Introduction
Målet med cryoEM är att få elektronmikroskopiska bilder av makromolekyler i sitt hemland hydratiserat tillstånd. Genom att bädda makromolekylen i förglasat vatten, kan en frusen-hydratiserade provet införas direkt och visualiseras i TEM instrumentet. Förglasning, uppnås genom flash frysning (10.000 ° C / sek), fryser provet utan vatten kristallisation och ser till att molekylära omflyttningar under frysning är obetydliga. Överskottet av elektron spridning av provet med avseende på den omgivande bufferten ger en liten men tillräcklig kontrast för att se makromolekylen i frånvaro av någon fläck 1. Datoriserad bildbehandling kan sedan användas för att återskapa den makromolekyl s 3D-strukturen. Stora makromolekyler i ~ 500 kDa- multi MDa sortimentet är idealiska prover för cryoEM (som representerar över 80% av elektronmikroskopi Data Bank (EMDB) poster); dessa inkluderar proteiner, proteinkomplex, protein-nukleinsyra complexes och membranproteiner inbäddade i ett dubbelskikt. Dessa makromolekyler är mindre troligt att kristalliseras (med mindre än 2% går i databasen PBF) men det är ofta så att mindre bitar lösas genom röntgenkristallografi eller NMR-kan dockas i 3D kuvertet skapas av cryoEM. Å andra sidan, några av de största strukturerna lösas genom cryoEM kan identifieras inom den fullständiga cellen genom tunnsektionen TEM 2. Således cryoEM överbryggar effektivt storleken och upplösningen klyftan mellan subcellulära och atomstrukturer.
CryoEM återspeglar bättre makromolekylen s nativa strukturen än den mer klassiska metoden för negativ färgning (NS), där makromolekylen är dehydratiseras och omgiven av ett skikt av tungmetall fläck varvid regionen av fläck utslagning skapar ett kraftigt kontraste "negativ" bild 3. I båda fallen ger elektronstrålen 2D projektion bilder av makromolekyler, som kallas partiklar, där sHAPE beror på orienteringen av makromolekylen med avseende på den elektronstråle. Många partiklar, åtminstone ~ 1000 och med ingen övre gräns, kan analyseras på datorn med "enda partikel analys" (SPA) programvara för att öka signalbrusförhållande (SNR) men medelvärdes samt hitta partikelns spatiala orienteringsparametrar behövs för att återskapa makromolekyl 3D struktur genom baksidan projektion 4-7. NS, med högre SNR, används för preliminär prov karakterisering och generera en de novo 3D rekonstruktion; sin resolution sällan överstiger 20 Å, vilken tas ut av uttorkning och storlek tungmetall säd. I allmänhet, för cryoEM 3D strukturbestämning, en lågupplöst 3D rekonstruktion först erhållits från NS och sedan cryoEM används för att förfina denna lågupplöst initiala karta för att ytterligare studera makromolekyl i sitt ursprungliga hydratiserat tillstånd, för att se dess interna struktur, och för att öka sin resolution. Ingente att om NS modellen förvrängd (det vanligaste exemplet är att platta till följd av uttorkning 8) och cryoEM partiklarna hade låg SNR, då distorsionen kunde bära in i cryoEM modellen (modell-partiskhet artefakt, vilket är vanligt i låg SNR dataset 9). Strukturell distorsion skulle resultera i obalans mellan det nationella systemet och cryoEM råa partiklar och mellan rå cryoEM partiklarna och motsvarande prognoser för 3D-modellen vinkelrätt mot plattriktningen. Modell partiskhet kan lösa sig själv som 3D-modellen genomgår successiva förfining cykler. Om detta inte inträffar, vilket skulle upptäckas som brist på överensstämmelse mellan rå cryoEM partiklar och motsvarande prognoser från 3D-modellen, sedan en de novo modell bör byggas från cryoEM uppgifterna. En bra strategi skulle kunna vara att använda vinkel beredning algoritmen 10, vilket kan ge flera möjliga 3D volymer, och sedan använda NS 3D-modell för att välja den bästa möjliga cryoEM modellsom kommer att förfinas ytterligare 11. En ännu bättre strategi är att öka SNR för den cryoEM dataset (se särskilt avsnitt i diskussions).
Den biokemiska kvaliteten av den renade makromolekyl har en yttersta inflytande på det slutgiltiga resultatet. Den makromolekyl, som renats från vävnad eller uttrycks i heterologa system, måste ha en hög grad av renhet och vara strukturellt intakt. Det ska varken bilda aggregat bör inte heller dela upp. För att definiera en viss konforma bör villkoren förberedelse främja en enhetlig konforma tillstånd. Att studera komplex, är det optimalt att deras k D är i nM-området, annars fixativ har med framgång använts för att stabilisera lägre affinitetsinteraktioner 12,13.
