Isolering og Immortalisering af Patient-afledte cellelinjer fra muskelbiopsi for Disease Modeling

Protocol

BEMÆRK: Protokoller for indsamling af humant væv skal gennemgås og godkendes af Institutional IRB udvalget. Indsamling af kasserede, de-identificerede humant væv er blevet godkendt af Boston Børnehospital og Brigham and Women 's Hospital IRB udvalg. De nedenfor beskrevne metoder er blevet anvendt til isolering af myogene celler fra de-identificeret, kasseret væv. De beskrevne metoder kan anvendes for væv opsamlet fra samtykket patientmateriale.

1. celleisolering

1. Dissociation af muskel biopsi og oprensning af myogene celler
   1. Pre-vejer en 10 cm vævskulturplade i en vævskultur biosikkerhed hætte, og derefter igen vejes på underkanten af ​​muskel biopsi for at beregne mængden af ​​væv, der skal adskilles.
   2. Brug sterile skalpeller, hakkekød muskelvæv fint og tilsæt et par dråber sterilt 1x HBSS for at forhindre væv tørrer ud.
   3. Tilføj 3,5 ml af hver af dispase II og collagenase D per gram muskel væv, der skal fordøjes. Pipette hakket væv og enzymopløsning gennem et sterilt 25 ml pipette et par gange. Inkubér pladen i en vævskultur-inkubator ved 37 ° C med 5% CO ₂ i 15 minutter og fordøje væv, indtil opslæmningen let passerer gennem et sterilt 5 ml pipette.
      BEMÆRK: Tissue dissociation opnås sædvanligvis ved enzymatisk nedbrydning inden 45-90 min. Der henvises til 'Repræsentative resultater' for yderligere detaljer.
   4. Tilsæt 2 volumener sterilt vækstmedium til dissocieret væv og filtreres gennem en 100 um cellefilter i et 50 ml konisk rør og pellet celler i 10 minutter ved 329 xg (~ 1100 rpm), stuetemperatur. Der henvises til Materials Table for medier sammensætning.
   5. Pellet resuspenderes i 1 volumen sterilt vækstmedium og tilføje 7 volumener af røde blodlegemer lyseopløsning. Opløsningen filtreres gennem en 40 pm cellefilter, så pellet than celler i 10 minutter ved 329 xg, stuetemperatur.
   6. Tæl cellerne i et hæmocytometer og resuspender cellerne i 1x HBSS 0,5% BSA i en koncentration på 1 x 10 ⁶ celler / 100 pi. Afsæt ~ 250.000 celler i et enkelt rør, der vil blive anvendt som en negativ (ufarvet) kontrol. Braklægning yderligere ensfarvede farvede rør til propidiumiodid og for CD56 kontrol, som er nødvendige for korrekt gating af CD56 positive celler ved FACS sortering. Der henvises til celle sortering manualer eller rådføre sig med FACS sortering Core Facility eksperter for at sikre passende kontrol er inkluderet.
   7. Stain cellerne, der skal sorteres med 5 pi / 10 ⁶ celler af anti CD56 antistof. Inkuber alle prøver (inklusive kontroller) på is i 30 minutter.
   8. Vask prøverne i 10 ml 1x HBSS og pellet celler i 10 minutter ved 329 xg (~ 1100 rpm) i en afkølet centrifuge, 4 ° C temperatur.
