病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

Protocol

注：ヒト組織の収集のためのプロトコルを見直し、制度IRB委員会によって承認されなければならない。廃棄された、デ同定されたヒト組織の収集は、ボストン小児病院とブリガム·アンド·ウィメンズ病院IRB委員会によって承認されています。以下に記載される方法は、非識別破棄組織からの筋原細胞の単離のために適用されている。記載された方法は同意患者材料から採取した組織にも適用可能である。

1.細胞の単離

1. 筋生検と筋原細胞の精製の解離
   1. 組織培養バイオセーフティーフード内で10cmの組織培養プレートを、予め計量し、解離される組織の量を計算するために筋生検を含む再度計量プレート。
   2. 細かく、ミンチの筋肉組織を無菌メスを使用し、乾燥から組織を防ぐために、滅菌1X HBSSを数滴を追加します。
   3. 3.5ミリリットルのジのそれぞれを追加します。のSPase IIおよび筋組織のグラムあたりのコラゲナーゼDを消化する。無菌の25mlピペットを通して数回に細分化した組織と酵素溶液をピペット。 15分間、5％CO _2、37℃で組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートし、スラリーを簡単に無菌の5mlのピペットも通過するまで組織を消化する。
      注：組織の解離は、通常、45〜90分以内に酵素消化することにより達成される。詳細は、「代表的な結果」セクションを参照してください。
   4. 329 XG（〜1100 rpm）で、室温で10分間50ミリリットルの円錐管とペレットの細胞の上に100μmのセルストレーナーを通して解離した組織、フィルタに滅菌成長培地の2ボリュームを追加します。培地組成のための材料の表を参照してください。
   5. 滅菌増殖培地の1容積にペレットを再懸濁し、赤血球溶解液を7ボリュームを追加。 40μmのセルストレーナーを通して溶液をフィルタリングし、その後Tペレット329×gで、室温で10分間、彼は細胞。
   6. 血球計数器で細胞を数え、1×10 ⁶細胞/ 100μlの濃度で1X HBSS、0.5％BSAで細胞を懸濁します。ネガティブ（非染色）を対照として使用される単一の管に置い〜250,000細胞を設定します。脇FACS選別によりCD56陽性細胞の適切なゲーティングのために必要とされるヨウ化プロピジウムおよびCD56のための追加単色染色コントロール管を、設定してください。並べ替えマニュアルを細胞又は適切なコントロールを確実にするために中核施設の専門家をFACSソーティングが含まれていると相談を参照してください。
   7. 抗CD56抗体の5μlの/ 10 ⁶細胞でソートする細胞を染色する。氷上で30分間（対照を含む）すべてのサンプルをインキュベートする。
   8. 冷却遠心機中で329×gで（〜1100 rpm）で10分間、10ミリリットル1×HBSS、ペレット細胞における洗浄サンプル、4℃の温度。
