Abstract
Aqui nós descrevemos um método para a construção de um uso único "injectrode" usando peças comercialmente acessíveis e económicas. Um sistema de sondagem foi desenvolvido que permite a injecção de um fármaco durante a gravação de sinais electrofisiológicos da população de neurónios afectados. Este método fornece uma alternativa simples e económica para soluções comerciais. Uma pipeta de vidro foi modificado combinando-o com uma agulha hipodérmica e um filamento de prata. O injectrode está ligado a bomba de micro comercial para entrega da droga. Isso resulta em uma técnica que fornece feedback em tempo real através de sinais extracelulares farmacodinâmica de múltiplas unidades provenientes do local de entrega de drogas. Como prova de conceito, registramos a atividade neuronal do colículo superior provocada por flashes de luz em ratos, concomitantemente com a entrega de drogas através da injectrode. A capacidade de gravação injectrode permite a caracterização funcional do injsite de exão favorecendo o controle preciso sobre a localização de entrega da droga. A aplicação deste método também se estende muito além do que é demonstrado aqui, como a escolha de substância química carregada no injectrode é vasto, incluindo o rastreamento de marcadores para experimentos anatômicos.
Introduction
A inactivação de áreas corticais e núcleos sub-corticais é importante no estudo das relações funcionais entre diversas estruturas cerebrais 2-4. A literatura recente empregue química perda de função ou técnicas criogénicas para estudar o papel das estruturas cerebrais 2,5. No que diz respeito a micro-injecções farmacológicas, pequenos volumes de medicamentos podem ser administrados em uma região do cérebro, a uma taxa controlada ao mesmo tempo minimizando os danos colaterais ao tecido circundante 6,7. Esta técnica pode ser usada para fornecer agonistas específicos, agonistas inversos ou antagonistas para estudar o efeito de diferentes alvos farmacológicos na actividade neuronal. Tais efeitos também pode ser estudado através da medição alterações nas respostas neuronais a partir de locais distantes, permitindo que os investigadores a estudar as relações entre as diferentes estruturas corticais e sub-corticais.
Aqui, nós demonstramos a montagem de um dispositivo, o injectrode, capaz de both gravar sinais eletrofisiológicos e entrega de pequenas quantidades de drogas no local de destino. Nós demonstramos as capacidades deste sistema através da injecção de GABA, um inibidor comum de actividade neuronal, no colículo superior do rato. Esta região é sensível à estimulação visual, o que nos permitiu usar a atividade multiunit visualmente evocados para confirmar injectrode localização. A reversibilidade da inativação foi avaliada pela recuperação da atividade neuronal normal após o final da injeção GABA.
A capacidade para monitorizar a actividade de multi-unidade a partir do local de injecção permite o ajuste fino das taxas de injecção e dos volumes necessários para se conseguir a resposta farmacodinâmica desejada. Portanto, uma vantagem desta técnica é a de limitar o potencial dano tecidual causado pela microperfusão, uma vez que os menores volumes eficazes são injectados. O protocolo proposto fornece um método eficiente de custos para gerar o necessar hardware descartávely para a realização de experiências onde a entrega de drogas e gravação atividade neuronal local está desejados.
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Protocol
Nota: Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho Canadense para a Proteção dos Animais e do conselho de revisão Ética da Université de Montréal.
1. Assembleia da pipeta de gravação de injecção
- Puxar um capilar de vidro a cerca de 7 cm de comprimento (diâmetro exterior 1 mm), utilizando um puxador de pipeta.
- Quebrar a ponta do capilar e verificar a abertura sob um microscópio de luz. Confirmar que o diâmetro interno é entre 30 um e 40 um.
- Inserir um longo fio de prata 7 centímetros para o capilar de vidro com cerca de 1 cm protuberantes a partir da extremidade não-cónica da pipeta de vidro.
- Dobre o excesso de filamentos perpendicularmente ao capilar de vidro.
- Aplicar uma gota de adesivo plástico flexível sobre o eixo de uma agulha hipodérmica 30 G.
- Inserir uma agulha hipodérmica 30 G na pipeta de vidro de acordo com os esquemas apresentados na Figura 1
- Adicionar uma segunda camada de cola para assegurar uma vedação adequada a partir da junção entre a pipeta de vidro e a agulha hipodérmica.
- Deixar secar a pipeta com a ponta virada para cima, durante cerca de 12 h para assegurar uma cura adequada da cola. O resultado final é mostrado na Figura 2.