Obearbetade cryoEM bilder ger värdefull information om dimensioner, allmän översikt, aggregationstillstånd / multimerise, homogenitet och interna struktur macromolecule. Trots potentialen för tekniken är vida förbättrad med bildbehandling. En 3D-struktur avslöjar makromolekyl övergripande arkitektur, 3D läge av ligander och subenheter, konformationsförändringar, och möjliggör dockning av atomstrukturer bestäms av röntgenkristallografi eller NMR. Mängden information av en 3D-rekonstruktion ökar stegvis när upplösningen ökar: i allmänhet 15-20 Å upplösning medger entydig dockning av atomstrukturer, vid 9-10 Å alfahelixar syns som stavar, vid 5 Å är det möjligt att urskilja beta ark, och en upplösning på 3,5 Å och bättre är det möjligt att bygga en atommodell 14.
Möjligheten att få informativa bilder och en 3D-rekonstruktion med SPA från relativt små mängder av provet gör cryoEM en attraktiv teknik, som 3-5 pl av minst 0,05 mg / ml är tillräckligt för att förbereda en TEM galler. Minimiinstrumentkravför cryoEM är en hemmagjord eller kommersiell Cryo-kolv, ett elektronmikroskop med ultrahög vakuum, bildinspelningsmedia och lågdos-kit, en kryo-hållare med sin pumpstation, en glimurladdning apparat, och en förångare. Icke-väsentliga men längre önskvärda funktioner på TEM är CCD-kamera (finns i alla moderna TEM) eller en direkt elektrondetektor, fältemission pistol (FEG), energifiltrering, och hög kapacitet datainsamling programvara. Denna programvara i princip möjliggör insamling tiotusentals partiklar i en enda cryoEM session 15, men de ökade behoven datalagring och efterföljande övervakad efterbearbetning tiden behov att beaktas. FEG kombinerat med kontrastöverföringsfunktionen (CTF) korrigering ligger bakom de flesta 3D-rekonstruktioner som nådde upplösningen är tillräcklig för att visualisera alfahelixar. Vid denna tidpunkt, är också provberoende nivå på upplösning: nå 10 Å upplösningen är mindre vanligt att membranproteiner medan omhög grad av symmetri är närvarande då atomär upplösning är mer genomförbart. Den senaste tidens utveckling av direkta elektrondetektorer har möjlig atomär upplösning även för makromolekyler med låg (4x) eller ingen symmetri, där kvaliteten på cryoEM elektrondensitetskartorna matchar dessa härrör från röntgen diffraktionsdata 16,17.
Praktiska exempel illustrerar funktionerna i tekniken finns här i fyra viktiga typer av makromolekyler där cryoEM har ett långsiktigt chefsroll i deras strukturbestämning. (I) Med deras ikosahedra symmetri som ökar datamängden med 60-faldigt och sin storlek som medger trofast och reproducerbar inriktning, har strukturerna för flera ikosaedriska virus lösts till nära-atomär upplösning av cryoEM följt av SPA 18. Vi visar ett exempel på en klass av ikosaedriska virus, de adenoassocierade virus (AAV), för vilka nästan atomstrukturer av cryoEM och genom cryoEM / röntgen hybrid metoder finns 19,20. (Ii) makromolekyler med spiralstruktur inkluderar mikrotubuli, trådar och virus. Deras repetitiva enheter längs spiralaxeln kan analyseras med en mer komplex version av SPA anpassas till den spiralformade geometrin 21. I exemplet visar vi tobaksmosaikvirus (TMV), ett RNA-virus som har lösts till atomär upplösning av cryoEM 22. (Iii) Stora lösliga proteiner har mer än väl studerat. Bland dessa, makromolekyler som bildar symmetriska multi cylindrar utgör en återkommande arkitektur ofta lösas på subnanometer upplösning 23,24. Här visar vi bilder av KLH, en ryggradslös syrebärare, där en hybrid molekylär modell skapades från cryoEM / röntgenkristallografi hybridmetoder 25. (Iv) Membranproteiner är en viktig klass av proteiner; de utgör ca 3/1 av proteinerna som kodas av det humana genomet, men de är svåra att karakterisera strukturellt grund komplikationer i samband med stansmembrane stabilisering domän 26, som utgör mindre än 1,5% av de strukturer som löses genom någon strukturell teknik kombineras. Roll cryoEM och 3D-rekonstruktion i sin strukturbestämning exemplifieras med ryanodinreceptorn (Ryr), en stor eukaryot intracellulär Ca2 + kanal viktigt muskelsammandragning och hjärnan signalering. De högsta upplösningen cryoEM strukturer hittills, med 10 Å upplösning, avslöjar sekundära strukturen 27.
Protocol
1. Cryo-hållare Förberedelse och underhåll
OBS: Den torra pumpstationen, som består av en turbo pumpstation och en eller flera kalla scen styrenheter, används främst för tre syften: a) Det är en säker plats att lagra Cryo innehavarna när de inte används. Det korrekta sättet att lagra innehavarna är att lämna dem på stationen under vakuum. b) För att förånga frost och fukt uppbyggd som uppstår när det flytande kvävet avlägsnas från dewarkärlet och spetsen av den kryo innehavaren exponeras; Detta uppnås med uppvärmningscykel. c) att regenerera zeolittorkmedel, och för att uppnå ett högt vakuum i cryoholder Dewars. Detta är nödvändigt för att hålla en konstant temperatur när man gör kryo elektronmikroskopi.
- Warm-up cykel.
