Abstract
Aquí se describe un método para la construcción de un solo uso "injectrode" utilizando piezas comercialmente accesibles y asequibles. Un sistema de sondeo fue desarrollado que permite la inyección de un medicamento durante la grabación de señales electrofisiológicas de la población neuronal afectada. Este método proporciona una alternativa sencilla y económica a las soluciones comerciales. Una pipeta de vidrio se modificó mediante la combinación con una aguja hipodérmica y un filamento de plata. El injectrode está unido a la bomba microjeringa comercial para la administración de fármacos. Esto resulta en una técnica que proporciona retroalimentación farmacodinámica en tiempo real a través de señales extracelulares de unidades múltiples originarios desde el sitio de administración de fármacos. Como una prueba de concepto, se registró la actividad neuronal del colículo superior provocada por destellos de luz en ratas, concomitantemente con la entrega de medicamentos a través de la injectrode. La capacidad de grabación injectrode permite la caracterización funcional de la injEl sitio de reflexión favoreciendo un control preciso sobre la localización del suministro del fármaco. La aplicación de este método también se extiende mucho más allá de lo que se ha demostrado aquí, como la elección de la sustancia química cargado en el injectrode es vasto, incluyendo rastreo de marcadores para experimentos anatómicos.
Introduction
La inactivación de áreas corticales y núcleos subcorticales es importante en el estudio de las relaciones funcionales entre varias estructuras cerebrales 2-4. La literatura reciente ha empleado química de pérdida de función o técnicas criogénicas para estudiar el papel de las estructuras cerebrales 2,5. En lo que se refiere a las microinyecciones farmacológicas, pequeños volúmenes de medicamentos pueden ser administrados en una región del cerebro a una velocidad controlada y reducir al mínimo el daño colateral al tejido circundante 6,7. Esta técnica se puede utilizar para entregar agonistas específicos, agonistas inversos o antagonistas para estudiar el efecto de diferentes dianas farmacológicas sobre la actividad neuronal. Estos efectos también se pueden estudiar mediante la medición de cambios en las respuestas neuronales desde lugares distantes, lo que permite a los investigadores estudiar las relaciones entre las diferentes estructuras corticales y subcorticales.
Aquí, nos demuestran el montaje de un dispositivo, el injectrode, capaz de boº grabación de señales electrofisiológicas y entregar pequeñas cantidades de drogas en el lugar de destino. Se demuestra las capacidades de este sistema mediante la inyección de GABA, un inhibidor de la actividad neuronal común, en la rata colículo superior. Esta región es sensible a la estimulación visual, que nos permitió utilizar la actividad multiunit evocado visual para confirmar la localización injectrode. La reversibilidad de la inactivación se evaluó por la recuperación de la actividad neuronal normal tras el final de la inyección GABA.
La capacidad de controlar la actividad de varias unidades de la zona de la inyección permite la puesta a punto de las tasas de inyección y los volúmenes necesarios para lograr la respuesta farmacodinámica deseada. Por lo tanto, una ventaja de esta técnica es el potencial de limitar el daño tisular causado por microperfusión, ya que se inyectan los más pequeños volúmenes efectivos. El protocolo propuesto proporciona un método rentable para generar la necessar hardware desechabley para la realización de experimentos donde se desea la administración de fármacos y la grabación de la actividad neuronal local.
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Protocol
NOTA: Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense para la Protección de los Animales y de la junta de revisión de Ética de la Universidad de Montreal.
1. Asamblea de la pipeta de grabación por inyección
- Tire de un capilar de vidrio de aproximadamente 7 cm de largo (1 mm de diámetro exterior) con un extractor pipeta.
- Romper la punta del capilar y compruebe la abertura con un microscopio óptico. Confirmar que el diámetro interior es de entre 30 micras a 40 micras.
- Insertar un alambre de plata 7 cm de largo en el capilar de vidrio con aproximadamente 1 cm que sobresale del extremo no ahusada de la pipeta de vidrio.
- Doble el exceso de filamento ortogonal al capilar de vidrio.
- Aplicar una gota de adhesivo de plástico flexible en el eje de una aguja hipodérmica 30 G.
- Inserte una aguja hipodérmica 30 G en la pipeta de vidrio de acuerdo con los esquemas presentados en la Figura 1
- Añadir un segundo recubrimiento de pegamento para asegurar un sellado adecuado de la unión entre la pipeta de vidrio y la aguja hipodérmica.
- Deja la pipeta para secar con la punta hacia arriba durante aproximadamente 12 horas para asegurar un curado adecuado de la cola. El resultado final se muestra en la Figura 2.
NOTA: Este procedimiento se realiza en experimentos agudos y esterilización de la punta de la pipeta no es necesario.
