Introduction
Målet med cryoEM er at opnå elektronmikroskopiske billeder af makromolekyler i deres native hydratiseret tilstand. I kraft af at indlejre makromolekylet i forglasset vand, kan en frossen-hydreret prøve indføres direkte og visualiseres i TEM instrument. Forglasning opnået ved flash frysning (10.000 o C / sek), fryser prøven uden vand krystallisation og sikrer, at molekylære omlejringer under frysning er ubetydelige. Overskuddet af elektron spredning af prøven med hensyn til den omgivende buffer giver en lille, men tilstrækkelig kontrast til se makromolekylet i fravær af enhver plet 1. Computerized billedbehandling kan derefter anvendes til at genskabe makromolekyle 3D struktur. Store makromolekyler i ~ 500 kDa- multi MDa serie er ideelle prøver til cryoEM (tegner sig for over 80% af Electron Microscopy Data Bank (EMDB) poster); disse omfatter proteiner, protein-komplekser, protein-nukleinsyre complexes og membranproteiner indlejret i et dobbeltlag. Disse makromolekyler er mindre tilbøjelige til at blive krystalliseret (med mindre end 2% poster i FBF databasen) alligevel er det ofte sådan, at mindre stykker løses ved røntgenkrystallografi eller NMR kan være forankret i 3D kuvert skabt af cryoEM. På den anden side, nogle af de største strukturer løses ved cryoEM kan identificeres inden for det fulde celle ved tynde sektion TEM 2. Således cryoEM effektivt bro over størrelse og opløsning kløften mellem subcellulære og atomare strukturer.
CryoEM afspejler bedre makromolekylet native struktur end de mere klassiske metode til negativ farvning (NS), hvor makromolekylet er dehydreret og omgivet af et lag af tungmetal plet, hvorved regionen pletten udelukkelse skaber en stærkt kontrast "negativ" image 3. I begge tilfælde elektronstrålen producerer 2D projektion billeder af makromolekyler, kaldet partikler, hvor Shape afhænger af orienteringen af makromolekylet med hensyn til elektronstråle. Mange partikler, i det mindste ~ 1000 og uden nogen øvre grænse, kan analyseres på computeren med "enkelt partikel analyse" (SPA) software for at øge signal-støj-forholdet (SNR) selvom gennemsnit til, og at finde den partikel orientering parametre rumlige nødvendig for at genskabe makromolekylet 3D struktur ved tilbage projektion 4-7. NS, med højere SNR, anvendes til foreløbig prøve karakterisering og til at generere en de novo 3D rekonstruktion; sin beslutning sjældent overstiger 20 A, som pålægger dehydrering og størrelsen af heavy metal korn. Generelt for cryoEM 3D strukturelle beslutsomhed, en lav opløsning 3D rekonstruktion først opnås fra NS og derefter cryoEM bruges til at forfine denne lav opløsning indledende kort til yderligere undersøgelse makromolekylet i dets native hydreret tilstand, for at se dens interne struktur, og øge sin beslutning. Ingente at hvis NS modellen blev fordrejet (det mest almindelige eksempel er udfladning følge af dehydrering 8) og cryoEM partiklerne havde lav SNR, så forvrængning kunne bære i cryoEM (modellen bias artefakt, som er fælles i lav SNR datasæt 9). Strukturel forvrængning ville resultere i misforhold mellem NS og cryoEM rå partikler og mellem de rå cryoEM partikler og tilsvarende fremskrivninger af 3D-modellen vinkelret på udfladning retning. Model skævhed kan løse sig selv som 3D-modellen gennemgår successive raffinement cykler. Skulle det ikke ske, som ville blive opdaget som manglende overensstemmelse mellem rå cryoEM partikler og tilsvarende fremskrivninger fra 3D-modellen, så en de novo-model skal bygges fra cryoEM data. En god metode kunne være at bruge den kantede rekonstituering algoritmen 10, som kan give flere mulige 3D-volumener, og derefter bruge NS 3D-modellen til at vælge den bedst mulige cryoEM modelder vil blive yderligere forbedret 11. En endnu bedre strategi er at øge SNR af cryoEM datasæt (se særligt afsnit i Discussion).
Den biokemiske kvalitet af det rensede makromolekyle har en yderst indflydelse på det endelige resultat. Det makromolekyle oprenses fra væv eller udtrykkes i heterologe systemer, skal have en høj grad af renhed og at være strukturelt intakt. Den bør hverken danne aggregater bør heller ikke disaggregere. For at definere en bestemt konformation, bør præparatet fremme en ensartet konformationel tilstand. For at undersøge komplekser, er det optimalt, at deres Kd er i nM-området, ellers fikseringsmidler med succes er blevet anvendt til at stabilisere lavere affinitet interaktioner 12,13.