   9. SORである試料には1μg/ mlの最終濃度でヨウ化プロピジウムを追加死細胞を排除するためのテッド。蛍光活性化セルソーターを使用して非筋原細胞から筋原CD56陽性細胞を精製する。
2. 皮膚生検の解離
   NOTE：筋肉生検を入手できない場合真皮線維芽細胞は、患者からの皮膚パンチから単離することができる。真皮線維芽細胞は、筋原細胞を生成するためのMyoDでの形質導入を含む多くの研究のための生体材料として使用することができます。さらに、真皮線維芽細胞は、さらなる研究のために種々の細胞型に分化させることができるiPS細胞を生成するために用いることができる。
   1. 輸送培地中の研究室に皮膚生検を輸送する。サンプルが受信されると、できるだけ早く初代培養を行う。初代培養は、同じ日に確立できない場合、一晩室温で試料を保管。
   2. 層流フード内で無菌の35mmのペトリ皿に皮膚生検を転送する。
   3. 無菌の1とペトリ皿に皮膚生検をすすぐX PBSを血液や破片を除去する。滅菌メスで脂肪組織を削除します。
   4. 2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を追加し、外科用メスで組織をミンチ、組織の大きさに応じて、1時間に45分間37℃でインキュベートする。
   5. 15mlのコニカルチューブに消化された組織を転送回線維芽細胞培養培地2mlでペトリ皿をすすぎ、そして同じチューブに培地を収集する。
   6. 室温で5分間、200×gで細胞をペレット。
   7. 上清を捨て、コラゲナーゼを除去するための線維芽細胞培地3mlでペレットを洗浄し、再び細胞をペレット。培地組成のための材料の表を参照してください。
   8. ステップ1.2.7 1より多くの時間を繰り返します。
   9. T25無菌組織培養フラスコ上に5ミリリットル線維芽細胞培地プレートの細胞ペレットを再懸濁する。 5％CO _2、37℃でフラスコをインキュベートする。
   10. 次の1〜3日間の線維芽細胞の付着と成長のための文化を評価します。<BR />注：一部の小規模な組織片を、プレートに取り付けることができ、線維芽細胞は、これらの組織片の外に移動する。
   11. 線維芽細胞が約80％コンフルエンスまで増殖させるまで、同様の条件下で培養を維持する。
   12. トリプシン処理により繊維芽細胞を収集し、追加の拡張のために新鮮な培養フラスコに移す。のCa ⁺⁺およびMg ⁺⁺を含まない培養液を1×PBSで3回洗浄することによりトリプシン処理を実行します。 37℃で2分間細胞（2ミリリットル/ T25フラスコ）にトリプシン-EDTAを（材料表を参照）を追加します。
   13. 追加のフラスコに剥離した細胞を分割。いくつかの組織片は、元のT25フラスコに取り付けたままにした場合、このフラスコに5ミリリットルの新鮮な培地を追加し、より多くの線維芽細胞は、継続的に行わ移行する。
       注：拡張され線維芽細胞培養は、P1として凍結し、および将来の実験のために液体窒素中で保存することができる。