2. Preparación de los animales
- Coloque la rata en una caja de la anestesia.
- Inducir la anestesia utilizando 4% isoflurano por 5 a 10 minutos.
- Colocar el animal sobre una mesa estereotáxica con el cojín de calefacción y sonda rectal para mantener una temperatura corporal de 37 ° C. Use un cono de la nariz para mantener la anestesia con isoflurano 2%. Asegure la cabeza de la rata utilizando barras de oído y titular de los dientes.
- Aplicar pomadas o gotas oftálmicas oculares, que incluyen 1% atropina gotas para ayudar en la dilatación de la pupila. Para evitar la sequedad, aplicar lubricante gotas aproximadamente cada 30 min.
- Afeitarse la cabeza y límpielo con un 10% de povidona-yodo.
- Para anestesia local, inyectar 0,5 ml de lidocaína al 2% bajo el cuero cabelludo en 2-3 ubicaciones levantando la piel y la inserción de la punta de la aguja.
- Confirmar nivel adecuado de anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie y la observación de la falta de movimiento. Además, controlar la frecuencia cardíaca para asegurar que está dentro de los valores normales (300 a 400 latidos / min).
- Incisión en el cuero cabelludo en una línea recta a lo largo de la mediana con una cuchilla de bisturí # 10 para exponer tanto las suturas coronal y sagital.
- Revela los puntos Lambda y bregma por empujar a un lado el tejido que cubre el cráneo con una espátula quirúrgica.
- Nivelar el cráneo de modo que las posiciones de bregma y lambda están en el mismo plano.
- Para establecer el punto de referencia, utilice un dispositivo estereotáxico con un tubo de vidrio montada para configurarlo justo encima Bregma. Este será el "cero" para el antero-posterior y medmediciones ial-laterales coordenadas.
- Establecer el lugar de interés moviendo el estereotáxica montaje a las coordenadas necesarias, tenga en cuenta las coordenadas estereotáxicas y dibujar un cuadrado alrededor de la zona objetivo que marca donde se realizará la craneotomía.
- Use un taladro con una broca quirúrgica esterilizada a lo largo del marcado plaza lentamente y sin presión para eliminar lentamente el material óseo. Tenga cuidado de no perforar demasiado tiempo en la misma zona, ya que producirá calor y causar lesiones en la corteza.
- Cuando el hueso que delimita la craneotomía se ha convertido en lo suficientemente delgada, retire con cuidado la sección craneal con pinzas para exponer la corteza.
- Irrigar frecuentes la corteza expuesta con líquido cefalorraquídeo artificial para evitar la desecación de los tejidos.
NOTA: la eliminación mater Dura es innecesario en la rata como la punta de la injectrode es lo suficientemente resistente como para penetrar.
3. Llenar y Montaje del Sistema de Inyección
- Llenar el5-10 l microjeringa por aspiración con aceite mineral.
- Llene la aguja hipodérmica con la pipeta de vidrio fijo con una solución de 0,5% Chicago Sky Azul (CSB) y 300 M-γ aminobutírico (GABA) o una solución de lidocaína al 2% con 0,5% CSB 9. Diluir todas las soluciones con solución salina.
- En el caso de una sustancia abundante, llenar utilizando una jeringa regular y utilizar las técnicas habituales de precaución para evitar la formación de burbujas de aire.
- En el caso de las sustancias más caras, utilice aceite mineral para llenar el injectrode y el agente químico puede ser introducido por aspiración. Como la diferencia de densidad entre el aceite mineral y el agua es relativamente alta, esta sustancia es un buen candidato para la inyección de soluciones acuosas.
NOTA: Un colorante puede ser añadido a confirmar la separación entre ambos líquidos.
- Para llenar la pipeta de inyección, llenar una jeringa de 1 ml con la solución por aspiración y luego inyectar lentamente la soluciónen la pipeta de inyección.
- Prestar especial atención para detectar fugas en las regiones indicadas en la Figura 1 en muestras de secreciones estas áreas limpias y la observación de fugas mediante la inyección aún más la solución lentamente con la jeringa.
- Retire la jeringa de 1 ml. Al hacerlo, asegúrese de mantener una ligera presión sobre el émbolo para que el vacío no elimina la solución de la pipeta de inyección.
- Llene el microjeringa con aceite mineral por aspiración y adjuntarlo firmemente a la pipeta de inyección lleno, a continuación, limpie cuidadosamente cualquier exceso de solución de la injectrode montado con una gasa.
- Verifique que la punta no está bloqueada mediante la inyección de un volumen muy pequeño, lo suficiente para ver una pequeña formación en la punta de la pipeta de vidrio gota.
- Monte el injectrode en el sistema microbomba y asegurarse de que está bien fijada.