- Sätt i kryo hållaren i en av de pumpportar i pumpstationen. Haka upp en av de utrymnings rör till metall utlopp under vakuumventilen på hållaren. GöraKontrollera att alla ventiler på stationen (V1, V2 och V3) och på kryo hållaren är stängda.
- Slå på den kalla scenen controller och anslut den till hållaren genom kontrollkabeln. Slå på strömbrytaren för turbo pumpstation.
- Starta Uppvärmningstid cykel alternativ i den kalla scenen controller. När vakuumet i turbo pumpstationen läser 10 -3 Torr eller bättre, öppna ventilen V2 fjäril, vänta tills vakuumet stabiliseras och öppna spjällventilen V1.
- Kör uppvärmningscykeln för cirka 30 minuter tills temperaturen i hållaren är stabil över 20 ° C. Nära V1, och sedan stoppa cykeln.
- Zeolit cykel. Kör Zeolit Cycle Mellan 4 tim och O / N Innan en CryoEM Session, och en gång i veckan, om den inte används.
- Starta Zeolit cykel alternativ och välj den tid som krävs för att uppnå ett bra vakuum, i intervallet 1-2 x 10 -4 Torr, och därmed lång hålltid. När vakuumet når 10 -3Torr, öppna Dewar evakueringsventil, V3. Pumpstationen kommer sedan evakuera linjen till innehavaren; vänta tills vakuumet stabiliseras.
- Öppna ventilen på Cryo hållaren. När cykeln är klar, stäng ventilerna i motsatt ordning som de öppnades: ventilen på hållaren, sedan V3, V2, och slutligen V1. Stäng av turbo pumpstation och den kalla scenen controller, och koppla bort kryo hållaren från kalla scenen controller och turbo pumpstation.
2. Grid förberedelse
- Rengöring.
OBS: När du använder kommersiella holey galler, rekommenderas att rengöra dem före användning, för att avlägsna alla rester av polymer som användes i tillverkningsprocessen. Gör detta i ett glas petriskål med 5 lager av filterpapper som i botten.- Placera gallren på filterpapper med holey kolet uppåt.
- Med hjälp av ett glas pasteurpipett, blöta papperet med flera droppar of kloroform runt gallren tills de börjar bara flyter.
- Täck petriskål med locket på glänt i ett dragskåp O / N.
- OBS: den tunna stöd kol (steg 2,2-2,3) kan utelämnas eftersom isen skiktet direkt kan bildas över de små hålen i den holey galler kol.
- Med hjälp av en pincett, klyva en bit av glimmer att exponera två nya ytor. Placera de nya exponerade ytor av glimmer sidan uppåt på ett vitt papper i en petriskål.
- Placera petriskål i glaskupan av en kol förångare. Starta pumpen ned sekvensen tills vakuum är under 2 x 10 -6 Torr. För att förånga eventuella föroreningar på ytan av kolstaven, utföra en pre-indunstning med petriskålen täcks. Sedan vädra ur glaskupa och ta bort locket från petriskål.
- Utför pumpen ned sekvensen tills vakuumet är under 10 -6 Torr och belägga glimmer med ett tunt lager (~ 5 nm) av kol. Använd ögonskydd vid kolavdunstning. Övervaka tjockleken på kolet filmen efter erhållen mörkret på papperet som hade placerats under glimmerblad.
- Överför Thin Carbon till TEM Grid.
- Skär en 0,5 x 1 cm bit belagt glimmer och flyta kolet av på den plana ytan av filtrerad, avjoniserat vatten. Använd optisk linspapper för att få en platt vattenyta. Med hjälp av en pincett, sätta holey kol sidan av rutnätet i kontakt med den övre ytan av flytande kolskikt och plocka upp den.
- Upprepa steg 2.3.1 och 2.3.2 tills ett tillräckligt antal galler är beredda.
- Glimurladdning.
OBS: glimurladdning omvandlar den naturligt hydrofoba kol-beläggningsskikt av gallren i hydrofil. Detta steg är valfritt.- Placera gallren med kolet sidan uppåt på en 7,5 x 2,5 cm glasskiva täckt med Parafilm. Placera den i kammaren av glöd urladdningsutrustningen och stäng kammaren.
- Pumpglasklockan och glöd-utsläpp under 20 s vid 25 mA och 7 x 10 -2 mbar.
OBS: Under denna tid en ljuslila glöd blir synlig. Avlägsna glasskiva med gallren och använda dem inom 1 timme, annars kommer de att behöva vara glöd urladdat igen.
3. Prov Plunge frysning
OBS: Använd skyddsglasögon och lämpliga skor när du använder detta instrument för att skydda mot flytande kväve och etan tänk.
- Slå på steget frysning apparat. Fyll luftfuktare behållaren med destillerat vatten. Ställ in önskad temperatur, relativ luftfuktighet och störtar villkor för blot tid, blot kraft och adsorptionstid (22 ° C, 95%, 2 sek, 2 och 40 sek i exemplet som presenteras här). Placera nya blotting filterpapper.
