Introduction
O nervo óptico oferece uma localização ideal para o sistema nervoso central (SNC) de pesquisa regenerativa incluindo condições oftalmológicas como a neurite óptica, glaucoma e trauma. As injecções de uma variedade de células estaminais quer demonstraram eficácia ou mostraram-se promissores na substituição de mielina perdido, aumentando a contagem axonal e / ou prevenção de doenças degenerativas. 1,2
O nervo óptico humano contém aproximadamente 1,2 milhões de axónios que viajam paralelas da retina para o quiasma com um diâmetro de cerca de 3,0-3,5 mm. 3 Para modelar doenças humanas em laboratório, o rato tem sido utilizado frequentemente. O nervo óptico de rato adulto contém cerca de 100.000 axónios dentro de um diâmetro de aproximadamente 0,5 mm. 4 Uma das principais limitações na pesquisa no SNC regenerativo é desossada acesso directo. As complicações e riscos cirúrgicos para o animal são maiores quando o crânio ou vértebras são removidos. Similar aos benefícios deabordagens minimamente invasivas da coluna vertebral, 5 injeções diretas do nervo óptico sem abrir o crânio de oferta reduzida complicações e uma recuperação mais rápida.
Esta técnica tem sido utilizada em estudos anteriores. 6 Neste manuscrito e vídeo acompanhante, que demonstram um procedimento minimamente invasivo para injectar células estaminais no nervo óptico de rato.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o Johns Hopkins. Aparelhos de anestesia exigir uma inspecção anual e calibração, se necessário.
1. Anestesia e Posicionamento
- Anestesia.
- Execute todos os procedimentos cirúrgicos sob anestesia com isofluorano 2-3%. Confirme nível adequado de anestesia por pitada dedo do pé e taxa de respiração. Verifique se o rato não se mexe em resposta a uma pitada dedo do pé.
NOTA: Um vacilo indica anestesia que é tarde demais e pode exigir anestesia mais longos antes de iniciar ou uma concentração de isofluorano superior. A taxa de respiração inferior a 1 respiração cada 2 s é muito lento o que indica anestesia é demasiado elevada e pode exigir um aligeiramento da concentração de isofluorano. - Prenda o animal como necessário para evitar o movimento da cabeça durante o procedimento. Coloque uma gota de lidocaína no olho cirúrgico. Use lágrimas artificiais a cada 10 minutos para evitar a secura sob anestesia. Daruma injecção de buprenorfina a 0,01 mg / kg SC pré-operatório e em seguida cada 6-8 horas, conforme necessário.
- Execute todos os procedimentos cirúrgicos sob anestesia com isofluorano 2-3%. Confirme nível adequado de anestesia por pitada dedo do pé e taxa de respiração. Verifique se o rato não se mexe em resposta a uma pitada dedo do pé.
- Posicionamento.
- Coloque ratos em um quadro estereotáxico e manter aquecido com uma almofada de aquecimento. Molhar a pele do couro cabeludo com álcool tendo o cuidado de evitar a exposição sobre os olhos. Use ferramentas estéreis e técnica estéril para minimizar o risco de infecções pós-operatórias.
2. Controle dos olhos
- Coloque um fio de sutura 4-0 na conjuntiva lateral e amarrá-lo com sutura suficiente para permitir tração suave.
3. Dissecção
- Dissecção inicial.
- Adicione uma incisão ~ 1 polegada na pele que recobre o cume orbital usando um bisturi tamanho 10, como mostrado na Figura 1. Retirar a pele e fáscia subjacente e cuidadosamente dissecar longe do painel frontal. Para evitar sangramento excessivo no cirúrgico, evitar o corte vasos sanguíneos enquanto dissecando a fáscia. Use estrategicamente placed pontas de algodão para proporcionar hemostase.
- Dissecção mais profundo.
NOTA: Com tração suave na conjuntiva puxando o olho para baixo e para fora do soquete, o músculo orbital superior entrará em vista. A fim de expor o nervo óptico, este deve ser cortado do músculo e gordura retro-orbital removido. A gordura pode ser descartado e não deve ser substituído após a injecção. A partir deste ponto, a fáscia nervo óptico deve ser visível como um feixe do nervo óptico em si, juntamente com os vasos sanguíneos envolvidos na dura-máter (Figura 1).- Fazer uma pequena incisão na dura usando o bisturi ou com uma agulha de calibre 31 chanfrada para fazer a perfuração menos traumática.