- Coloque con cuidado la punta injectrode en las coordenadas de destino y de bajar la punta a la superficie de la corteza.
- Baje lentamente la injectrOda usando el aparato estereotáxico a la estructura objetivo (colículo superior en este caso) utilizando las coordenadas anatómicas apropiadas.
- Cubra la corteza expuesta con agar caliente para evitar la desecación de los tejidos.
4. Inyección y inactivación reversible
- Ajuste la bomba de microinyección para inyectar 400 a 800 nl a 40 nl / min y pulse Ejecutar para iniciar la inyección. Tenga en cuenta que la tasa pico mostrará reducción durante la inyección.
NOTA: En la configuración experimental, la actividad neuronal se recuperó dentro de una hora después del final de la entrega de GABA. Cualquier dispositivo mecánico calibrado se puede utilizar para aplicar presión en la jeringa la microinyección con el fin de llevar a cabo la inyección. - Después de la adquisición de los datos electrofisiológicos, la eutanasia utilizando un método aprobado por la Comunidad de Ética Animal local.
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Representative Results
La construcción de la injectrode se ilustra en la Figura 1. Un alambre de plata (C) se alimenta a una pipeta de vidrio (D) con una porción de la alambre doblado y que sobresale hacia fuera de la abertura. Una aguja de 30 G (B) se une y se sella a la abertura de la pipeta de vidrio con pegamento. Después de la pipeta se ha llenado con la sustancia de la inyección, una jeringa micro de vidrio (A) está unido a la aguja. Es importante que haya un buen cierre hermético, donde la jeringa micro conecta con la aguja (E) y donde el alambre de plata sobresale de la pipeta de vidrio (F). La figura 2 muestra una fotografía de lo que el injectrode parece después de completar el montaje.
Actividad multiunit visualmente evocado se obtuvieron en el colículo superior siguiente un flash de 300 ms para el ojo contralateral como se ilustra en la Figura 3. Tras la inyección de GABA, Rematar actividad en respuesta a un estímulo de flash fue suprimida. visualmenteactividad multiunit evocado normalmente regresó de entre 45 a 60 minutos después de la inyección ha cesado.
La Figura 4 ilustra la configuración del sistema de microinyección. El controlador de la bomba de inyección permite al usuario especificar la configuración para la inyección. Un conector eléctrico conecta el resorte de alambre de plata que sobresale de la pipeta de vidrio. El conector lleva a una etapa de la cabeza con electrodos de tierra y de referencia y luego conectado a un amplificador. Un convertidor analógico / digital de interfaz (A / D) se usa para adquirir los datos electrofisiológicos, y un altavoz se utiliza para el control de audio complementaria de la actividad neuronal.
Figura 1:. Representación esquemática del conjunto de injectrode Una jeringa micro (A) está unido a la pipeta de grabación por inyección que consisten en un 30 G hypodermic aguja (B) se adhirieron a un alambre de plata (C) dentro de una pipeta de vidrio (D). Regiones en círculos (E - F) zonas de altas luces que pueden ser susceptibles a fugas.
Figura 2: Una foto de la pipeta construido utilizando una aguja de 30 G (B), pegamento adhesivo resistente al agua (F), un alambre de plata (C) y una pipeta de vidrio (D).
Figura 3: Una ilustración del efecto inhibidor de la inyección de GABA (300 mM) en evocados visualmente actividad multi-unidad en el colículo superior, las flechas indican inicio flash. Eléctricoseñales de AL se filtraron usando un filtro de paso de banda establecido entre 30 y 3000 Hz.
Figura 4: Representación esquemática del sistema de micro-inyección completa.
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Discussion
El protocolo propuesto fue diseñado para resolver los retos derivados de los actuales métodos de inactivación reversible. En concreto, este proyecto destinada a perfeccionar los métodos utilizados para microinyecciones químicas de las sustancias que modulan la actividad neuronal, particularmente en las estructuras profundas del cerebro. Un reto técnico que emerge de este tipo de configuración es la necesidad de ambas sondas a ser colocalized en el mismo espacio restringido in vivo a fin de obtener grabaciones precisas en el sitio de inyección. Este problema se puede superar mediante el uso de dispositivos, tales como el presentado aquí, que son capaces tanto de inyección y la grabación en el mismo sitio. Los métodos alternativos incluyen el uso de dispositivos basados en pulsos de presión de gas. Estas herramientas han estado disponibles durante muchos años, pero el uso de un intermedio compresible reduce el control sobre los precios y volúmenes de inyección, dos parámetros que son importantes para controlar para asegurar la reversibilidad. Otros métodos tales como la inyección iontoforético sISTEMAS también están disponibles, pero la dinámica de difusión del líquido son diferentes en comparación con la inyección en bolo, reduciendo el rango potencial de inactivación. Estos métodos tienen la ventaja de tener un patrón de difusión esférica en comparación con el patrón elíptico observado para micro-inyecciones 7. Por lo tanto, la elección del método de inactivación debe planificarse de acuerdo con la región diana y el diseño experimental. A pesar de que existen alternativas comerciales, el protocolo propuesto proporciona una manera eficiente costo de seguimiento de la entrega de sustancia farmacéutica, así como permitiendo un alto grado de personalización. Tal libertad en la elaboración del dispositivo de inyección a favor de una amplia gama de flexibilidad experimental y puesta a punto para los contextos específicos de aplicación.