   9. Tilføj propidiumiodid ved en slutkoncentration på 1 pg / ml til prøven for at være sorTed for udelukkelse af døde celler. Oprens myogene CD56-positive celler fra ikke-myogene celler under anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering.
2. Dissociation af hudbiopsi
   BEMÆRK: Dermal fibroblaster kan isoleres fra en hud punch fra patienter, når muskelbiopsier er ikke tilgængelige. Dermale fibroblaster kan anvendes som biomateriale til mange undersøgelser, herunder transduktion med MyoD at generere myogene celler. Derudover kan dermale fibroblaster anvendes til at generere iPS-celler, som kan opdeles i forskellige celletyper til yderligere undersøgelse.
   1. Transportér hudbiopsi til laboratoriet i transport medium. Når prøven er modtaget, udfører den primære kultur så hurtigt som muligt. Hvis der ikke kan etableres den primære kultur på samme dag, opbevares prøven ved stuetemperatur natten over.
   2. Overfør hudbiopsi til en steril 35 mm petriskål i laminær strømning.
   3. Skyl hudbiopsi i en petriskål med steril 1X PBS for at fjerne blod og snavs. Fjern fedtvæv med en steril skalpel.
   4. Tilsæt 2 ml collagenase opløsning og hakke vævet med skalpel, inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter til 1 time, afhængigt af størrelsen af ​​vævet.
   5. Overfør det fordøjede væv til et 15 ml konisk rør skylles petriskål med 2 ml fibroblast dyrkningsmedium to gange, og indsamle mediet i det samme rør.
   6. Pelletere cellerne ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
   7. Supernatanten fjernes, og vaske pelleten med 3 ml fibroblast medium for at fjerne collagenase og derefter pellet celler igen. Der henvises til Materials Table for medier sammensætning.
   8. Gentag trin 1.2.7 en gang mere.
   9. Resuspender pellet i 5 ml fibroblast medium og plade celler på en T25 steril vævskulturkolbe. Inkubér kolbe ved 37 ° C med 5% CO _2.
   10. Vurdere kultur for fibroblast fastgørelse og vækst i de kommende 1-3 dage. <br /> BEMÆRK: Nogle små væv stykker kan også vedhæfte til pladen og fibroblaster migrere ud af disse væv stykker.
   11. Oprethold kulturen under de samme betingelser, indtil fibroblaster dyrkes til ca. 80% konfluens.
   12. Saml fibroblaster ved trypsinisering og overføre på friske dyrkningskolber for yderligere ekspansion. Udfør trypsinisering ved vask af kulturerne 3 gange i 1 x PBS uden Ca ⁺⁺ og Mg ^++. Tilføj Trypsin-EDTA (se Materialer Table) til cellerne (2 ml / T25 kolbe) i 2 minutter ved 37 ° C.
   13. Split løsrevne celler i yderligere kolber. Hvis nogle væv stykker forbliver knyttet til den oprindelige T25 kolber, tilsættes 5 ml frisk dyrkningsmedium til denne kolbe og flere fibroblaster vil migrere ud løbende.
       BEMÆRK: Den udvidede fibroblast kultur kan fryses ned som P1 og opbevares i flydende nitrogen for fremtidige eksperimenter.