Ubehandlede cryoEM billeder giver værdifulde oplysninger om dimensionerne, generel oversigt, tilstand af sammenlægning / multimerisering, homogenitet, og intern struktur af macromolecule. Ikke desto mindre det potentiale af teknikken er langt forbedret med billedbehandling. En 3D-struktur afslører makromolekylet samlede arkitektur, 3D placeringen af ligander og underenheder, konformationelle ændringer og muliggør sammenkobling af atomare strukturer bestemt ved røntgenkrystallografi eller NMR. Mængden af oplysninger af en 3D-rekonstruktion øger trinvis som opløsningen øges: generelt 15-20 en resolution tillader entydig docking af atomare strukturer på 9-10 Å alfa spiraler er synlige som stænger, ved 5 Å er det muligt at skelne beta ark, og ved beslutninger af 3,5 Å og bedre er det muligt at bygge en atommodel 14.
Muligheden for at opnå informative billeder og en 3D-rekonstruktion ved hjælp SPA fra relativt små mængder af prøven gøre cryoEM en attraktiv teknik, som 3-5 pi på mindst 0,05 mg / ml er tilstrækkelig til at fremstille en TEM nettet. Minimumskravene instrumentale kravfor cryoEM er en hjemmelavet eller kommerciel cryo-stempel, et elektronmikroskop med ultra højt vakuum, image optagemedie og lavdosis kit, et cryo-holder med sin pumpestation, en glimudladningsanordning, og en fordamper. Ikke-essentielle, men yderligere ønskelige funktioner på TEM er CCD-kamera (til stede i alle moderne systemer) eller en direkte elektron detektor, felt emission pistol (FEG), energi filtrering og high throughput dataindsamling software. Denne software i princippet gør det muligt at indsamle titusindvis af partikler i en enkelt cryoEM session 15, men de øgede behov for datalagring og efterfølgende overvåget efterbehandling tid behov for at blive taget i betragtning. FEG kombineret med funktion kontrast overførsel (CTF) korrektion ligger bag de fleste 3D rekonstruktioner, der nåede opløsning er tilstrækkelig til at visualisere alpha helixer. På det tidspunkt, omfanget af opløsning er også prøve-afhængig: når 10 Å opløsning er mindre almindeligt for membranproteiner hvorimod hvishøj orden af symmetri er til stede så atomar opløsning er mere opnåeligt. Den seneste udvikling af direkte elektron detektorer har aktiveret atomar opløsning selv for makromolekyler med lav (4x) eller ingen symmetri, hvor kvaliteten af de cryoEM elektron tæthed maps matcher disse stammer fra X-ray diffraction data 16,17.
Praktiske eksempler illustrerer mulighederne i teknikken leveres her i fire vigtige typer af makromolekyler hvor cryoEM har en vedvarende chef rolle i deres strukturelle beslutsomhed. (I) Med deres tyvefladet symmetri, der øger datasæt med 60 gange og deres store størrelse, som tillader trofast og reproducerbar justering, har strukturerne af flere icosahedral vira blevet løst til nær-atomar beslutning cryoEM efterfulgt af SPA 18. Vi viser et eksempel på en klasse af icosahedral vira, de adeno-associerede vira (AAV'er), som nær-atomare strukturer ved cryoEM og ved cryoEM / x-ray hyfindes brid metoder 19,20. (Ii) Macromolecules med spiralformet struktur omfatter mikrotubuli filamenter og vira. Deres gentagne enheder langs den spiralformede akse kan analyseres ved en mere kompleks version af SPA tilpasset den spiralformede geometri 21. I eksemplet viser vi tobakmosaikvirus (TMV), et RNA-virus, der er blevet løst til atomar resolution af cryoEM 22. (Iii) Store opløselige proteiner er blevet udførligt undersøgt. Blandt disse makromolekyler danner symmetriske multimere cylindre udgør et tilbagevendende arkitektur ofte løses ved subnanometer opløsning 23,24. Her viser vi billeder af KLH, en hvirvelløse ilt bærer, hvor en hybrid molekylær model blev skabt af cryoEM / røntgenkrystallografi hybrid metoder 25. (Iv) Membranproteiner er en vigtig klasse af proteiner; de udgør omkring 1/3 af proteinerne kodet af det humane genom, men de er vanskelige at karakterisere strukturelt grund kompleksiteter forbundet med stansmembrane domæne stabilisering 26, der udgør mindre end 1,5% af de strukturer, løses ved en hvilken som helst strukturel teknik kombineret. Rolle cryoEM og 3D rekonstruktion i deres strukturelle bestemmelse er eksemplificeret med ryanodine receptor (RyR), en stor eukaryot intracellulær Ca2 + kanal vigtig i muskelsammentrækning og hjerne signalering. Den højeste opløsning cryoEM strukturer til dato, med 10 en beslutning, afslører sekundær struktur 27.