- Kyl etan behållaren nedåt genom att fylla den yttre behållaren med flytande kväve tills stabilitet uppnås (ca 10 min). När flytande kväve stannar Boiling, placera spetsen på röret som kommer från etan tanken i den inre kammaren och öppna ventilen mycket långsamt. Vätskeform etan i den inre kammaren och fylla den till en mm från toppen. Undvik att frysa etan. VARNING: etan är extremt brandfarligt och explosivt.
- Se till pincett är inriktade inom steget frysapparaten.
- Slå på fukt. Ladda ett rutnät på pincetten, och ladda 3-5 l av provet på kolytan (matta sidan) av holey nätet. Vänta för provet att adsorbera till nätet och utföra blotting för att uppnå ett tunt vätskeskikt.
- Flash-frysa rutnätet genom att störta den i flytande etan. Avlägsna pincett-grid enheten från vätske etan innehar pincett stadigt, och överföra den till den yttre kammaren med flytande kväve. Överför gallret till en liten rutnät låda nedsänkt i flytande kväve. Se till att hålla förglasat provet i flytande kväve hela tiden under överföring till antingen ackumulatortankeneller till den kryo hållaren.
OBS: rutnät lådor kan lagras i en stor kapacitet (35-50 liter) flytande kväve dewar under minst ett år. För praktisk förvaring kan de placeras i en 50 ml Falcon rör med två borrade hål i toppen och en fiskelina fäst vid sin mössa som kan dras från mynningen av Dewar.
4. Överför Cryo-nätet till TEM
- Sätt i Cryo hållaren i Cryo-överförings arbetsstation. Se till att inte skada spetsen av innehavaren under införande. Kontrollera om det finns små fibrer och damm på stången och O-ringen av Cryo hållaren med hjälp av en lupp, om det finns någon ta bort den med optisk linspapper.
- Fyll dewarkärlet av kryo hållaren och kärlet arbetsstation med flytande kväve. Undvik att spilla den flytande kväve med hjälp av den fångade tratt som kommer med arbetsstationen.
- Anslut Cryo hållaren till den kalla scenen ansvarige att övervaka temperaturen, och fortsätta att lägga flytande kväve & #160; tills temperaturen stabiliseras vid ca -194 ° C. Se till att nivån av flytande kväve är under nivån för vakuumtätningen både i kärlet arbetsstationen och kryo hållaren dewar. Pre-kyla galler pincett, klämringen och den trubbiga änden av klämringen verktyget på arbetsstationen. Också för-kyla en uppsättning av stora pincett och en skruvmejsel i en annan dewar fylld med flytande kväve.
- Snabbt överföra Cryo nätet box som innehåller de frysta hydratiserade galler för att det flytande kvävet i arbetsstationen med hjälp av de stora pincett. Öppna nätet rutan kryo med skruvmejseln, ta den frysta hydratiserade gallret och placera den i provhållaren platsen.
- Placera klämringen ovanpå gallret och tryck försiktigt med den trubbiga änden av klippet ringverktyget tills den sitter stadigt på plats. Stäng kryo-slutare. Ta bort verktyg och Cryo nätet box från arbetsstationen.
- Flytta hela arbetsstation med hållare och galler till mikroskopet konsolen för att miniMize överföringstiden av nätet på rumsluften.
- Toppa TEM anti contaminator med flytande kväve, som hade tidigare fylld och kyls ned under minst 20 min. Pre-luta mikroskop scenen till -60 °.
NOTERA: Detta kommer att minimera förlust av flytande kväve som hållaren är införd i luftslussen. - Börja pre-pumpluftsluss cykel på mikroskopet. Se till att ventilen till elektronkanonen är stängd (speciellt om det är en FEG TEM). Vänta på pre-pumpluftsluss sekvensen till slut (ca 2 min) innan du sätter i kryo hållaren.
OBS: Detta indikeras av den röda lampan på scenen släcks. - Sätt i hållaren i luftslussen och vrid den 90 ° medurs; anslut den kalla scenen controller sladden till Cryo innehavaren att övervaka temperaturen. Vänta igen tills den röda lampan släcks och rotera både scenen och hållaren tillbaka till 0 ° position för att sätta in hållaren i TEM: s high vakuumkolonn.
- Se till att temperaturen går aldrig över -160 ° C för att undvika bildning av kristallint is.
- Fyll dewarkärlet av Cryo hållaren. Vänta 15-45 min tills innehavaren har termiskt till jämvikt och TEM vakuumet har återhämtat innan inspelning av bilder.
- Om bubblande av flytande kväve upptäcks, ändra flytande höjd kvävefyllning, eller försiktigt röra bubblande ursprung med en bomullspinne.
5. Låg dos datainsamling
OBS: lågdos datainsamling teknik används för att minimera elektronstrålningsskada till provet genom att begränsa exponering för 20 elektroner / Å 2. Detta uppnås genom att växla mellan tre konfigurationer: "söka", med låg förstoring (~ 5,000X) och brett synfält, "fokus", med hög förstoring (~ 150,000X) och små synfältet, och "exponering", med den önskade slut magnifiering och innehållande området av intresse som skall registreras. Blank balken mellan lägena.
- Konfigurera TEM och låg dos Program
- Dra tillbaka kryo-slutare och öppna kolumnventilerna.