2. Immortalisering af myogene celler

1. Feed-celler 30 minutter før transfektion med 5 ml frisk medium suppleret med 10 mM koffein.
2. Homogeniseres en blanding af 2 ug plasmid-DNA fra en midi prep (CDK4 eller hTERT plasmid) og Polyjet og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter som anbefalet af fabrikanten.
3. Tilføj plasmidet / Polyjet blanding til PE-celler natten over.
4. Feed celler med frisk medium (DMEM og Medium 199 i et forhold på 4: 1, suppleret med 10% kalveserum). Tolv timer senere, indsamle det virusholdige supernatant og filtreres gennem et 0,45 um porestørrelse.
5. Brug 1 ml opsamlet supernatant at inficere natten den amfotropiske pakningscellelinie PA317 ⁵ og opnå en stabil virus-producerende cellelinie efter selektion med enten 0,5 mg / ml neomycin (G418) til CDK4 eller 0,5 mg / ml hygromycin for hTERT.
6. Forbered arbejdet virale supernatanter ved at dyrke de stabile emballage celler til nær konfluens, så høste supernatanten hver morgen, aften og morgen for tre høstår.
7. Filter virale supernatanter og enten direkte bruge eller opdele dem i 1 ml prøver og opbevares ved -80 ° C til senere brug. Bemærk, at viral supernatant mister 50% infektionseffektivitet med hver fryse-tø. Husk at blege-vask før deponering alt det har rørt de virale partikler.
   BEMÆRK: Den stabile PA317 virus-producerende cellelinie kan fryses og holdes ved -150 ° C til permanent lagring (frysemedium 10% DMSO; 90% serum).
8. Plate FACS-oprensede myogene celler (beskrevet i trin 1,1-1,9) ved en densitet på 5 x 10 ⁴ celler / brønd i 6-brønds plader coatet med 0,1% gelatine. Kontroller, at cellerne er bundet til pladen, før der fortsættes med virusinfektion.
9. Tilføj 400 pi filtreret, freshly produceret viral supernatant eller frosne portioner til hver seks brønde natten over (hold 2 brønde som kontroller).
10. Skift medium ved fodring celler med 2,5 ml / brønd af frisk muskel medier (4: 1 Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) og Medium 199 suppleret med 15% føtalt bovint serum, 0,02 M HEPES-buffer, 1,4 mg / L vitamin B12 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L dexamethason, 2,5 ug / l hepatocytvækstfaktor og 10 ug / L basisk fibroblastvækstfaktor). Kassér medierne og pipetter, der indeholder de virale partikler i en blegemiddel beholder. Lad celler i det samme medium i 3 dage at komme sig efter infektion, så behandle for udvælgelse ved hjælp af enten 400 pg / ml neomycin (CDK4 infektion) eller 300 ug / ml hygromycin (hTERT infektion).
11. Oprethold celler under lægemiddel-selektion, indtil cellerne i kontrolgruppen skålen matricen (1-2 uger).
12. Passage celler, før de bliver sammenflydende (60-80% konfluens, anvendelse af 0,05% trypsin EDTA), selv under selectipå perioden. Udpladning celler i flere 10cm retter med frisk myoblast medium (som beskrevet i 2.11) suppleret med udvælgelsen lægemidlet. Oprethold udødeliggjorte valgte celler som en heterogen population eller klone at opnå en helt homogen genetisk baggrund (samme insertion af transgenet i hver celle).
13. Udfør klonselektion hjælp af følgende trin:
    1. Seed cellerne ved lav densitet (f.eks 300 til 500 celler i 10 cm skåle), og opretholde dem i cirka to uger, indtil små kolonier dannes (10-20 celler).
    2. Fjern det meste af mediet på dette tidspunkt, hvilket kun efterlader en tynd film for at forhindre cellerne i at tørre ud.
    3. Placer en kloning ring (med den ene ende dyppet i silikone vakuum fedt) over hver ønsket klon og tilsæt et par dråber trypsin / EDTA.
    4. Harvest celler når de bliver afrundet ved omhyggeligt opsugning af celler under anvendelse af en 1 ml spids eller en Pasteur-pipette og overføre dem til den mindste tilgængelige flerbrøndspladens plaTE (96 eller 48, 24 eller 12 brønde).
    5. Expand kloner som nødvendig for at forhindre lokal konfluens.