Protocol
1. Cryo-holder og vedligeholdelse
BEMÆRK: Det tørre pumpestation, der består af en turbo pumpestation og en eller flere kolde fase controllere, bruges primært til tre formål: a) Det er et sikkert sted at opbevare kryo indehavere, når de ikke bliver brugt. Den korrekte måde at opbevare indehaverne er at lade dem på stationen under vakuum. b) at fordampe frost og fugtighed buildup der opstår, når den flydende nitrogen fjernes fra dewar-karret og spidsen af kryo indehaveren udsættes; dette opnås med den varme-up cyklus. c) at regenerere zeolit tørremiddel, og for at opnå et højt vakuum i cryoholder Dewars. Dette er nødvendigt for at holde en konstant temperatur, når de udfører kryo-elektronmikroskopi.
- Warm-up cyklus.
- Sæt kryo indehaveren i en af pumpe havne i pumpestationen. Tilslut en af evakuering rør til metal udløb under vakuumventilen af holderen. LaveKontroller, at alle ventiler på station (V1, V2 og V3) og om kryo holderen er lukket.
- Tænd for kolde scene controller og tilslut det til indehaveren gennem kontrol ledning. Tænd for afbryderen på turbo pumpestation.
- Start Opvarmningsperiode option i den kolde fase controller. Når vakuumet i turbo pumpestation læser 10 -3 Torr eller bedre, skal du åbne butterfly ventil V2, vente, indtil vakuum stabiliserer, og åbn derefter butterfly ventil V1.
- Kør den varme op cyklus for omkring 30 min, indtil temperaturen i holderen er stabil over 20 ° C. Luk V1, og derefter stoppe cyklen.
- Zeolit cyklus. Kør Zeolit skifte mellem 4 timer og O / N Inden en CryoEM Session, og en gang om ugen, hvis det ikke bruges.
- Start Zeolit cyklus og vælg den nødvendige tid til at nå et godt vakuum i området fra 1-2 x 10 -4 Torr og dermed lang holdetid. Når vakuum når 10 -3Torr, åbn dewar evakuering ventil, V3. Pumpestationen vil derefter evakuere linje til indehaveren; vente til vakuum stabiliserer.
- Åbn ventilen på kryo holderen. Når cyklussen er færdig, lukkes ventilerne i modsat rækkefølge, som de blev åbnet: ventilen på holderen, så V3, V2, og til sidst V1. Sluk for turbo pumpestationen og den kolde fase controller, og tag kryo indehaveren fra den kolde fase controlleren og turbo pumpestation.
2. Grid Forberedelse
- Rengøring.
BEMÆRK: Ved brug kommercielle vandudtryk gitre, anbefales det at rense dem før brug, for at fjerne eventuelle rester af polymer, som blev anvendt i produktionsprocessen. Gøre dette i et glas petriskål med 5 lag af filtrerpapir, der i bunden.- Placer gitre på filtrerpapiret med holey carbon opad.
- Ved hjælp af et glas Pasteur-pipette, våd papiret med nogle dråber of chloroform omkring nettene, indtil de bare begynde flydende.
- Dæk petriskål med låget på klem i et stinkskab O / N.
- BEMÆRK: den tynde carbonbærer (trin 2,2-2,3) kan udelades islaget kan dannes direkte på tværs af de små huller i holey carbon nettet.
- Ved hjælp af en pincet, spalte et stykke af glimmer at blotlægge to nye overflader. Placere den nye udsatte overflader af glimmer forsiden opad på en hvid stykke papir i en petriskål.
- Placer petriskålen i glasklokke af en kulstof fordamperen. Start pumpen ned rækkefølge, indtil vakuum er under 2 x 10 -6 Torr. For at fordampe eventuelle urenheder på overfladen af carbon stang, udføre en præ-afdampning med petriskålen dækket. Så lufte glasklokke og fjern dækslet fra petriskålen.
- Udfør pump down rækkefølge, indtil vakuumet er under 10 -6 Torr og belægge glimmer med et tyndt lag (~ 5 nm) af kulstof. Brug øjenbeskyttelse under kulstoffordampning. Overvåg tykkelsen af carbon film af den resulterende mørke på det papir, der var blevet placeret under glimmer ark.
- Overfør Thin Carbon til TEM Grid.
- Skær en 0,5 x 1 cm stykke af glimmer og flyde carbon off på den flade overflade af filtreret, deioniseret vand. Brug optisk linse papir at få en flad vandoverfladen. Ved hjælp af en pincet, sætte holey kulstof side af nettet i kontakt med den øvre overflade af det flydende kulstof lag og samle den op.
- Gentag trin 2.3.1 og 2.3.2, indtil udarbejdes et tilstrækkeligt antal net.
- Glimudladning.
BEMÆRK: glimudladningen omdanner naturligt hydrofobe carbonbelægningsindretningen lag af net til hydrofile. Dette trin er valgfrit.- Placer gitre med carbon opad på en 7,5 x 2,5 cm glasplade dækket med Parafilm. Placer den ind i kammeret af glød-udledning udstyr og Kammeret lukkes.
- Pumpeden glasklokke og glød-decharge for 20 sekunder ved 25 mA og 7 x 10 -2 mbar.
BEMÆRK: I løbet af denne tid en lys lilla skær bliver synlig. Fjern objektglas med net og bruge dem inden for 1 time, ellers vil de nødt til at være glød afladet igen.