筋原細胞の2不死

1. 10 mMのカフェインを補足した新鮮な培地の5ミリリットルを用いたトランスフェクションの30分前にフィード細胞。
2. ミディプレップ（CDK4またはhTERTのプラスミド）およびpolyjetからのプラスミドDNAを2μgの混合物を均質化し、製造業者によって推奨されるように、15分間室温でインキュベートする。
3. 一晩PE細胞にプラスミド/ polyjet混合物を追加します。
4. 新鮮な培地を供給した細胞（DMEMと4の割合で199培地：10％ウシ血清を補充した1）。 12時間後、ウイル​​ス含有上清を収集し、0.45μmの孔径のフィルターを通して濾過する。
5. G41（いずれかの0.5mg / mlのネオマイシンを選択した後、一晩両栄養性パッケージング細胞系統PA317 ⁵に感染^し 、安定なウイルス産生細胞株を得るために収集された上清1mlを使用8）CDK4または0.5ミリグラムのために/ hTERTのためのmlハイグロ。
6. 3収穫のために毎朝、夕方と朝の上清を収穫その後、近くに密集するまで安定したパッケージング細胞を増殖させることによって作業ウイルス上清を準備します。
7. ウイルス上清を濾過し、直接、後で使用するために-80℃で1ミリリットルのアリコートとストアに使用したり、それらを分ける。ウイルス上清は、それぞれの凍結融解で50％の感染効率を失うことに注意してください。ウイルス粒子に触れたすべてのものを廃棄する前に洗浄を漂白することを忘れないでください。
   注：安定PA317ウイルス産生細胞株は、（凍結培地は、10％のDMSOで90％血清）永久記憶のために-150℃で凍結させ、維持することができる。
8. プレートFACS精製筋原細胞/ウェル、0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレート中で5×10 ⁴細胞の密度で（1.1から1.9のステップで説明する）。細胞がウイルス感染を進める前に、プレートに接続されていることを確認。
9. F、フィルタ400μLを追加reshly（コントロールとして2つのウェルを維持する）一晩各6ウェルプレートにウイルス上清または冷​​凍アリコートを生産した。
10. 2.5ミリリットル/ウェルの新鮮筋肉メディア（4で細胞を供給することにより、培地を変更します; 0.02 M HEPES緩衝液、1.4 mg / LのビタミンB12; 15％ウシ胎児血清を補充した1ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および培地199 0.03ミリグラム/ LのZnSO 4、0.055 mg / Lのデキサメタゾン、2.5μg/ Lで、肝細胞増殖因子および10μg/ L塩基性線維芽細胞成長因子）。漂白剤容器内にウイルス粒子を含む培地とピペットを捨てます。どちらを400μg/ mlのネオマイシン（CDK4感染症）または300 / mlのハイグロ（hTERTの感染）を使用して、選択のための治療、その後、感染から回復するために3日間同じ培地中の細胞のままにしておきます。
11. 制御皿ダイ内の細胞（1〜2週間）まで、薬剤選択の下で細胞を維持する。
12. さえのSelectI中に、（EDTA、トリプシン、0.05％を使用して60〜80％の集密度）、継代細胞コンフルエントになる前に期間に。選択薬剤を補った新鮮な筋芽細胞培地で複数の10センチメートル皿でReplate細胞（2.11に記載されている）。完全に均一に遺伝的背景（すべてのセルにおける導入遺伝子の同じ挿入）を取得するために不均一集団またはクローンなどの不死化、選択したセルを維持します。
13. 次の手順を使用してクローン選択を実行します。
    1. （10cmの皿で例えば 300から500細胞）の低密度で細胞を播種し、小さなコロニーは（10〜20セル）が形成されるまで、約2週間のためにそれらを維持する。
    2. 乾燥から細胞を防ぐために、薄膜のみを残して、この時点で、培地のほとんどを除去する。
    3. 各所望のクローンの上（一端とシリコーン真空グリースに浸し）クローニングリングを配置し、トリプシン/ EDTAの数滴を追加します。
    4. 収穫細胞は、彼らは慎重に1ミリリットルチップまたはパスツールピペットを用いて細胞を吸引し、最小の利用可能なマルチウェルPLAにそれらを転送することによって丸くなるたらTE（96または48、24または12ウェルプレート）。
    5. 地元の集密度を防ぐために、必要に応じてクローンを展開します。