NOTA: Este procedimento é feito em experiências agudas e esterilização da ponta da pipeta não é necessária.
2. Preparação de animais
- Coloque o rato em uma caixa de anestesia.
- Induzir anestesia, utilizando 4% de isoflurano durante 5 a 10 min.
- Colocar o animal sobre uma mesa estereotáxico com almofada de aquecimento e uma sonda rectal para manter uma temperatura corporal de 37 ° C. Use um cone do nariz para manter a anestesia com isoflurano a 2%. Fixe a cabeça do rato, utilizando barras de ouvido e suporte de dentes.
- Aplicar pomada ou colírio oftalmológicas, que incluem 1% Atropina cai para ajudar na dilatação da pupila. Para evitar o ressecamento, aplicar lubrificante quedas aproximadamente a cada 30 min.
- Raspar a cabeça e limpe-o com 10% de iodopovidona.
- Para a anestesia local, injectar 0,5 ml de lidocaína a 2% no âmbito do couro cabeludo em 2-3 locais, levantando-se a pele e inserir a ponta da agulha.
- Confirmar nível adequado da anestesia através da realização de um aperto do dedo do pé e observando-se a falta de movimento. Além disso, controlar o ritmo cardíaco para garantir que ele é dentro dos valores normais (de 300 a 400 batimentos / min).
- Inciso o couro cabeludo em uma linha reta ao longo da mediana, com uma lâmina de bisturi nº 10 para expor ambas as suturas coronal e sagital.
- Revelar o lambda e Bregma pontos, empurrando de lado o tecido que está cobrindo o crânio com uma espátula cirúrgica.
- Nível do crânio para que posições bregma e lambda são no mesmo plano.
- Para definir o ponto de referência, use um dispositivo estereotáxico com um tubo de vidro montada para defini-la bem acima Bregma. Este será o "zero" para o antero-posterior e medcoordena medições ial-laterais.
- Defina o ponto de interesse, movendo o estereotáxico para montar as coordenadas necessárias, observe as coordenadas estereotáxica e desenhar um quadrado ao redor da área-alvo que marca onde a craniotomia será realizada.
- Use uma furadeira com uma broca cirúrgica esterilizada ao longo da praça marcada lentamente, sem pressão para remover lentamente o material ósseo. Tenha cuidado para não perfurar muito tempo na mesma área, uma vez que irá produzir calor e causar lesões no córtex.
- Quando o osso que delimita a craniotomia tornou-se suficientemente fina, retire cuidadosamente a seção cranial com pinça para expor o córtex.
- Irrigar freqüentemente o córtex exposto com fluido cerebrospinal artificial para evitar a dessecação dos tecidos.
NOTA: a remoção dura-máter é desnecessário no rato como a ponta do injectrode é robusto o suficiente para penetrar.
3. Preenchimento e Montagem do Sistema de Injeção
- Encha o5-10 ul micro por aspiração com óleo mineral.
- Encher a agulha hipodérmica com a pipeta de vidro fixado com uma solução de 0,5% de Chicago Sky Blue (CSB) e 300 uM de ácido γ-aminobutírico (GABA) ou uma solução de lidocaína a 2% com 0,5% de CSB 9. Dilui-se todas as soluções com solução salina.
- No caso de uma substância abundante, preencher usando uma seringa regular e utilizar as técnicas usuais de precaução para evitar a formação de bolhas de ar.
- No caso de substâncias mais caros, usar óleo mineral para preencher o injectrode e o agente químico pode então ser introduzido por aspiração. À medida que a diferença de densidade entre o óleo mineral e água é relativamente elevada, esta substância é um bom candidato para a injecção de soluções aquosas.
NOTA: Um corante pode ser adicionado para confirmar a separação entre os dois líquidos.
- Para encher a pipeta de injecção, encher uma seringa de 1 ml com a solução por aspiração e depois injectar a solução lentamentepara a pipeta de injecção.
- Preste muita atenção para vazamentos em regiões indicadas na figura 1 limpando essas áreas limpas e observando as fugas pela injeção ainda mais a solução lentamente com a seringa.
- Remover a seringa de 1 ml. Ao fazê-lo, certifique-se de manter uma leve pressão sobre o êmbolo de modo que o vácuo não remover a solução da pipeta de injeção.