3. Prøve Plunge-frysning
BEMÆRK: Brug beskyttelsesbriller og passende fodtøj, når du bruger dette instrument til beskyttelse mod flydende kvælstof og ethan stænk.
- Slå springet indefrysning apparat. Fyld befugteren reservoir med destilleret vand. Indstil den ønskede temperatur, relativ fugtighed og kaster betingelserne for blot tid, duppes kraft og adsorption tid (22 ° C, 95%, 2 sek, 2 og 40 sekunder i den præsenteres her eksempel). Placer ny blotting filtrerpapir.
- Afkøl ethan beholderen ned ved at fylde det ydre reservoir med flydende nitrogen, indtil stabilitet er opnået (ca. 10 min). Når den flydende nitrogen stopper boiling placere spidsen af røret kommer fra ethan tank i det indre kammer og åbne ventilen meget langsomt. Flydende ethan i det indre kammer og fyld den til 1 mm fra toppen. Undgå nedfrysning af ethan. ADVARSEL: ethan er yderst brandfarlige og eksplosive.
- Sørg pincet er afstemt i apparatet springet frysning.
- Tænd fugtighed. Sæt et gitter på pincetten, og læg 3-5 pi prøve på carbon overflade (mat side) af Holey nettet. Vent for prøven at adsorbere til nettet og udfører blotting for at opnå et tyndt væskelag.
- Flash-fryse gitteret ved at kaste det i flydende ethan. Fjern pincet-grid samling fra den flydende ethan holder pincetten støt, og overføre det til det ydre kammer med flydende nitrogen. Overfør gitteret til en lille gitter kasse nedsænket i flydende nitrogen. Sørg for at holde forglasset prøve i flydende nitrogen hele tiden under overførsel til enten lagertankeller Cryo holderen.
BEMÆRK: GRID kasser kan opbevares i en stor kapacitet (35-50 L) flydende nitrogen dewar i mindst 1 år. Til praktisk opbevaring kan de anbringes i et 50 ml Falcon-rør med to borede huller øverst og en fiskesnøre knyttet til sin hætte, der kan trækkes fra mundingen af Dewar.
4. Overfør Cryo-grid af TEM
- Sæt kryo holderen i kryo-transfer arbejdsstation. Pas på ikke at beskadige spidsen af holderen under indføring. Check for tilstedeværelsen af små fibre og støv på stangen og O-ringen af kryo holderen ved hjælp af en lup, hvis der er nogen fjerne det med optisk linse papir.
- Fyld Dewar af kryo holderen og arbejdsstationen beholder med flydende nitrogen. Undgå at spilde den flydende nitrogen ved hjælp af fanget tragt, der kommer med arbejdsstationen.
- Slut kryo indehaveren til den kolde fase controller til at overvåge temperaturen og holde tilføje flydende nitrogen & #160; indtil temperaturen stabiliseres ved ca. -194 ° C. Kontroller, at niveauet af flydende nitrogen er under niveauet for vakuumforseglingen både arbejdsstationen beholderen og kryo holder dewar-karret. Pre-køle gitter pincet, klippet ringen og den stumpe ende af klippet ring værktøjet på arbejdsstationen. Også præ-køle et sæt af store pincetter og en skruetrækker i en anden dewar fyldt med flydende nitrogen.
- Hurtigt overføre kryo gitter kasse indeholdende de frosne hydrerede net til den flydende nitrogen i arbejdsstationen ved hjælp af de store pincet. Åbn kryo gitter kasse med skruetrækkeren, tage den frosne hydreret nettet og læg det i prøven holderen slot.
- Placer klip ring på toppen af nettet og tryk det forsigtigt med den stumpe ende af klippet ring værktøjet indtil det sidder fast på plads. Luk kryo-lukkeren. Fjern værktøjer og kryo gitter kasse fra arbejdsstationen.
- Flyt hele arbejdsstation med holder og gitter til mikroskopet konsollen for at miniMize overførslen tid af nettet i rumluften.
- Top fra TEM anti-contaminator med flydende nitrogen, som tidligere var blevet fyldt og afkølet i mindst 20 min. Pre-vip mikroskopbordet til -60 °.
BEMÆRK: Dette vil minimere tab af flydende nitrogen som indehaver indsættes i luftslusen. - Begynd pre-pumpe luftsluse cyklus på mikroskopet. Kontroller, at ventilen til elektronkanonen er lukket (især hvis det er en FEG TEM). Vent luftslusen sekvens før pumpe til slut (ca. 2 minutter), inden du sætter kryo holderen.
BEMÆRK: Dette er angivet ved det røde lys på scenen bliver slukket. - Sæt holderen i luftslusen og drej den 90 ° med uret; forbinde den kolde fase controller ledningen til kryo indehaveren at overvåge temperaturen. Vent igen, indtil det røde lys slukkes og rotere både scenen og holderen tilbage i 0 ° positionen for at indsætte holderen i TEM high vakuum kolonne.