Representative Results

図1は、一次組織解離に関与する重要なステップのいくつかを示しています。組織の正確な量は、無菌組織培養シャーレ（ 図1A、B）に秤量する。組織スラリー（ 図1C、D）が得られるまで、次に組織を微細に、無菌の外科用メスを用いて細かく切り刻まれる。消化酵素を添加した後、一次筋組織の解離は、通常、45〜90分以内に酵素消化することにより達成される。組織消化の進行は、典型的には、過剰消化し、細胞死を防ぐために、すべての15〜20分を監視している。酵素消化を穏やかに15〜20分毎に数回ピペッティングし、混合することができる。消化工程の最後に、細胞は、100μm（ 図1E、F）、次いで40ミクロンのフィルターを通して濾過する。解離した一次セル、筋肉組織の出発量を、サンプルが軽度または重度の影響を受けた筋肉から得られるかどうかに応じてlsが不均質になる。 図1Gは、図1Hは組織培養皿中で消化し ​​、プレーティングの解離した一次細胞で3-6時間の例を示してすぐに、消化後に懸濁液中の単核細胞の例を示している。筋原細胞は通常、線維芽細胞および脂肪生成細胞と混合される。免疫細胞は、炎症は、患者の疾患と関連している場合には存在してもよい。従って、異なる細胞型の将来の分離が望ましいかもしれない。ヒト筋原細胞の将来の単離のために、CD56またはN-CAMは、広く信頼できるマーカー^6-9として使用されている。この精製は、まもなく筋原前駆細胞の濃縮および細胞不死化処理の前の分離後に有益である可能性があります。代替的に、初代細胞の不死化は、最初に実行することができ、その後、不死化筋原細胞をFACSによってCD56の発現に基づいて選択することができる。回路図に前のFACSソーティングおよびFACSプロファイルの一例を図2に示されている。簡単に説明すると、必要なステップは、一次細胞が示され、その後一次抗体（ すなわち 、抗CD56）のような高濃度で計数し、再懸濁された細胞に添加し、インキュベートする。氷上で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、蛍光活性化セルソーターで分析し、精製した（ 図2）CD56陽性細胞の.theのおおよその収量が総単核細胞40〜70％の範囲の、サンプルによって変化する。収率は、個々の患者の年齢および筋原細胞が影響を受けない、または病気の筋肉から抽出されるかどうか。ジストロフィー筋は、多くの場合、CD56陽性細胞のより低いパーセンテージを有している影響を受けていない筋肉は、通常、筋原細胞の割合が高い。精製された細胞は、（ 材料の表を参照）の完全な筋原性増殖培地中に播種する。それらはREACとき、細胞をトリプシン処理により継代することができる時間60から70パーセントコンフルエンス。 CD56発現細胞は筋原と（ 図3に図式化されるように）筋原細胞の.theの不死化は、二つの遺伝子^12,13の連続的なトランスフェクションを必要とするインビトロ ^10,11 で筋管を形成することができる。サイクリン依存性キナーゼ4（CDK4）は、不十分な培養条件に組織培養のストレスを克服するために使用され、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）が原因末端複製現象¹²にテロメア短縮を防止する。いずれも事前にウイルスプラスミドはのpBabeの骨格ベクターである。マウスCDK4 cDNA構築物は、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞およびhTERT cDNA構築物は、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む。後者はまた、hTERTの/ TKカセットの両端に配置された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（TK）カセットおよびloxP部位を含む。これは、Creリコンビナーゼ¹⁴とガンシクロビルを使用して対抗選択によって全体の発現ユニットの切除を可能にする。

新たに不死化細胞は、完全にホモジェニック遺伝的バックグラウンド（細胞ゲノムおよびその子孫における単一の挿入）を得るために、ウイルスは、異なるサイトに統合される集団として維持し、またはクローニングすることができる。ほとんどの場合、一方の主集団から単離クローンは、クローン間のわずかな違いの結果は、細胞ゲノムにカセットの挿入に依存します。また、大規模な組織培養ではなく分化するものよりも増殖優位性を有する細胞の選択に有利であろう。私小さ ​​なコロニー（10-20細胞）が形成されるまで（10cmの皿で300~500細胞など ）と約2週間培養する単一クローンのゾル化が低密度で細胞を播種することによって簡単に行われる。培地のほとんどは、その後の乾燥から細胞を防ぐために、薄膜のみを残して、除去される。クローンを、クローニングリングを使用してトリプシン処理し、必要に応じて拡張される。拡大不死化クローンは、免疫蛍光によってFACS、デスミンおよびMyoDの発現によるCD56、または分化の際に筋管形成のような一般的な筋原細胞マーカーの発現について試験することができる。 3-5日（ 図4）の後に（2％ウマ血清を補充した1、4の比のDMEMと培地199）コンフルエント筋原細胞（90％コンフルエント）を分化培地に置かれたとき、筋管が最も明らかである。違いは筋管形成および非不死化対照細胞と不死化細胞との間の筋収縮能力が認められなかった（ビデオ1及び2）。

図5）を含むいくつかの方法論によってアッセイすることができる。成長曲線の例には、細胞が継代の延長数のために拡大されたようにテロメアの短縮が観察された図5Aに示されている。逆に、成功した不死化は、増大したテロメラーゼ活性（ 図5）に関連付けられている