- Centrera scenen och ställa in eucentric höjden (Z) med alfa wobbler till rock scenen ± 15 °. Justera Z-position tills det inte finns någon märkbar rörelse medan scenen gungar. Aktivera programmet låg dos och välj detektor för varje läge.
- I exponeringsläge hitta ett område av nätet som inte har någon kol, justerar belysningen genom att välja den optimala kondensorn bländare och punktstorlek så att området som ska spelas in är helt upplyst. Var noga med att sprida strålen i overcondensation riktningen.
- I sökläge, hitta en liten funktion som kommer att vara lätt att identifiera vid högre förstoring. I exponeringsläge, centrera denna funktion med joysticken (xy scenen controller). Start vid lägre förstoring om bedriftenure är inte i synfältet.
- I sökläge, ta den här funktionen till mitten av fältet med hjälp av låga bildväxlingskontroller dos xy. Gå till exponeringsläge och flytta funktionen längs tiltaxeln med hjälp av styrspaken tills det är ur det område som ska spelas in (0,5-3 mikron). Gå fokusera läge och centrera funktionen med hjälp av xy bildväxlingskontroller. Start vid lägre förstoring om funktionen inte är i synfältet.
- Håll strålen centrerad hela tiden.
- Datainsamling
- Dra tillbaka kryo-slutare och öppna kolumnventilerna. Aktivera låga programdosen.
- I sökläge, identifiera en rutnät som innehåller tunn, homogen is.
- Välj ett lämpligt hål och placera den i mitten av fältet. Växla fokusera läge och fokusera bilden. Sedan underfocus bilden mellan 0,5-4,5 mikrometer.
- Växla till exponeringsläge och spela in bilden.
- Växla söka läget och upprepa steg 5.2.3-5.2.4.Flytta över torget rutnät undvika förexponering goda hål som ska spelas in.
- Avsluta ruta och flytta till en annan bra.
- Justera höjden (Z) och fortsätt datainsamling.
Representative Results
Noggrann utförande av alla protokoll stegen i figur 1 möjliggör visualisering av frysta hydratiserade, icke-färgade makromolekyler. Resultat för fyra representativa prover med olika strukturella egenskaper visas. Deras mikroskopiska bilder som erhållits genom metoderna i NS och cryoEM jämförs (Figur 2). (I) NS bilder av AAV5 avslöjar virusliknande partiklar av omkring 130 Å diameter. Den samexistens mellan fulla och tomma strukturer motsvarar trasiga (som tillåter fläcken inträde) och strukturellt intakta kapsider, respektive. CryoEM visar likformigt tomma strukturer; verkligen dessa viruspartiklar inte innehåller genetiskt material 28. NS visar dominerande runda partiklar medan cryoEM visar mestadels sexkantiga partiklar, vilket speglar deras ikosahedra formuläret. (Ii) Bilder av de spiral TMV visar stavar av 180 Å diameter och variabel längd, ofta längre än 0,1 um, med en spiralformad upprepning av 23 en synlig bådei NS och i cryoEM. Den 40 en central kanal är fylld med fläck i NS bilder och tomt i cryoEM bilderna. (Iii) Native KLH, ett didecamer 8 MDa, monterar i karakteristiska fat 350 Å diameter och 400 Å längd. NS och cryoEM avslöjar KLH: s rektangulära sidovyer och cirkulära slut på visningar. Båda teknikerna avslöjar sex räfflor vinkelrätt mot symmetriaxeln och jämnt fördelade morfologiska enheter inom varje grupp. CryoEM avslöjar ett tomt inre struktur. (Iv) ryanodinreceptorn, en stor tetramert intracellulär kanal av 2,26 MDa, ses som en kvadrat på 275 x 275 Å 2. Intrikata ytan funktioner som en central kors och en central depression manifest som fläck ansamling av NS, och som lägre densitet regioner enligt cryoEM. Medan NS visar liknande kontrast i alla fyra testade proverna, jämförelse av de cryoEM panelerna utsätter lägre SNR (kontrast) i RyR1 på grund av närvaron av detergent för att solubilisera detta membranprotein.
Typiska exempel på cryoEM artefakter visas för RyR1: kristallint is, is förorening, astigmatism, och webb-liknande strukturer (Figur 3). Deras orsaker och förebyggande beskrivs närmare i diskussionsavsnittet.
SPA och 3D-rekonstruktion av fryst hydrerad RyR1 avslöjar sin fyrfaldigt symmetrisk struktur, vilket avspeglar proteinets homotetrameric organisation (Figur 4A). Den cytoplasmatiska domänen bildar en fyrkantig prisma av 275 x 275 x 120 Å 3 och innehåller flera reproducerbara globulära domäner som bildar en byggnadsställning liknande struktur. Transmembrandomänen bildar en mindre avsmalnande fyrkantig prisma med maximala dimensioner 115 x 115 x 60 A 3. Vid 10 Å upplösning är det möjligt att visualisera alfahelixar (Figur 4B). 3D skillnad kartläggning kan avslöja positionen viktiga ligander, i det här fallet 3D skillnaden karta över FKBP12, en 12 kD protein considerött en subenhet av RyR1, ovanpå RyR1 (Figur 4C) 29. Slutligen konformationsförändringar ger en dynamisk bild av makromolekyl. I det här fallet RyR1 tidigare stabiliserats antingen slutna eller öppna förhållanden avslöjar en massa sloka från slutna till det öppna läget (Figur 4D) 27.