- Sørg for, at temperaturen aldrig går over -160 ° C for at undgå dannelse af krystallinsk is.
- Refill Dewar af kryo holderen. Vent 15-45 min, indtil indehaveren har termisk i ligevægt og TEM vakuum har genvundet før optagelse af billeder.
- Hvis der registreres bobler af flydende nitrogen, ændre nitrogen påfyldning højde flydende, eller forsigtigt røre boblende oprindelse med en vatpind.
5. Lavdosis Dataindsamling
BEMÆRK: lavdosis dataindsamling teknik bruges til at minimere skaden elektron stråling til prøven ved at begrænse eksponeringen til 20 elektroner / 2. Dette opnås ved at skifte mellem tre konfigurationer: "søg", med lav forstørrelse (~ 5,000X) og bredt synsfelt, "fokus", med høj forstørrelse (~ 150,000X) og lille synsfelt, og "eksponering", med den ønskede endelige Magnifikation og indeholder det område af interesse, der skal optages. Blank bjælken i mellem tilstande.
- Opsætning af TEM og Lavdosis Program
- Træk kryo-lukker og åbner kolonnen ventiler.
- Centrer scenen og indstil eucentric højde (Z) ved hjælp af alfa wobbler til rock scenen ± 15 °. Juster Z position, indtil der ikke er nogen mærkbar bevægelse, mens scenen er rocking. Aktiver lavdosis program og vælg detektoren for hver tilstand.
- I eksponeringsindstilling finde et område af nettet, der har ingen carbon, justere belysningen ved at vælge den optimale kondensator blænde og spot størrelse, så det område, der skal optages fuldt ud belyst. Sørg for at sprede strålen i overcondensation retning.
- I søgetilstand, finde en lille funktion, der vil være lette at identificere ved højere forstørrelse. I eksponering tilstand Denne funktion med joysticket (xy fase controller). Start ved lavere forstørrelse, hvis det kunststykkeure ikke er i synsfeltet.
- I søgetilstand, bringe denne funktion til midten af feltet ved hjælp af de lave doser xy billedskift kontrol. Gå til eksponering tilstand og flytte funktionen langs tilt akse ved hjælp af joysticket, indtil det er ude af området, der skal registreres (0,5 - 3 mikron). Gå til fokus mode og centrere funktionen ved hjælp af xy billedskift kontrol. Start med lavere forstørrelse, hvis funktion ikke er i synsfeltet.
- Hold strålen centreret på alle tidspunkter.
- Dataindsamling
- Træk kryo-lukker og åbner kolonnen ventiler. Aktiver lavdosis program.
- I søgetilstand, identificerer et gitter firkantet indeholder tynd, homogen is.
- Vælg et passende hul og placere den i midten af feltet. Skift til at fokusere mode og fokusere. Derefter underfocus billedet mellem 0,5-4,5 um.
- Skift til eksponering mode og optage billedet.
- Skift søge mode og gentage trin 5.2.3-5.2.4.Flyt over nettet firkantede undgå pre-udsætte gode huller, der skal optages.
- Afslut nettet pladsen og flytte til en anden god en.
- Juster højden (Z) og fortsætte dataindsamlingen.
Representative Results
Omhyggelig udførelse af alle protokoller trinene i figur 1 muliggør visualisering af frosne hydreret ikke-farvede makromolekyler. Resultater for fire repræsentative prøver med forskellige strukturelle karakteristika er vist. Deres mikroskopiske billeder opnås ved de metoder for NS og cryoEM sammenlignes (figur 2). (I) NS billeder af AAV5 afsløre viruslignende partikler på omkring 130 Å diameter. Sameksistens af fulde og tomme strukturer svarer til brudt (der tillader pletten indrejse) og strukturelt intakte capsider hhv. CryoEM viser ensartet tomme strukturer; faktisk disse viruspartikler ikke indeholder genetisk materiale 28. NS viser fremherskende runde partikler mens cryoEM viser meste sekskantede partikler, som afspejler deres tyvefladet form. (Ii) Billeder af de spiralformede TMV viser stænger på 180 diameter og variabel længde, ofte længere end 0,1 um, med en spiralformet gentagelse af 23. synligt bådei NS og i cryoEM. Den 40 en central kanal er fyldt med plet i NS billeder og tomme i cryoEM billeder. (Iii) Native KLH, en didecamer af 8 MDa samler i karakteristiske tønder 350 diameter og 400 Å længde. NS og cryoEM afslører KLH s rektangulære sidebilleder og cirkulær ende-on udsigt. Begge teknikker afslører seks riller vinkelret på symmetriaksen og jævnt fordelte morfologiske enheder i hver række. CryoEM afslører en tom indre struktur. (Iv) Ryanodine receptor, en stor tetramer intracellulær kanal på 2,26 MDa, ses som et kvadrat på 275 x 275 2. Indviklede overflade funktioner som en central kors og en central depression manifestere sig som pletter ophobning af NS, og som lavere densitet af cryoEM. Mens NS viser tilsvarende kontrast i alle fire testede prøver, sammenligning af cryoEM paneler eksponerer lavere SNR (kontrast) af RYR1 på grund af tilstedeværelsen af detergent for at opløseliggøre dette membranprotein.