- Preencha a micro com óleo mineral por aspiração e anexá-lo firmemente à pipeta de injeção preenchido, em seguida, limpe cuidadosamente qualquer excesso de solução na injectrode montado com gaze.
- Verificar que a ponta não é bloqueado pela injecção de um volume muito reduzido, o suficiente para ver uma pequena gota formando na ponta da pipeta de vidro.
- Monte o injectrode no sistema micropump e garantir que ele está bem fixo.
- Posicionar cuidadosamente a ponta injectrode nas coordenadas alvo e diminuir a ponta para a superfície do córtex.
- Lentamente, abaixe o injectrode utilizar o aparelho estereotáxico para a estrutura de alvo (colículo superior, neste caso), utilizando as coordenadas anatómicas apropriadas.
- Cubra o córtex exposto com agar quente para evitar a dessecação dos tecidos.
4. Injeção e inativação reversível
- Defina a bomba de microinjeção para injetar 400 a 800 nl em 40 nl / min e pressione Executar para iniciar a injeção. Note-se que taxa de pico vai mostrar redução durante a injecção.
NOTA: Na configuração experimental, a atividade neural recuperado dentro de uma hora após o fim da entrega GABA. Qualquer dispositivo mecânico calibrado pode ser utilizado para aplicar pressão sobre a seringa de micro-injecção, a fim de realizar a injecção. - Após a aquisição dos dados eletrofisiológicos, eutanásia usando um método aprovado pela comunidade local animal Ética.
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Representative Results
A construção do injectrode é ilustrada na Figura 1. Um fio de prata (C) é alimentado para dentro de uma pipeta de vidro de (D) com uma porção do arame dobrado e projectando-se para fora a partir da abertura. Uma agulha 30 G (B) está ligado e selado para a abertura da pipeta de vidro com cola. Após a pipeta foi cheia com a substância de injecção, uma micro seringa de vidro (A) está ligado à agulha. É importante que exista uma boa vedação onde o micro liga seringa com a agulha (E) e em que o fio de prata se projecta a partir da pipeta de vidro (M). A Figura 2 mostra uma fotografia do que o injectrode parece que após a conclusão da montagem.
Actividade multiunit visuais evocados foram obtidos no colículo superior, na sequência de um flash de 300 ms para o olho contralateral como ilustrado na Figura 3. Após a injecção do GABA, a actividade spiking em resposta a um estímulo de flash foi suprimida. visualmentemultiunit actividade evocada normalmente retornado entre 45 a 60 minutos após a injecção ter terminado.
A Figura 4 ilustra a configuração do sistema de micro-injecção. O controlador da bomba de injeção permite que o usuário especifique as configurações para a injecção. Um ligador eléctrico de mola liga o fio de prata que se projecta a partir da pipeta de vidro. O conector leva a um estágio cabeça com terra e eletrodos de referência e, em seguida, conectado a um amplificador. Um analógica / digital (A / D) interface é usada para obter os dados eletrofisiológicos, e um alto-falante é usado para monitoração de áudio complementar da atividade neuronal.
Figura 1:. Representação esquemática da montagem de uma seringa de micro injectrode (A) está ligado ao pipeta de gravação de injecção que consistem de uma 30 L hypodermic agulha (B) aderiu a um fio de prata (C) dentro de uma pipeta de vidro (D). Regiões circulou (E - F) áreas de destaque que podem ser suscetíveis a vazamentos.
Figura 2: Uma fotografia da pipeta construído usando uma agulha 30 G (B), a colagem adesiva à prova de água (M), um fio de prata (C) e uma pipeta de vidro (D).
Figura 3: Uma ilustração do efeito inibidor da injecção de GABA (300 ^ M) na actividade de multi-unidade visual evocado no colículo superior, as setas indicam o início de flash. Elétricoal sinais foram filtrados com um filtro passa-banda ajustado entre 30 e 3000 Hz.
Figura 4: Representação esquemática do sistema de micro-injecção completo.