図1：一次ヒト筋肉組織の解離のための重要な段階のイラスト（A）空の培養皿の計量前の組織の配置と（B）に対する組織の配置後（C）滅菌メスを刻むために使用される。組織まで、（D）組織それ自己スラリーに還元される。コラゲナーゼおよびディスパーゼを添加し、組織を45〜90分間消化し ​​、次いで消化破片（E、F）、（G、H）解離した直後にプレーティングしたばかりの解離細胞の例（Gを廃棄するようにナイロンメッシュフィルターを通して濾過し）または初代細胞は（H）を解決するために始める解離、3時間後。

図2：蛍光活性化セルソーターを経由して精製前に人間の筋芽細胞染色に関わる手続きのワークフローの FACS分析の前に、ヒト細胞の染色のための重要なステップが強調表示されます。 FACSプロットの例も示されている。陰性対照（左パネル）は選別ゲートを確立するために使用される。右パネルには、CD56を発現している陽性細胞はゲートされており、percenta陽性細胞のgeとが示されている。この戦略は、前に不死化または不死化手順を以下のいずれかの筋原細胞を精製するために使用することができる。

図3：筋芽細胞不死化のためのウイルス産生の模式図 。筋芽細胞を不死化するために使用されるレトロウイルス生産のワークフロー。 CDK4のpBabeまたはバックボーンにおけるloxPにはさまれたhTERT-TKカセット（左）のいずれかを含有するプラスミド構築物をpolyjetを用いフェニックスエコトロピック（PE）、パッケージング細胞株の一晩（8-12時間）にトランスフェクトされる。次いで、上清をフェニックス両栄養性パッケージング細胞株（PA317）上に濾過した後、転写される。これらの細胞からの上清を直接使用することができるいずれか、または細胞は、将来の使用のための安定な細胞株を生成するために、ネオマイシンまたはハイグロマイシンのいずれかを選択することができる。 FILTのアリコートエレド上清（50％効率が失われて）後で使用するために-80℃で保存することができる。漂白剤は、手順のすべてのポイントで使用するすべての消耗品を洗浄するために使用される。

図4：リバーシブル筋芽細胞不死化の概略不死化手順（上）のワークフロー：。初代細胞を最初にCDK4トランスフェクトする。ネオマイシン選択後、筋芽細胞は、2の選択マーカーを含むフロックスのhTERTカセットでトランスフェクトする。 HSV-TKおよびハイグロ。後で所望の場合、hTERTのカセットは、Creリコンビナーゼを発現させ、ガンシクロビルとの切除のために選択することにより、「フロックス」することができる。これは筋芽細胞とテロメアの短縮の再開始の「再mortalization」を可能にする。テロメアは20キロバイトの長さである場合、これはまだ倍加数百のを可能にし、およびtを回避 hTERTのの過剰発現の彼は合併症。最後に、不死化集団から同質遺伝子クローンを単離することができる。新たに不死化細胞のmyogenicityは、デスミン（左下のパネル、抗デスミン、クローンD33で染色し、増殖培地中の細胞、緑）などの筋肉細胞の特異的マーカーを使用して示すことができる。このクローンは、分化した細胞は、細胞が増殖状態に維持されていても見られるように、筋原性である。細胞（2％ウマ血清、中央および右のパネルで）分化培地中で分化されるとき、筋管形成は、非常に広範囲になる。ほとんどすべての胚性ミオシン重鎖（緑）にMF20抗体で染色した細胞と筋管は、DAPI染色（青色、すべての画像）することで、複数の核を持っている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図5：不死化手順の検証。 （A）の一次筋芽細胞、不死の人口（筋芽細胞のhTERT-CDK4）、再に消滅クローンから同質遺伝子クローンの増殖曲線が例として示されている（筋芽細胞は、hTERTの-CDK4はフロックス）。細胞が老化に達する前に、成長率に差は検出されなかった。テロメア短縮は、TRFにより測定した集団倍化とテロメアの長さの関数としてモニターした。（B）初期の時点と筋芽細胞（PDから13から75 5の時点）における後期複製のTRFも示されている例は、再に消滅筋芽後hTERTの切除（PD 62から152に3つの時点）と不死化筋芽細胞（PD 75および200）。（C）は、成功したhTERTの感染は、テロメラーゼ活性の増加につながります。テロメラーゼ活性はddTRAPによって評価した（右ddTRAP読み出し;アッセイの定量化、左）細胞において¹⁵ HTEの前後RT感染。 hTERTの切除は筋芽細胞で見られるオリジナルのしきい値にテロメラーゼ活性を廃止。結果は、（バックグラウンドが補正された）細胞と同等のあたりに発生する総テロメラーゼ産物として示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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ビデオ1及び2筋管を不死化プロセスの前と後の細胞から作製した。細胞は、増殖培地中でコンフルエントになるまで増殖させ、10日間分化培地に切り替えた。両方のビデオでは、1つ以上の筋管の機能的収縮が検出可能である。自発けいれんの記録20Xレンズを使用して行った。差は不死化および非不死化細胞との間で観察されなかった。