Figur 1. Flödesschema för kryo elektronmikroskopi teknik. Diagrammet belyser de viktigaste stegen i protokollet.
Figur 2. Jämförelse av NS och cryoEM för en mängd olika prover. (A) AAV5, en ikosahedra virus. (B) TMV, en spiral virus. Inläggningar visar spiral upprepning, av 23 Å. (C) Native KLH. (D) RyR1; representativa vyer är markerade (f, fyrfaldig vy och s, från sidan). Alla prover avbildas under låga förhållanden dos och med samma förstoring av 50,000X en under en accelererande spänning av 200 kV. Skalstrecken, 10 nm. Alla NS prover om stöd kol, cryoEM prover A, C, D är på tunna kol över quantifoil och cryoEM prov B är direkt över quantifoil hålen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Galleri av bilder som visar vanliga cryoEM artefakter på en RyR1 cryoEM prov. (A) Kristallin is. (B) Ice kontamination (pilar). (C) Astigmatism. RyR1s i astigmatiska bilden är knappt synliga. Den infällda till höger visar effekt respektrom av bilden med asymmetriska Thon ringar. Den infällda till vänster visar effektspektrum för en icke-astigmatisk bild som referens. (D) Webbliknande strukturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. CryoEM och 3D-rekonstruktion av ryanodinreceptorn. . (A) isosurface representation (B) Dockning av en kristallstruktur RyR1 s N-terminal 30 visar god överensstämmelse mellan de atomära koordinater och cryoEM kuvertet; Pilarna pekar på två alfahelixar som sticker ut från strukturen. Arrowhead anger en av de fyra helixar som omger poren av jonkanalen. De streckade linjerna anger gränserna för membranet. (C) RyR1 och 3D loning av FKBP12 liganden (orange färg). (D) Conformational ändringar av RyR1 i går från den slutna (orange) till den öppna (svart nät) konforma. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
TEM följt av SPA har bidragit många makromolekylära 3D strukturer, närmar 2.000 poster i EMDB i mitten 2014. I allmänhet för en given makromolekyl, är en lågupplöst 3D-struktur bestäms först från NS uppgifter, som kan följas av en med högre upplösning cryoEM 3D-struktur. Den höga kontrasten av de molekylära gränser tillhandahålls av NS, vilket underlättar den första 3D-rekonstruktion, senare förfinats av cryoEM med dess förmåga att kartlägga den interna strukturen av makromolekylen i dess helt hydratiserade tillståndet, och möjligheten att uppnå mycket högre upplösning. En annan fördel med cryoEM är elimineringen av uttorkning stress som kan leda till kollaps av makromolekylen. Dessutom finns möjligheten att utelämna stöd kol, vilket eliminerar möjliga yta absorptionseffekter och visar konforma att makromolekylen antar i lösning. Cryo-negativ färgning, en kombination av cryoEM och NS, ger hög kontrast i en helt hydbetygsatt prov och kan också leda till 3D-rekonstruktion med SPA, men det har sällan använts, med mindre än 10 EMDB poster, delvis eftersom fläcken själv kan störa integritet makromolekylens 31. Två andra TEM tekniker som bidrar till 3D-rekonstruktion är 2D elektronkristallografi och elektron tomografi. 2D elektronkristallografi kräver en plan eller tubulär kristall; kristallens elektrondiffraktion används för 3D-rekonstruktion kan leda till atomär upplösning 32. I elektron tomografi av förglasat eller traditionellt fasta prover, är en makromolekyl eller sub-cellulära komponent roteras inne i TEM för efterföljande tomografisk rekonstruktion 33, med den fördelen att singulära objekt kan rekonstrueras; Men i dagsläget denna teknik har en gräns upplösning mellan 40 till 20 A 34,35. Bland alla dessa molekylära TEM tekniker, har SPA i NS och cryoEM uppgifter varit den mestanvändas. Protokollet illustrerade här är tillägnad få cryoEM bilder lämpliga för SPA-analys; ändå de flesta av protokollet är också tillämplig på cryoEM 2D kristaller och tomografiska prover.
En framgångsrik cryoEM session beror på den kombinerade framgången för många viktiga steg; viktiga aspekter att tänka på, förklaring av gemensamt cryoEM artefakter och hur man undviker dem beskrivs i följande stycken. Detta avsnitt beskriver också riktlinjer för datainsamling för att med hög kvalitet 3D rekonstruktioner med hjälp av SPA-metoden.