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Discussion
O protocolo proposto foi projetado para resolver os desafios decorrentes de métodos atuais de inativação reversíveis. Especificamente, este projeto visa aperfeiçoar os métodos utilizados para microinjeções químicas das substâncias que modulam a atividade neural, particularmente em estruturas cerebrais profundas. Um desafio técnico que emerge a partir deste tipo de instalação é a necessidade de ambas as sondas para ser co-localizada no mesmo espaço restrito in vivo a fim de obter gravações precisas no local da injecção. Este problema pode ser ultrapassado usando os dispositivos, tais como o apresentado aqui, que são capazes de injecção e de gravação no mesmo local. Os métodos alternativos incluem a utilização de dispositivos baseados em impulsos de pressão de gás. Tais ferramentas estão disponíveis há muitos anos, mas o uso de um intermediário compressível reduz o controle sobre as taxas de injecção e volumes, dois parâmetros que são importantes para controlar a assegurar reversibilidade. Outros métodos tais como a injecção s iontoforéticofo r também estão disponíveis, mas a dinâmica de difusão do líquido são diferentes em relação a injecção de bolus, reduzindo a gama potencial de inactivação. Estes métodos possuem a vantagem de ter um padrão de difusão esférica em oposição ao padrão elíptico observado para micro-injecções 7. Assim, a escolha do método de inactivação deverá ser prevista de acordo com a região alvo e o desenho experimental. Embora existam alternativas comerciais, o protocolo proposto proporciona um modo eficiente de controlar a entrega de substância farmacêutica, bem como para permitir um elevado grau de personalização custo. Essa liberdade na elaboração do dispositivo de injecção é favorável a uma ampla gama de flexibilidade experimental e ajuste para contextos de aplicação específicos.
No que diz respeito ao protocolo proposto, o passo crítico é o processo de enchimento a pipeta de vidro. As bolhas de ar devem ser evitados, como compressão de ar tornará o monitoramento das injetadovolumes intratáveis. Uma resistência muito mínimo também deve ser sentida quando é empurrado manualmente líquido através da pipeta, confirmando livre fluxo no sistema. Uma ausência de líquido com injeção manual podem indicar um vazamento no sistema ou preparação pipeta incorreta, resultando em uma ponta obstruído. A impedância da pipeta também deve ser medido a fim de obter o registo electrofisiológico tipo desejado (LFP, potenciais evocados, atividade de unidades múltiplas, etc.), como tamanhos maiores pontas irão resultar em impedâncias mais baixas.
Se a injecção for bem sucedida, um volume de 400 a 800 nl da solução de 300 uM de GABA ou a solução de lidocaína a 2% é suficiente para abolir a actividade de cravação. Para se ter uma ideia da injecção de espalhar no espaço e no tempo, ágar pode ser usado para simular o tecido nervoso. A propagação da injecção pode então ser facilmente observada com uma solução CSB. Depois de simulações, é essencial para a caracterização injecção espalhar histologicamente através do uso of corantes como CSB, por autorradiografia usando drogas radiomarcados ou usando abordagens metabólicas, tais como auto-radiografia glicose proxies como indiretos para medir a ativação ou inativação da atividade neural 1.
Também é importante notar que as injecções rápidas (≥100 nl / min) irá provavelmente resultar em lesões que fazem reversibilidade completa inatingível. Uma grande vantagem do protocolo proposto é o potencial de integração do sistema de injecção com um software que feedback em controlar a taxa de injecção de um conjunto de nível de actividade neuronal. Tal implementação, permitiriam aos pesquisadores concentrar-se na inativação (ou ativação) em vez de parâmetros em parâmetros técnicos, tais como taxas de injecção ou volumes ao entregar apenas o direito quantidade de droga para a aplicação considerada. Isso seria minimizar o deslocamento da sonda através da otimização do volume de droga necessária, para permitir mais controle sensível ao tempo da entrega da droga, favorecer reprodutibilidade e todosow comparação direta pareado de dados.
Esta técnica combina um sistema de distribuição de substâncias e gravação de sinais eletrofisiológicos. Nós demonstrou a sua eficácia, utilizando a capacidade de gravação de nosso pipeta para localizar funcionalmente o colículo superior através da indução de trens de actividade multi-unidade usando o flash estímulos 11. Durante inativação, a atividade multi-unidade diminuída e recuperou gradualmente após a compensação de injeção. Técnicas de inativação reversíveis, tais como a apresentada aqui, fornecer vantagens consideráveis sobre técnicas de lesões mecânicos ou químicos que fornecem recuperação falta ou deficiência de 3. Técnicas de inativação reversíveis reforçar a significância estatística de experimentos desde comparações pareadas são possíveis 3, eliminando assim diferenças idiossincráticas. Nós desenvolvemos uma técnica de custo eficiente e personalizável que permite o controle preciso sobre a duração da distribuição de substâncias ea robustasondagem de uma área de alvo cerebral.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
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