ontleden van de fascia. Gebruik strategisch placed katoen tips om hemostase te bieden.
- Dieper Dissection.
OPMERKING: Met zachte tractie op het bindvlies te trekken het oog naar beneden en uit het stopcontact, zal de superieure orbitale spier in zicht komen. Om de optische zenuw bloot te leggen, moet deze spier gesneden en de retro-orbitale vet verwijderd. Het vet kan worden verwijderd en mag niet worden vervangen na injectie. Vanaf dit punt zou de oogzenuw fascia zichtbaar als een bundel van de optische zenuw zelf, samen met bloedvaten gewikkeld in dura (figuur 1).- Maak een kleine incisie in de dura met het scalpel of een 31 gauge schuine naald te maken piercing minder traumatisch.
4. Pipette Injector
- Trek een glazen micropipet met een diameter van 50-100 urn. Om de stabiliteit te bieden, monteren de micropipet op een micromanipulator en hechten aan een Hamilton spuit verbonden met een infuuspomp.
- Trek de kralen (of stamcellen)gereconstitueerd in een 0,5-1,0 ul volume in de micropipet retrograde met 0,5 gl volume van methyl blauwe oplossing van het schip.
OPMERKING: Een infusiesnelheid ingesteld op 0,5-2 ul per min voorkomt trauma aan de oogzenuw.
5. Injectie
- Laat de tip van de micropipet op de oogzenuw net boven de gekerfd dura.
OPMERKING: Een klein, maar levendige beweging van het glas tip in de oogzenuw resultaten in het minst schade. Aangezien de infusiepomp begint, moet de methyl- blauwe kleurstof het gebied van de geïnjecteerde oogzenuw te markeren. De kleurstof moet blijven gelokaliseerd binnen de oogzenuw zonder lekken in de subarachnoïdale ruimte. - Volg de tweede groep van methyl blue te bepalen wanneer de stamcel injectie is voltooid en zet de infusiepomp af als de tweede dosis methyl blue geïnjecteerd. Houd de micropipet nog binnen de oogzenuw gedurende 2 min per 1 pl volume geïnjecteerd ter voorkoming highdruk uitwerpen bij de uitslag van de micropipet.
OPMERKING: Een alternatieve benadering is om de pipetpunt aan te sluiten op een met lucht gevulde spuit die handmatig kan worden gemanipuleerd. Hoe dan ook, vermijd overmatige kracht om schade aan de optische zenuwen te minimaliseren. Wij raden het injecteren niet meer dan 2 pl volume in elk oogzenuw.
6. Follow-up
- Onmiddellijk.
- Wanneer de injectie is voltooid, verwijder de micropipet samen met eventuele katoen tips gebruikt om hemostase te bieden. Hechtdraad de huid met 3-0 zijde en verwijder de conjunctivale hechting.
- Houd ratten warm op een verwarming pad, totdat ze uit anesthesie. Laat een dier niet onbeheerd verlaten totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging behouden. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het bedrijf van de andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
- Als het dier vertoont tekenen van pijn, waaronder overmatige lethargie, ataxie of zware breathing passende wijze te analgesie intramusculair buprenorfine (0,05 mg / kg) tot driemaal daags.
- Langetermijn.
- Voor de komende 24-48 uur, acht de rat voor complicaties van een operatie zoals zwelling of afscheiding uit de wond of andere tekenen van pijn, zoals vocalizing, gebogen uiterlijk, non-verzorging, of niet eten. Overweeg overleg met een dierenarts of ethische euthanasie als dat nodig is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aan het einde van het experiment werden ratten gedood en geperfuseerd met 4% paraformaldehyde. De optische zenuwen werden zorgvuldig uitgesneden en geplaatst op cryostat coupes. Figuur 2 toont een voorbeeld van een rat geheel gezichtszenuw bij laag vermogen waarin Evans blauwe kleurstof geïnjecteerd om de site te visualiseren. De pijl geeft de precieze locatie van de injectie. Deze dissectie gebeurde binnen enkele minuten na de injectie zoals aangegeven door de beperkte diffusie van de kleurstof door het zenuw. In andere injecties, hebben we een langzame diffusie van kleurstof naar de optisch chiasma de loop van enkele uren waargenomen.
Figuur 1:. Chirurgische gezichtsveld De rat wordt gepositioneerd om het linker oog in deze figuur. Een incisie boven de orbitale nok en de fasciaal gemaaktweefsel wordt ontleed neer achter het oog. Een conjunctivale hechting kan de machinist zachte trekkracht die de intracraniële oogzenuw in zicht trekt zonder het openen van de schedel van toepassing.
Figuur 2:. Bruto dissectie van geïnjecteerd oogzenuw Gebruik makend van Evans blauwe kleurstof, kan de plaats van injectie in de oogzenuw schromelijk worden gevisualiseerd onder een dissectie microscoop. In dit beeld is de oogzenuw gesneden op de plaats van injectie naar de kleurstof opgenomen in de oogzenuw weefsel tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
- Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
- Quigley, H. A., Iglesia, D. S. Stem cells to replace the optic nerve. Eye. 18 (11), 1085-1088 (2004).
- Ghaffarieh, A., Levin, L. A. Optic nerve disease and axon pathophysiology. International review of neurobiology. 105, 1-17 (2012).
- Fukui, Y., Hayasaka, S., Bedi, K. S., Ozaki, H. S., Takeuchi, Y. Quantitative study of the development of the optic nerve in rats reared in the dark during early postnatal life. Journal of anatomy. 174, 37-47 (1991).
- Celestre, P. C., et al. Minimally invasive approaches to the cervical spine. The Orthopedic clinics of North America. 43 (1), 137-147 (2012).
- Hallas, B. H., Wells, M. R. A Novel Technique for Multiple Injections into the Mammalian Optic Nerve. Kopf Carrier. 54, (2001).
- Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway. Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).
- Adachi-Usami, E. Optic neuritis--from diagnosis to optic nerve transplantation. Nippon Ganka Gakkai zasshi. 104 (12), 841-857 (2000).
- Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).
- Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. Regenerative nanomedicine for vision restoration. Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).