Typiske eksempler på cryoEM artefakter er vist for RYR1: krystallinsk is, is forurening, bygningsfejl, og web-lignende strukturer (Figur 3). Deres årsager og forebyggelse er yderligere beskrevet i diskussionen afsnit.
SPA og 3D rekonstruktion af frosne hydreret RYR1 afslører sin firdobbelt symmetrisk struktur, som afspejler proteinets homotetramere organisation (figur 4A). Det cytoplasmatiske domæne danner en firkantet prisme 275 x 275 x 120 A 3 og indeholder flere reproducerbare kugleformede domæner danner et stillads-lignende struktur. Det transmembrane domæne danner en mindre tilspidset firkantet prisme med maksimale dimensioner 115 x 115 x 60 A 3. Ved 10 En resolution er det muligt at visualisere alfa spiraler (figur 4B). 3D forskel kortlægning kan afsløre positionen vigtige ligander, i dette tilfælde 3D forskel kort over FKBP12, et 12 kD protein considerød en underenhed af RYR1, overlejres på RYR1 (figur 4C) 29. Endelig konformationsændringer giver en dynamisk visning af makromolekylet. I dette tilfælde RYR1 tidligere stabiliseret i enten åbne eller lukkede tilstande afslører en masse translokation fra den lukkede til den åbne tilstand (figur 4D) 27.
Figur 1. Blokdiagram over den kryo elektronmikroskopi teknik. Diagrammet fremhæver de vigtigste trin i protokollen.
Figur 2. Sammenligning af NS og cryoEM for en række prøver. (A) AAV5 en tyvefladet virus. (B) TMV, en spiralformet virus. Mellemværker viser den spiralformede gentagelse, på 23 Å. (C) Native KLH. (D) RYR1; repræsentative synspunkter er fremhævet (f, firedobbelte visning og s, set fra siden). Alle prøver afbildes under betingelser lav dosis og med samme forstørrelse af 50,000X en under en accelerationsspænding på 200 kV. Scale barer, 10 Nm. Alle NS prøver er på carbonbærer, cryoEM prøverne A, C, D er på tynd carbon løbet quantifoil, og cryoEM prøve B er direkte over quantifoil huller. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Galleri af billeder, der viser fælles cryoEM artefakter på en RYR1 cryoEM prøve. (A) Krystallinsk is. (B) is forurening (pile). (C) astigmatisme. RyR1s i astigmatiske billedet er knap synlige. Det indsatte til højre viser magt SPECTrom af billedet med asymmetriske Thon ringe. Det indsatte til venstre viser kraftspektret af et ikke-astigmatisk billede til reference. (D) Web-lignende strukturer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. CryoEM og 3D-rekonstruktion af ryanodine receptoren. . (A) Isosurface repræsentation (B) Docking af en krystalstruktur RYR1 N-terminale 30 viser god overensstemmelse mellem de atomare koordinater og cryoEM kuvert; pile peger på to alfa-helixer, der stikker ud fra strukturen. Arrowhead angiver en af de fire helixer, der omgiver pore af ionkanalen. De stiplede linjer angiver grænserne for membranen. (C) RYR1 og 3D lokation af FKBP12 ligand (orange farve). (D) konformationsændringer af RYR1 i går fra den lukkede (orange) til den åbne (sorte mesh) kropsbygning. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
TEM efterfulgt af SPA har bidraget med mange makromolekylære 3D strukturer, nærmer 2.000 poster i EMDB medio 2014. Generelt for en given makromolekyle, er en lav opløsning 3D-struktur først bestemmes fra NS data, som kan efterfølges af en på højere Opløsning cryoEM 3D struktur. Den høje kontrast for de molekylære grænser fra NS, hvilket letter den første 3D-rekonstruktion, senere raffineres af cryoEM med sin evne til at kortlægge den interne struktur af makromolekylet i sin fuldt hydratiseret tilstand, og muligheden for at opnå meget højere opløsning. En anden fordel ved cryoEM er afskaffelsen af dehydrering stress, der kan resultere i kollaps af makromolekylet. Derudover er der mulighed for at udelade carbonbæreren, hvilket eliminerer mulige overflade absorption og viser konformation, makromolekylet vedtager i opløsning. Cryo-negativ farvning, en kombination af cryoEM og NS, giver høj kontrast i en fuldt hydvurderet prøve og kan også føre til 3D rekonstruktion hjælp SPA, men det er mindre hyppigt anvendt, med mindre end 10 EMDB poster, delvis fordi pletten selv kan forstyrre integriteten af makromolekylet 31. To andre TEM teknikker fremmer 3D rekonstruktion er 2D elektron krystallografi og elektron tomografi. 2D elektron krystallografi kræver en plan eller rørformet krystal; krystallen er elektron diffraktion bruges til 3D rekonstruktion kan føre til atomar opløsning 32. I elektron tomografi af forglasset eller traditionelt faste prøver, er et makromolekyle eller sub-cellulær komponent drejet i TEM til efterfølgende tomografisk rekonstruktion 33, med den fordel, at ental genstande kan rekonstrueres; dog på nuværende denne teknik har en opløsning grænse mellem 40 og 20 A 34,35. Blandt alle disse molekylære TEM teknikker, har SPA NS og cryoEM data været den mest udbredteanvendes. Protokollen illustreret her er dedikeret til at opnå cryoEM billeder er egnet til SPA-analyse; alligevel de fleste af protokollen også gælder for cryoEM af 2D krystaller og tomografiske prøver.