Discussion

便利な資源としての細胞

疾患のインビトロモデルにおけるまたは疾患の表現型を確立する際に筋原細胞集団の単離および文化は極めて有用である。ここで説明する筋原細胞単離手順は、次に、伝播分化、またはすぐに分析することができる骨格筋標本からの筋芽細胞および線維芽細胞の単離を可能にする。筋芽細胞の構造および機能は、細胞生存、細胞融合の評価の評価、ま​​たはRNAもしくはタンパク質発現の分子的研究を介して、顕微鏡検査を介して評価することができる。さらに、筋芽細胞は、組織損傷後の筋肉の発達及び回復の文脈における筋芽細胞機能の直接的な評価を可能にする、未成熟筋線維の多くの特徴を共有して筋管に分化させることができる。これらの表現型の全ては、筋原細胞の初期の継代ではかなり再現性がある傾向があるが、多くの主要メートルの挙動yogenic細胞株は、多くの継代にわたって変更することができる。その結果、より長期間にわたって培養の確立を容易にし、再現性のある結果の生成を容易にすることができる特定の筋原細胞株（ここで説明したように）、不死化することが望ましい場合がある。

特定の細胞集団の選択

このプロトコルは、精製スキームとして、FACSを使用して骨格筋組織からの筋原細胞の単離を説明しています。選択セルの提案戦略は、死細胞、破片、および非筋原細胞からのライブ、筋原細胞を区別するためにヨウ化プロピジウム（死細胞の指標）およびCD56（筋原細胞のマーカー）を使用することを含む。 CD56陰性集団は、線維芽細胞、おそらく脂肪生成細胞を含む非筋原細胞が含まれますしながら、CD56陽性集団に含まれる細胞は、筋管を形成することができる筋原前駆細胞が含まれます。これらの画分のそれぞれの缶筋芽細胞または線維芽細胞の細胞培養物を生成するために独立して培養すること、及び平行線維芽細胞培養物を確立する可能性が独立した細胞またはDNA銀行演習または筋原細胞培養上で実行されるアッセイのための追加の制御条件として有用であり得る。特定の筋芽細胞と他の場所で^16,17説明されているFACSソーティングは望ましくない、または利用できない場合は、消化筋肉組織、からの線維芽細胞培養の選択のための他のいくつかのオプションがあります。筋芽細胞と線維芽細胞を分離する一つの代替方法は、特定の細胞型についての細胞の連続継代を豊かにするためにこれらの2つの細胞型間の差の密着性の使用を含む。線維芽細胞が確立または細胞を継代した後、RESUする別の皿に上清をめっきする際に、約1時間プラスチックにインキュベートした細胞懸濁液を許可する、ずっと容易に筋芽細胞よりもプラスチックに接着するように細胞懸濁液¹⁸から多くの線維芽細胞の除去においてLT。