Representative Results

Figur 1 illustrerer nogle af de vigtigste trin i den primære væv dissociation: det nøjagtige beløb af væv afvejes i en steril vævskultur petriskål (figur 1A, B). Vævet derefter fint hakket med sterile skalpeller, indtil et væv opslæmning opnået (figur 1C, D). Efter tilsætning af fordøjelsesenzymer, er primært muskelvæv dissociation normalt ved enzymatisk nedbrydning inden 45-90 min. Progressionen af ​​vævsfordøjelse typisk overvåges hver 15-20 min for at forhindre overspaltning og celledød. Den enzymatiske fordøjelse kan være blidt pipetterede og blandet et par gange hver 15-20 min. Ved afslutningen af fordøjelsen trin cellerne filtreres gennem en 100 um (figur 1E, F) og derefter en 40 um filter. Afhængigt af mængden af ​​udgangsmateriale muskelvæv og om prøven er opnået fra mildt eller alvorligt ramte muskler, den dissocierede primære cells vil være uensartet. Figur 1G viser et eksempel af mononukleære celler i suspension umiddelbart efter fordøjelse, mens fig 1H viser et eksempel på dissocierede primære celler 3-6 timer efter spaltning og udpladning i vævskulturskåle. Myogene celler vil sædvanligvis blive blandet med fibroblaster og adipogeniske celler. Immune celler kan også være til stede i tilfælde, hvor inflammation er associeret med patientens sygdom. Derfor kan potentielle adskillelse af de forskellige celletyper være ønskelig. For potentielle isolering af humane myogene celler har CD56 eller N-CAM er ofte blevet brugt som en pålidelig markør ^6-9. Denne rensning kan være gavnligt kort efter isolation for berigelse af myogene progenitorer og forud for cellens immortalisering proces. Alternativt kan immortalisering af primære celler udføres ved først kan vælges derefter immortaliserede myogene celler baseret på ekspression af CD56 ved FACS. En skematisk påde nødvendige skridt før FACS-sortering og et eksempel på en FACS-profil er vist i figur 2. Kort fortalt primære celler tælles og resuspenderes i høj koncentration som anført, derefter tilsættes det primære antistof (dvs. anti CD56) til cellerne og inkuberet i 30 minutter på is. Efter en vask celler analyseres gennem en fluorescens-aktiveret cellesorterer og oprenset (figur 2) .Den omtrentligt udbytte af CD56 positive celler varierer fra prøve til prøve, der spænder fra 40-70% af de totale mononukleære celler. Udbyttet varierer afhængigt af alder for den enkelte og om myogene celler udvundet upåvirket eller syge muskel. Upåvirket muskel normalt høj procentdel af myogene celler, mens dystrofisk muskel ofte har lavere procentdele af CD56 positive celler. De oprensede celler udplades i komplet myogene vækstmedium (se Materialer tabel). Celler kan passeres ved trypsinisering, når de reakh 60-70% konfluens. CD56-udtrykkende celler er myogene og i stand til at danne myotuber in vitro ^10,11 .Den immortalisering af myogene celler kræver sekventiel transfektion af to gener ^12,13 (som skematiseret i figur 3). Cyclinafhængig kinase 4 (CDK4) anvendes til at overvinde stress af vævskultur på grund af utilstrækkelige dyrkningsbetingelser og human telomerase revers transkriptase (hTERT) forhindrer telomer forkortning grund udgangen replikation fænomen ^12. Både før virale plasmider er i pBabe backbone vektor. Musen CDK4 cDNA konstrukt indeholder neomycinresistensgenet og hTERT cDNA konstrukt indeholder den hygromycin-resistens-genet. Sidstnævnte indeholder også en herpes simplex virus thymidinkinase (TK) kassette og loxP-sites er placeret i begge ender af hTERT / TK kassette. Dette gør det muligt excision af hele udtrykket enhed ved Cre rekombinasen ¹⁴ og modselektion hjælp gancyclovir.

Nyligt immortaliserede celler kan opretholdes som en population, hvor virus er integreret i forskellige steder, eller klones til opnåelse af en helt homogen genetisk baggrund (enkelt indføring i cellen genom og dets afkom). I de fleste tilfælde isolere kloner fra en stor befolkning vil resulterer i mindre forskelle blandt kloner afhængigt indsættelse af kassetten i cellegenomet. Desuden vil omfattende vævskultur begunstige selektion af celler med vækst fordel snarere end dem, der differentierer. Jegtrøst af enkelte kloner gøres simpelthen ved at pode celler ved lav tæthed (f.eks: 300 til 500 celler i 10 cm skåle), og dyrkning for omkring to uger, indtil små kolonier dannes (10-20 celler). Det meste af mediet fjernes derefter, hvilket kun efterlader en tynd film for at forhindre cellerne i at tørre ud. Kloner trypsiniseret ved anvendelse af kloningsringe og derefter udvides efter behov. Udvidet immortaliserede kloner kan testes for ekspression af fælles myogene cellemarkører, såsom CD56 ved FACS, desmin og MyoD ekspression ved immunofluorescens eller myotube dannelse efter differentiering. Myorør er mest tydelige, når sammenflydende myogene celler (90% konfluens) anbringes i differentiering medium (DMEM og Medium 199 i et forhold på 4: 1, suppleret med 2% hesteserum) efter 3-5 dage (figur 4). Ingen forskelle blev set i myotube dannelse og i myotube sammentrækning evne mellem ikke-immortaliserede kontrol celler og immortaliserede celler (Videoer 1 og 2).