En vellykket cryoEM session afhænger af den kombinerede succes mange kritiske skridt; vigtige aspekter at huske på, forklaring af fælles cryoEM artefakter og hvordan man undgår dem, er beskrevet i de følgende afsnit. Dette afsnit beskriver også retningslinjer for dataindsamling for at opnå høj kvalitet 3D-rekonstruktioner ved hjælp af spa-metoden.
Undgå overgang til krystallinsk is. Et centralt aspekt er, at prøven har brug for at bo i glasagtigt tilstand fra det øjeblik af kryo-kaster hele TEM observation. Således efter indstikning prøven i flydende ethan alle efterfølgende trin udføres ved flydende nitrogen (-196 ° C) eller i flydende helium (-269 ° C) temperaturer. Opvarmning til over -135 ° C forvandler glasagtigt vand itil krystallinsk vand; derefter makromolekylære omlejringer kan finde sted og vand krystaller dominerer billedet (figur 3A); prøven skal kasseres. Utilsigtet prøve warm-up kan ske, hvis cryo-fremryk, overførsel af den frosne gitter mellem beholdere (selvom beskyttet af en gridbox), og / eller kryo holder indsættelse i TEM er for langsomme, eller hvis håndtering pincet var tilstrækkeligt præ- afkølet. Betydelig vakuum forværring i TEM ved kryo-overførsel (de kolde prøve fælder varmere indkommende luft) kan også varme op prøven. Endelig kunne over-bestråling af prøven også resultere i overgang til krystallinsk is.
Minimer is forurening. I betragtning af den lille prøvevolumen (3-5 pi) anvendes på TEM nettet, kan fordampning koncentrere bufferkomponenter (salt, rengøringsmidler) og dermed påvirke makromolekylære integritet herunder tab af multimert tilstand. En høj relativ fugtighed (RH) mikromiljø eller kammer omgås dette problem. Alternativt cryo-fremryk kan gøres tilstrækkeligt ventileret miljø kølerum. Efter cryo-kaster RH bør være så lav som muligt for at forhindre is kontaminering eller kondensation af omgivende fugtighed på kryo-nettet, som kryo-grid selv fungerer som en kold fælde. Ice forurening består af partikler med høj kontrast og ingen underkonstruktionen med størrelser på mellem ~ 5 nm og flere mikron, som interfererer med eller helt blokerer billedet. Undgå luft udkast, taler / vejrtrækning mod kryo-grid under luft overførsel, og reducere relativ luftfugtighed. Åbne beholdere med flydende kvælstof med kondensvand (synlige som hvide svævestøv) bør også kasseres.
Maksimer makromolekylære orienteringer / synspunkter. For prøve support, et valg, der skal foretages, er mellem sande vandudtryk net og tynd carbon løbet vandudtryk net. Dette afhænger af (I), hvor prøven breder sig over carbon film versus carbon huller, (ii) tilgængelig prøve koncentration, som bare huller kan kræve en koncentration 100X højere end carbon støtte for en lignende partikel massefylde på billedet (fra ~ 0,02-2 uM), og (iii) hvor tilfældig er fordelingen af makromolekyle orienteringer. Bemærk, at glød udledning, hvilket gør kulstof hydrofile, vil få stor effekt i alle tre aspekter, og at dette vil være prøve-afhængig. Med hensyn til orienteringen af makromolekylet, mens en tilbagevendende visning er ønskeligt for den oprindelige strukturelle bestemmelse ved tilfældig konisk genopbygning, tilfældighed af makromolekylære synspunkter er ønskeligt, når forfine 3D rekonstruktion til højere opløsninger. I vores eksempel, RYR1 interagerer med carbon med en favorit "firdoblet 'visning (figur 2D) og kræver vandudtryk gitre for tilfældighed af orienteringer og højere opløsning 36.