線維芽細胞対筋芽細胞のユーティリティ

患者からの筋肉生検は、典型的には、しかし、病気の筋芽細胞を効果的に増殖しないことがあり、一次筋細胞の精製の ​​ために使用され、唯一のことが必要で分割高い数に達するように、細胞不死化を必要とする、in vitroでの分割の少数を受けることができる。彼らは両方とも有用であり、下流のアプリケーションに非常に汎用性を提供することができますように線維芽細胞および筋芽細胞の両方が筋肉生検から単離することができることを考えると、両方の細胞画分を、患者サンプルから保存する必要があります。例えば、線維芽細胞は、無制限の細胞数とポテンシャルを生成するために非常に有望で誘導多能性幹細胞（iPS細胞）の作製に使用することができる複数の細胞系統に分化するように誘導する。これらの特徴は、患者から得られた細胞のための非常に望まれている潜在的に、インビトロで修正または治療化合物の探索における実験的な薬物スクリーニングに使用することができる稀な疾患との。不死化された筋芽細胞は、薬物ベースのスクリーニングに用いることができる。線維芽細胞はまた、効果的にMyoDの^19-21を発現するウイルスの感染によって筋原運命に向かって変換することができる。この方法は、効果的に筋肉の疾患を有する患者から抽出された線維芽細胞を用いて試験し、MyoDの発現線維芽細胞が効率的に成熟筋タンパク質を発現する筋管を形成することができることが確認された。したがって、両方の細胞型は、効果的に、いくつかの下流の用途に使用される、診断および治療の研究のための貴重な材料を提供することができる。

不死化の影響

正常な二倍体細胞の不死化は1つが十分に多くの異なる研究所によって特徴付け研究することができる安定なヒト細胞株を作製することができる。独立したから初代培養アイソレーションは、変えることができ、損傷が解離プロセスまたは培養挙動を歪ませる可能性が過剰消化によって導入されたときに、それらの全体的な増殖能力を可変とすることができる。テロメラーゼ酵素（hTERT）の触媒サブユニットの発現を用いて、細胞の不死化は、安定な細胞表現型を維持するという利点を有する細胞は、二倍体のままである。テロメラーゼは、Wnt経路^22を調節することができるマウスにおいて報告されている。私たちは、ヒトの細胞でこの現象は確認されていません。テロメアが伸長された後にそれを除去することができるように、しかし、そのような潜在的な合併症を回避するために、hTERTのカセットは、lox部位に隣接されている。ロングテロメアはほとんどの実験を実施するのに通常は十分な、余分な部門の数百を与える。

連続細胞拡大は、常に急速な成長のための選択的な利点を提供するので、細胞の表現型は、時折により最も急速に分裂の異常増殖にバイアスになることができます細胞ではなく、最高の分化する細胞。これは、まだ記載された方法を用いて重要な問題であることが証明されていないが、それは初期の文化の歴史の中で、または所望の表現型を示す細胞のためのクローン選択によって凍結された細胞を解凍することによって改善することができる。

近くの無制限番号に筋原細胞の増殖は、薬物スクリーニングおよび可能な疾患のモデリングのための利点を有している最後に、現在の技術はまた、細胞ベースの治療、または、一次診断ツールにおける治療ビヒクルとしてのこれらの細胞の使用を防止する内因性の欠点を有する。どちらの体外培養と不死化段階で豊富な天然の状態に比べて筋肉細胞の表現型を変更します。重要なことは、これらの細胞は、そのニッチ内の主要な衛星細胞の自然環境とは非常に異なる環境で展開されます。したがって、不死化細胞は、おそらく強烈な安全性試験とdeveloを必要とする新技術のpmentはそれらがヒト患者の筋肉に再導入される場合。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010