Undvik övergången till kristallin is. En central aspekt är att provet behöver bo i glaskroppen tillstånd från det ögonblick Cryo-störta hela TEM observation. Sålunda efter störta provet i flytande etan alla efterföljande steg utförs vid flytande kväve (-196 ° C) eller flytande helium (-269 ° C) temperaturer. Värmer till över -135 ° C omvandlar glaskroppen vatten itill kristallint vatten; då makromolekylära omdisponeringar kan ske och vattenkristaller dominerar bilden (Figur 3A); provet ska kasseras. Oavsiktlig prov uppvärmning kan hända om Cryo-nedmatning, överföring av frysta galler mellan containrar (även om skyddade av en gridbox), och / eller Cryo hållare insättning i TEM är för långsam, eller om hanterings pincett var otillräckligt för- kyls. Betydande vakuum försämring av TEM vid kryo-överföring (kalla provfällor varmare inkommande luft) kan också värma upp provet. Slutligen över bestrålning av provet kan också leda övergången till kristallint isen.
Minimera is kontamination. Med tanke på den lilla provvolym (3-5 l) appliceras på TEM galler, kunde avdunstning koncentrera buffertkomponenter (salt, tvättmedel) och därmed påverka makromolekylära integritet inklusive förlust av multi tillstånd. En hög relativ fuktighet (RH) mikromiljö eller kammare kringgås detta problem. Alternativt kryo-nedmatning kan göras på ett tillräckligt ventilerat miljö kylrummet. Efter kryo-störta RH bör vara så låg som möjligt för att förhindra is förorening, eller kondensering av omgivande luftfuktighet på Cryo-grid, som Cryo-grid själv fungerar som en köldfälla. Ice förorening består av partiklar med hög kontrast och ingen underkonstruktion med storlekar på mellan ~ 5 nm och flera mikrometer som stör eller helt blockera bilden. Undvik luftdrag, prata / andas mot Cryo-grid under luftöverföring, och minska relativ luftfuktighet. Öppna vätskebehållare kväve med kondensvatten (syns som vita svävande partiklar) bör också kasseras.
Maximera makromolekylära oriente / åsikter. För prov support, är ett val göras mellan sanna holey nät och tunna kol över holey galler. Detta beror på (i) hur provet sprids över kolfilm kontra kol hål, (ii) tillgängligt prov concentration, så kala hål kan kräva en koncentration 100X högre än stöd kol för en liknande partikeldensitet på bilden (från ~ 0,02-2 M), och (iii) hur slump är fördelningen av makromolekylorienteringar. Notera att glimurladdning, vilket gör kolet hydrofil, kommer att ha en viktig effekt i samtliga tre aspekter, och att detta kommer att vara prov beroende. När det gäller orientering makromolekyl, medan en återkommande uppfattning är önskvärd för den inledande strukturbestämning av slumpmässig koniska rekonstruktion, är slumpmässighet av makromolekylära vyer önskvärt när förfina 3D-rekonstruktion till högre upplösningar. I vårt exempel, RyR1 interagerar med kolet med en favorit "fyrfaldigt" view (Figur 2D) och kräver holey galler för slumpmässighet av oriente och högre upplösning 36.
Maximera SNR. Den bästa strategin för att öka SNR är att minska bakgrundsbullerkällor. Överdriven istjocklek och (om den finns) kol filmtjocklek än vad som behövs för att stödja och bädda proteinet kommer att lägga extra buller. Istjocklek bör alltså reduceras till det minimum som krävs genom att styra läsk tid, tryck, RH, och filterpapperskvalitet. För support kol, är en tunn (~ 5 nm) kolfilm lager över den tjockare holey kolfilmen: den tjocka holey kolet ger mekanisk motstånds medan provet avbildas över den tunna kol-täckt hålet. Å andra sidan, observera att extremt tunna is och / eller kol kan resultera i en lätt bryts stöd som kan förvandlas till en bana (figur 3D). För att maximera SNR bör onödiga buffertkomponenter undvikas. För membranproteiner, tar diskmedel en betydande vägtull på kontrasten (se figur 2D, högra panelen). Dessutom genom att reducera ytspänningen tvättmedel ändrar det sätt på vilket provet sprids på stödet. Vissa membranproteiner kräver närvaro av lipid utöver DETergent, vilket ytterligare reducerar kontrasten. För att övervinna detta kan provet spädas i en buffert med lägre koncentration detergent och utan lipid precis innan kryo-störta 37. Nya alternativa detergenter 16 och användningen av nanodisks 38 för att stabilisera den transmembrana domänen komponenten verkar vara framgångsrika tillvägagångssätt för avbildning membranproteiner från cryoEM.
Sträva efter högkvalitativa bilder och förbereda för CTF korrigering. Förglasat exemplar kräver höga minskad fokus värden för att generera tillräcklig bild (fas) kontrast där CTF, den funktion som relaterar intensitet till frekvensen, har flera noll övergångar, som peka det inte finns någon information. Medan CTF korrigering är inte nödvändig för lågupplöst 3D rekonstruktion, då siktar på högre upplösning, för att återvinna en korrekt representation av 3D-objekt, bilder med olika defoci behöver samlas så att beräknings CTF korrigering kan göras.CTF beslutsamhet och korrigering ingår i de stora SPA programpaket 4-7; detaljer kan hittas någon annanstans 39. För optimal CTF korrigering, använd en rad defoci. En bra strategi är att alternera mellan 3-4 minskad fokus värden. Värdena är beroende på storleken av makromolekylen (större storlekar kräver mindre defokusering), tjockleken is / kol (tunnare provet kräver mindre defokusering), och spänningen (lägre spänning kräver mindre defokusering). För 200 kV, är en bra utgångspunkt intervall av värden 2,5, 3, 3,5 och 4 um minskad fokus. CTF manifesterar som alternerande ringar av hög och låg intensitet (Thon ringar 40) i det ömsesidiga rymden representationen, effektspektrum. Visning av effektspektrum kommer att avslöja potentialen för upplösning; frekvensen hos den bredaste synliga Thon ringen ligger närmast en priori uppskattning av den uppnåeliga upplösningen. Effekt spektrum bör kontrolleras regelbundet, och astigmatiska (icke cirkulära) Thon ringar (Figur 3C) bör korrigeras med målet stigmator. Thon ringar bör vara synlig åtminstone upp till upplösningen önskas.