4. Pipeta Injector
- Retire uma micropipeta de vidro para um diâmetro de 50-100 um. Para garantir a estabilidade da montagem, a micropipeta em um micromanipulador e se ligar a uma seringa de Hamilton ligada a uma bomba de infusão.
- Puxe as contas (ou células-tronco)reconstituída num volume de 0,5-1,0 mL na micropipeta retrógrada juntamente com o volume de 0,5 ul de uma solução de metil azul antes e depois.
Observação: Uma taxa de infusão definida para 0,5-2 mL por min impede trauma para o nervo óptico.
5. Injeção
- Diminuir a ponta da micropipeta para o nervo óptico logo acima da dura-máter entalhado.
NOTA: Uma pequena, mas rápido movimento da ponta de vidro nos resultados do nervo óptico em menos danos. À medida que a bomba de infusão inicia, o corante azul de metilo deve destacar a área do nervo óptico injectado. O corante deve permanecer localizada dentro do nervo óptico sem vazando no espaço subaracnóide. - Seguir a segunda banda de azul de metileno para determinar quando a injecção de células estaminais é completa e ligar a bomba de infusão fora como a segunda dose de azul de metileno é injectado. Manter a micropipeta ainda dentro do nervo óptico durante 2 min para cada volume de 1 mL injectada no para prevenir altaejeção de pressão após a retirada da micropipeta.
NOTA: Uma abordagem alternativa é conectar a ponta da pipeta a uma seringa cheia de ar que pode ser manipulado manualmente. De qualquer maneira, evitar força excessiva para minimizar o dano para os nervos ópticos. Recomendamos injetando não mais de 2 l de volume, em cada nervo óptico.
6. Acompanhamento
- Immediate.
- Quando a injecção estiver concluída, remova a micropipeta, juntamente com todas as pontas de algodão usados para fornecer hemostasia. Suturar a pele com seda 3-0 e remova o fio de sutura conjuntival.
- Mantenha ratos quente sobre uma almofada de aquecimento até que eles emergem da anestesia. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que tenha sido submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Se o animal está exibindo sinais de dor excessiva, incluindo letargia, ataxia, ou trabalharam breathing, administrar analgesia adequada com buprenorfina intramuscular (0,05 mg / kg) até três vezes ao dia.
- Longo prazo.
- Para a próxima 24-48 h, observe o rato por complicações da cirurgia, incluindo inchaço ou secreção da ferida ou outros sinais de dor, como vocalização, aparência curvada, não-aliciamento, ou não comer. Considere consulta com um veterinário ou a eutanásia ético, conforme necessário.
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Representative Results
Na conclusão da experiência, os ratos foram sacrificados e perfundidos com paraformaldeído a 4%. Os nervos ópticos foram cuidadosamente dissecados e montados para seccionamento criostático. A Figura 2 mostra um exemplo de um nervo óptico de rato inteiro com baixa potência, em que o corante azul de Evans foi injectada a fim de visualizar o local. A seta identifica a localização precisa da injecção. Esta dissecção foi realizada dentro de alguns minutos da injecção, tal como indicado pela difusão restrita do corante para o nervo. Em outras injeções, temos observado uma lenta difusão de corante para o quiasma ao longo de várias horas.
Figura 1:. Campo cirúrgico de vista O rato é posicionado com a acessar o olho esquerdo nesta figura. Uma incisão é feita acima do cume orbital ea fascialtecido é dissecado para baixo por trás do olho. Uma sutura conjuntival permite que o operador aplica tracção suave que puxa o nervo óptico sem intracraniana em vista a abertura do crânio.
Figura 2:. Dissecção macroscópica do nervo óptico injectado Utilizando corante azul de Evans, o local da injecção no nervo óptico pode ser grosseiramente visualizados sob um microscópio de dissecção. Nesta imagem, o nervo óptico foi cortado no local da injecção para mostrar o corante incorporado no interior do tecido do nervo óptico.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
Pipette Puller | Kopf | 750 | |
Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
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- Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway. Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).
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