(figur 5). Eksempler på vækstkurver er vist i figur 5A, hvor telomer forkortning blev observeret celler blev ekspanderet til udvidet antal passager. Omvendt er vellykket immortalisering forbundet med forøget telomerase-aktivitet (figur 5)

Figur 1:.. Illustrationer af kritiske trin for dissociation af primære humane muskelvæv (A) Vejning af den tomme kultur plade, før væv placering og (B) efter placering af væv (C) Sterile skalpeller bruges til at hakke den væv, indtil (D) vævet detselv er reduceret til en opslæmning. Collagenase og dispase tilsættes, og væv er fordøjet i 45-90 minutter, derefter fordøjelse filtreres gennem en nylon mesh filter for at skille debris (E, F). (G, H) eksempler på frisk dissocierede celler udpladet umiddelbart efter dissociation (G ) eller 3 timer efter dissociation, hvor primære celler begynder at afvikle (H).

Figur 2:. Workflow procedurer, der er involveret i human myoblast farvning før oprensning via fluorescens cellesorterer De kritiske trin til farvning af humane celler, før FACS-analyse er fremhævet. Eksempler på FACS plots er også vist. Den negative kontrol (venstre panel) bruges til at etablere sorteringen gate. I de rigtige paneler, er positive celler, der udtrykker CD56 gated og Percentage af positive celler er vist. Denne strategi kan anvendes til at oprense myogene celler enten før immortalisering eller efter immortalisering procedure.

Figur 3: Skematisk af virus produktion myoblast immortalisering. Workflow af retrovirus produktionen bruges til at udødeliggøre myoblaster. En plasmidkonstruktion indeholdende enten CDK4 eller floxed hTERT-TK kassette i en pBabe backbone (venstre) transficeres ind i Phoenix ecotrope (PE) pakkecellelinie natten over (8-12 timer) under anvendelse af Polyjet. Supernatanten overføres derefter efter filtrering på Phoenix amfotrope pakkecellelinie (PA317). Supernatanten fra disse celler kan enten anvendes direkte, eller cellerne kan vælges med enten neomycin eller hygromycin at generere en stabil cellelinie til fremtidig brug. Portioner af filtob- supernatant kan opbevares ved -80 ° C til senere brug (med en tabt 50% effektivitet). Bleach bruges til at rense hver forbrugsmaterialer, der anvendes på alle punkter i proceduren.

Figur 4:. Skematisk af reversibel myoblast immortalisering Workflow af immortaliseringen procedure (øverst): Primære celler først transficeres med CDK4. Efter Neomycin udvælgelse, er myoblaster transficeret med et floxed hTERT kassette indeholder to udvælgelsesmarkører; HSV-TK og Hygromycin. Hvis det ønskes på et senere tidspunkt, kan hTERT kassetten "floxet" ud ved at udtrykke Cre-rekombinase og selektion for excision med gancyclovir. Dette gør det muligt "re-mortalization" af myoblaster og re-initiering af telomer afkortning. Hvis telomerer er 20 kb lange, dette stadig tillader hundreder af fordoblinger og undgår t han komplikation af overekspression af hTERT. Endelig kan isogene kloner fra immortaliserede population isoleres. Den myogenicity af de nyligt immortaliserede celler kan påvises ved hjælp af specifikke markører for muskelceller, såsom desmin (nederst til venstre panel, celler i vækstmedium farvet med anti-desmin, klon D33, grøn). Denne klon er så myogene at differentierede celler ses selvom celler holdes i proliferation betingelser. Når celler er differentieret i differentiering medium (med 2% hesteserum, midterste og højre paneler) myotube dannelse bliver meget omfattende. Næsten alle celler farvet med MF20 antistof til embryonale myosin-tung kæde (grøn) og myorør har flere kerner af DAPI farvning (blå, alle billeder). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