Con respecto a la propuesta de protocolo, el paso crítico es el proceso de llenado de la pipeta de vidrio. Las burbujas de aire deben ser evitados, como la compresión de aire hará que el seguimiento de inyectadovolúmenes intratables. Una resistencia muy mínima también se debe sentir al empujar manualmente líquido a través de la pipeta, lo que confirma el flujo libre en el sistema. Una ausencia de líquido con inyección manual puede indicar una fuga en el sistema o la preparación de la pipeta incorrecta resulta en una punta obstruida. La impedancia de la pipeta debe medirse también con el fin de obtener el tipo deseado registro electrofisiológico (LFP, potenciales evocados, la actividad de unidades múltiples, etc.), como puntas de mayor tamaño se traducirá en impedancias inferiores.
Si la inyección es exitosa, un volumen de 400 a 800 nl de la solución mu M GABA 300 o la solución de lidocaína 2% es suficiente para abolir la actividad de clavar. Para tener una idea de la inyección extendido en el espacio y el tiempo, agar puede ser utilizado para simular el tejido nervioso. La difusión de la inyección puede ser fácilmente observado con una solución CSB. Después de simulaciones, es esencial para caracterizar inyección difundir histológicamente mediante el uso of colorantes tales como CSB, por autorradiografía usando medicamentos radiomarcados o mediante el uso de enfoques metabólicos como la autorradiografía glucosa proxies como indirectos para medir la activación o inactivación de la actividad neuronal 1.
También es importante tener en cuenta que las inyecciones rápidas (≥100 nl / min) probablemente resultará en lesiones haciendo completa reversibilidad inalcanzable. Una ventaja importante del protocolo propuesto es el potencial de integrar el sistema de inyección con un software que le-control de realimentación de la velocidad de inyección para un conjunto nivel de actividad neuronal. Tal aplicación permitiría a los investigadores se centran en la inactivación (o activación) parámetros en lugar de en los parámetros técnicos, tales como tasas de inyección o volúmenes, mientras que la entrega solamente la cantidad correcta de medicamento para la aplicación considerada. Esto minimizaría el desplazamiento de la sonda mediante la optimización del volumen de drogas es necesario, permite un mayor control sensible al tiempo de la administración de fármacos, favorecer la reproducibilidad y todoscomparación ujo directo emparejado de datos.
Esta técnica combina un sistema para la entrega de sustancias y grabación de señales electrofisiológicas. Hemos demostrado su eficacia mediante el uso de la capacidad de grabación de nuestra pipeta para localizar funcionalmente el colículo superior mediante la inducción de los trenes de la actividad de varias unidades de flash utilizando estímulos 11. Durante la inactivación, la actividad de múltiples unidades disminuyó y se recuperó gradualmente después de compensar la inyección. Técnicas de inactivación reversibles, tales como el presentado aquí, proporcionan considerables ventajas sobre las técnicas de lesiones mecánicas o químicas que proporcionan la recuperación ausente o pobre 3. Técnicas de inactivación reversible refuerzan la significación estadística de los experimentos ya que las comparaciones pareadas son posibles 3, eliminando de esta manera las diferencias idiosincrásicas. Hemos desarrollado una técnica eficiente y adaptable costo que permite un control preciso sobre la duración de la entrega de sustancias y la robustasondeo de un área cerebral objetivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection pump (UltraMicroPump III) | WPI | #UMP3 | |
| Injection console (Micro4 Controller) | WPI | #SYS-MICRO4 | |
| Hamilton syringe | Hamliton | (80301) 701LT 10 µL SYR | Syringes between 5 and 10 μl used |
| Flexible plastic adhesive | Lepage | 393915 | The gel form is easier to apply to the shaft of the 30 G hypodermic needle forming a waterproof seal when dry. |
| Glass pipettes | WPI | #TW100F-4 | Thin wall, 1 mm OD, 0.75 mm ID with filament pipettes used |
| 720 Needle Pipette Puller | Kopf | 720 | |
| Silver wire | A-M Systems, Inc. | 782500 | Bare 0.010” |
References
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