Maksimer SNR. Den bedste strategi for at øge SNR er at reducere baggrunden støjkilder. Overdreven istykkelse og (hvis det findes) kulstof filmtykkelse ud over, hvad der er behov for at støtte og integrere proteinet vil tilføje ekstra støj. Således istykkelsen bør reduceres til det strengt nødvendige ved at styre blotting tid, tryk, RH, og filtrerpapir kvalitet. For carbon support, er en tynd (~ 5 nm) carbon film overtrukket over tykkere holey carbon film: den tykke holey carbon tilvejebringer mekanisk modstand, medens prøven afbildes over tynde carbon-dækket hul. På den anden side, Bemærk, at meget tynde is og / eller carbon kan resultere i en let brudt støtte, der kan blive til en bane (figur 3D). For at maksimere SNR bør unødvendige bufferkomponenter undgås. For membranproteiner, vaskemidlet tager en væsentlig vejafgift på kontrast (se figur 2D, højre panel). Desuden ved at reducere overfladespændingen af detergent ændrer den måde, hvorpå prøven spredes på underlaget. Nogle membranproteiner kræver tilstedeværelse af lipid foruden theergent, hvilket yderligere reducerer kontrasten. For at overvinde dette kan prøven fortyndes i en puffer med lavere detergentkoncentration og uden lipid lige før cryo-kaster 37. Nye alternative rensemidler 16 og anvendelsen af nanodisks 38 at stabilisere det transmembrane domæne komponent synes at være vellykkede metoder til billeddannelse membranproteiner af cryoEM.
Stræb efter billeder af høj kvalitet, og forberede sig til CTF korrektion. Forglasset prøver kræver høje ude af fokus værdier for at generere tilstrækkelig billede (fase) kontrast hvor CTF, den funktion, der vedrører intensiteten til frekvensen, har flere nul overgange, hvorefter der ikke er nogen information. Mens CTF korrektion er ikke nødvendig for lav opløsning 3D-rekonstruktion, når der sigtes for højere opløsning, for at inddrive en nøjagtig gengivelse af 3D-objektet, billeder med forskellige defoci skal indsamles så beregningsmæssige CTF korrektion kan gøres.CTF beslutsomhed og korrektion er inkluderet i de store SPA softwarepakker 4-7; oplysninger kan findes andre steder 39. For optimal CTF korrektion, anvender en række defoci. En god strategi er at skifte blandt 3-4 ude af fokus værdier. Værdierne afhænger af størrelsen af makromolekylet (større størrelser kræver mindre defokusering) is / carbon tykkelse (tyndere prøve kræver mindre defokusering), og spændingen (lavere spænding kræver mindre defokusering). For 200 kV, et godt udgangspunkt række værdier er 2,5, 3, 3,5 og 4 um Defocus. Den CTF manifesterer sig som alternerende ringe af høj og lav intensitet (Thon ringe 40) i den gensidige rum repræsentation, magt spektrum. Visning kraftspektret vil afsløre potentialet for beslutning; frekvensen af den bredeste synlige Thon ring er tættest a priori estimat af opnåelige opløsning. Den effekt frekvenser bør kontrolleres regelmæssigt, og astigmatiske (ikke cirkulære) Thon ringe (figur 3C) skal korrigeres med målsætningen stigmatorelementet. Thon ringe skal være synlige mindst op til den ønskede opløsning.
En cryoEM datasæt opnået ved hjælp af denne protokol kan direkte behandles af SPA for at generere en 3D-rekonstruktion. Selv med en ideel prøve, vil kvaliteten af 3D-rekonstruktion afhænger af ydeevne og specifikationer for TEM udstyr og på billedbehandling. Med de fortsatte forbedringer i begge disse fronter, og med særlig omtale til de nyligt udviklede direkte elektron detektorer, muligheden opnå 3D rekonstruktioner på atomar opløsning mere konsekvent er tættere på end den nogensinde har været.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
| Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
| Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
| Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
| Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
| 350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
| Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
| Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
| Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
| Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
| Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
| Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
| Transmission electron microscope 200 kV | FEI | Model Tecnai F20 | |
| CCD Camera 4k x 4k | Gatan | UltraScan 4000 UHS | |
| Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
| Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
| Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
| 3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
| Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |
References
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Franzini-Armstrong, C. RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units. Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
- Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Ludtke, S. J. 3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN. Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).
- Radermacher, M., et al. Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle. J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).
- Stewart, A., Grigorieff, N. Noise bias in the refinement of structures derived from single particles. Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).
- Serysheva, I. I., et al. Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel. Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).
- Cheng, Y., et al. Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques. J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).
- Stark, H. GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).
- Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).
- Amunts, A., et al. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, e00461- (2013).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).
- Lerch, T. F., et al. Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution. Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).
- Govindasamy, L., et al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).
- Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).
- Ge, P., Zhou, Z. H. Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).
- Clare, D. K., et al. ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin. Cell. 149 (1), 113-123 (2012).
- Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. Molecular model of the human 26S proteasome. Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).
- Gatsogiannis, C., Markl, J. Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units. J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).
- Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. Membrane proteins: the 'Wild West' of structural biology. Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).
- Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).
- DiMattia, M., et al. purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).
- Samso, M., Shen, X., Allen, P. D.
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Kuhlbrandt, W.
- Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches. Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography. Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).
- Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM. Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).
- Sharma, M. R., et al. Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor. J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
- Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome. J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).
- Thon, F. Phase contrast electron microscopy. , Academic Press. New York. (1971).