les / ftp_upload / 52307 / 52307fig5highres.jpg "/>
Figur 5: Kontrol af immortaliseringen procedure. (A) Vækstkurver for isogene kloner fra primær myoblast, udødelig befolkning (myoblast hTERT-CDK4) og re-mortalized klon (myoblast floxet hTERT-CDK4) er vist som eksempler. Ingen forskelle i vækstraterne var påviselige før cellerne når ældning. Telomer afkortning blev overvåget som en funktion af populationsfordoblinger og telomer længde blev målt ved TRF. (B) TRF vist eksempler på tidlige tidspunkter og sen replikation i myoblaster (5 tidspunkter fra PD 13-75), re-mortalized myoblaster efter hTERT excision (3 tidspunkter fra PD 62-152) og immortaliserede myoblaster (PD 75 og 200). (C) Vellykket hTERT infektion svarer til en stigning i telomeraseaktivitet. Telomerase-aktivitet blev vurderet ved ddTRAP (ddTRAP udlæsning, højre, kvantificering af assayet venstre) ¹⁵ i celler før og efter HteRT-infektion. hTERT excision afskaffet telomeraseaktivitet til den oprindelige tærskel set i myoblaster. Resultaterne er vist som total telomerase produkter genereret per celle ækvivalent (baggrund korrigeret). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Klik her for at se denne video.
Klik her for at se denne video.

Videoer 1 og 2. myorør blev genereret af celler før og efter immortaliseringen proces. Celler blev dyrket til konfluens i vækstmedier og skiftede til differentiering medier i 10 dage. I begge videoer funktionelle sammentrækninger af en eller flere myorør er påviselige. Optagelse af den spontane trækningerblev udført ved anvendelse af et 20X objektiv. Der blev ikke observeret nogen forskelle mellem udødeliggjorte og ikke-immortaliserede celler.

Discussion

Celler som en nyttig ressource

Isoleringen og kultur af myogene cellepopulationer er ekstremt nyttigt, når oprettelse sygdomsfænotyper eller in vitro modeller for sygdom. Den myogene celleisolering her beskrevne procedure tillader isolering af myoblaster og fibroblaster fra skeletmuskelceller prøver, som derefter kan opformeres, differentierede eller umiddelbart analyseres. Myoblast struktur og funktion kan vurderes ved en mikroskopisk undersøgelse, evaluering af cellernes overlevelse, evaluering af cellefusion eller gennem molekylære studier af RNA eller protein-ekspression. Derudover kan myoblaster differentieres i myorør som deler mange funktioner i umodne myofibre, hvilket tillader direkte vurdering af myoblast funktion i forbindelse med muskel udvikling og restitution efter vævsskade. Mens alle disse fænotyper tendens til at være temmelig reproducerbar i de tidlige passager i myogene celler adfærd mange primære myogenic cellelinier kan ændres i løbet af mange passager. Som et resultat, er det sommetider ønskeligt at udødeliggøre en given myogene cellelinie (som beskrevet her), hvilket kan lette den lette kultur etablering og generering af reproducerbare resultater over en længere periode.

Udvælgelse af bestemt celle populationer

Denne protokol beskriver isoleringen af ​​myogene celler fra skeletmuskelvæv anvendelse af FACS som rensning ordning. Den foreslåede strategi for udvælgelse celler omfatter brug propidiumiodid (en indikator for døde celler) og CD56 (en markør for myogene celler) for at differentiere levende, myogene celler fra døde celler, vragrester og ikke-myogene celler. Celler indeholdt i CD56 positive population omfatter myogene progenitorer stand til at danne myotuber, medens CD56-negative befolkning vil omfatte ikke-myogene celler, herunder fibroblaster og eventuelt adipogeniske celler. Hver af disse fraktioner kanvære uafhængigt dyrkes til at producere cellekulturer af myoblaster eller fibroblaster, og potentialet til at etablere parallelle fibroblast cellekulturer kan være nyttigt for uafhængige celle- eller DNA bank øvelser eller som yderligere betingelser for assays kontrol bliver udført på de myogene cellekulturer. Der er flere andre muligheder for valg af bestemte myoblastisk og fibroblastiske cellekulturer fra fordøjet muskelvæv, i tilfælde, hvor FACS sortering er uønsket eller utilgængelig, som er beskrevet andetsteds ^16,17. En alternativ metode til at separere myoblastisk og fibroblastceller involverer anvendelsen af ​​differentierede adhæsionsegenskaber mellem disse to celletyper at berige successive passager af celler for en given celletype. Som fibroblaster overholde plast meget lettere end myoblaster, så cellesuspensionerne inkubere på plast til ca. 1 time, der opretter eller passage cellerne og derefter plating supernatanten på en anden skål vil result i fjernelsen af mange fibroblaster fra cellesuspensionen ^18.

Utility af fibroblaster vs Myoblaster

Muskel biopsier fra patienter typisk anvendes til oprensning af primære muskelceller imidlertid syge myoblaster kan ikke proliferere effektivt og kan kun underkastes et par antal delinger in vitro, hvilket således kræver celle immortalisering at nå det høje antal delinger nødvendige. Eftersom både fibroblaster og myoblaster kan isoleres fra muskelbiopsier bør begge cellefraktioner blive frelst fra patientprøver, da de både kan være nyttig og tilbyde meget alsidighed til efterfølgende anvendelser. For eksempel kan fibroblaster anvendes til generering af inducerede pluripotente stamceller (iPSCs), som fastholder meget lovende til at generere ubegrænset celleantal og potentialet til at blive induceret til at differentiere til flere cellelinier. Disse funktioner er meget ønskeligt for celler opnået fra patients med sjældne sygdomme, som potentielt kan korrigeres in vitro eller anvendes i eksperimentelle narkotika screeninger i søgen efter terapeutiske forbindelser. Immortaliserede myoblaster kan også anvendes i lægemiddel-screening. Fibroblaster kan også effektivt omdannes til en myogenic skæbne ved infektion med et virus, der udtrykker MyoD ^19-21. Denne metode er blevet effektivt testet ved hjælp af fibroblaster udvundet fra patienter med muskelsygdomme og bekræftede, at MyoD-udtrykkende fibroblaster effektivt kan danne myotuber der udtrykker modne muskelproteiner. Således kan begge celletyper anvendes effektivt i flere efterfølgende anvendelser og giver uvurderlig materiale til diagnostiske og terapeutiske undersøgelser.

Virkningen af ​​Immortalisering

Immortaliseringen af ​​normale diploide celler gør det muligt at fremstille en stabil human cellelinie, som fuldt ud kan karakteriseres og undersøgt af mange forskellige laboratorier. Primære kulturer fra uafhængigeisolationer kan variere, og deres samlede proliferative kapacitet kan være variabel, når skaden er indført i dissociation processen eller ved overspaltning, som kan forvride adfærd kultur. Den immortalisering af celler ved hjælp af ekspression af den katalytiske underenhed af telomerase (hTERT) har den fordel at opretholde en stabil cellulær fænotype og celler forbliver diploid. Der har været rapporter i mus, telomerase kan modulere Wnt-vejen ^22. Vi har ikke observeret dette fænomen i humane celler. For at undgå en sådan potentiel komplikation er hTERT kassetten er flankeret med lox-steder, således at den kan fjernes efter telomerer er aflange. Lange telomerer giver hundredvis af ekstra divisioner, normalt tilstrækkeligt at udføre de fleste eksperimenter.

Fordi kontinuerlig celleekspansion altid giver en selektiv fordel for hurtig vækst, kan den cellulære fænotype lejlighedsvis blive forudindtaget grundet tilgroning af de mest hurtigt delendeceller snarere end de bedste differentierende celler. Mens dette endnu ikke har vist sig at være et væsentligt problem ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde, kan det afhjælpes ved at optø celler, der er blevet nedfrosset tidligt i deres kultur historie eller ved klonal selektion for de celler, der udviser den ønskede fænotype.

Endelig, da udvekslingen af ​​myogene celler til nær ubegrænset antal har fordele for narkotika screening og eventuel sygdom modellering, de nuværende teknikker har også iboende ulemper, der forhindrer brugen af ​​disse celler som terapeutiske køretøjer i celle-baseret behandling, eller som primære diagnostiske værktøjer. Både omfattende in vitro-dyrkning og immortalisering trin ændrer fænotypen af muskelceller i forhold til deres oprindelige tilstand. Det er vigtigt, er disse celler ekspanderes i et miljø, som er meget forskellig fra den naturlige miljø af primær satellit celler inden for deres niche. Derfor immortaliserede celler kræver intens test sikkerhed og muligvis udvikpment af nye teknikker, hvis de skal genindføres i human patients muskel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010