En cryoEM dataset erhållits med hjälp av detta protokoll kan bearbetas direkt av SPA för att generera en 3D-rekonstruktion. Även med en perfekt prov, kommer kvaliteten på 3D-rekonstruktion beroende av utvecklingen och specifikationer av TEM utrustning, och på bildbehandling. Med de fortsatta förbättringar i båda dessa fronter, och med särskilt omnämnande till de nyligen utvecklade direkta elektrondetektorer, möjligheten skaffa 3D rekonstruktioner på atomär upplösning mer konsekvent är närmare än den någonsin har varit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
| Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
| Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
| Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
| Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
| 350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
| Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
| Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
| Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
| Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
| Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
| Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
| Transmission electron microscope 200 kV | FEI | Model Tecnai F20 | |
| CCD Camera 4k x 4k | Gatan | UltraScan 4000 UHS | |
| Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
| Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
| Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
| 3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
| Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |
References
- Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W.
- Franzini-Armstrong, C. RyRs: Their Disposition, Frequency, and Relationships with Other Proteins of Calcium Release Units. Curr Top Membr. 66C, 3-26 (2010).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. J Vis Exp. (58), (2011).
- Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
- Ludtke, S. J. 3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN. Methods Mol Biol. 673, 157-173 (2010).
- Radermacher, M., et al. Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstruction of the calcium release channel/ryanodine receptor from skeletal muscle. J Cell Biol. 127 (2), 411-423 (1994).
- Stewart, A., Grigorieff, N. Noise bias in the refinement of structures derived from single particles. Ultramicroscopy. 102, 67-84 (2004).
- Serysheva, I. I., et al. Electron cryomicroscopy and angular reconstitution used to visualize the skeletal muscle calcium release channel. Nat Struct Biol. 2, 18-24 (1995).
- Cheng, Y., et al. Single particle reconstructions of the transferrin-transferrin receptor complex obtained with different specimen preparation techniques. J Mol Biol. 355 (5), 1048-1065 (2006).
- Stark, H. GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods Enzymol. 481, 109-126 (2010).
- Wang, L., Lashuel, H. A., Walz, T., Colon, W. Murine apolipoprotein serum amyloid A in solution forms a hexamer containing a central channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (25), 15947-15952 (2002).
- Amunts, A., et al. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: the new Leginon system. J Struct Biol. 151 (1), 41-60 (2005).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, e00461- (2013).
- Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Curr Opin Struct Biol. 21, 265-273 (2011).
- Lerch, T. F., et al. Structure of AAV-DJ, a retargeted gene therapy vector: cryo-electron microscopy at 4.5 A resolution. Structure. 20 (8), 1310-1320 (2012).
- Govindasamy, L., et al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol. 87 (20), 11187-11199 (2013).
- Egelman, E. H. A robust algorithm for the reconstruction of helical filaments using single-particle methods. Ultramicroscopy. 85 (4), 225-234 (2000).
- Ge, P., Zhou, Z. H. Hydrogen-bonding networks and RNA bases revealed by cryo electron microscopy suggest a triggering mechanism for calcium switches. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9637-9642 (2011).
- Clare, D. K., et al. ATP-triggered conformational changes delineate substrate-binding and -folding mechanics of the GroEL chaperonin. Cell. 149 (1), 113-123 (2012).
- Fonseca, P. C., He, J., Morris, E. P. Molecular model of the human 26S proteasome. Mol Cell. 46 (1), 54-66 (2012).
- Gatsogiannis, C., Markl, J. Keyhole limpet hemocyanin: 9-A CryoEM structure and molecular model of the KLH1 didecamer reveal the interfaces and intricate topology of the 160 functional units. J Mol Biol. 385 (3), 963-983 (2009).
- Torres, J., Stevens, T. J., Samso, M. Membrane proteins: the 'Wild West' of structural biology. Trends Biochem Sci. 28 (3), 137-144 (2003).
- Samso, M., Feng, W., Pessah, I. N., Allen, P. D. Coordinated Movement of Cytoplasmic and Transmembrane Domains of RyR1 upon Gating. PLoS Biology. 7 (4), 980-995 (2009).
- DiMattia, M., et al. purification, crystallization and preliminary X-ray structural studies of adeno-associated virus serotype 5. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 10), 917-921 (2005).
- Samso, M., Shen, X., Allen, P. D.
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Kuhlbrandt, W.
- Yahav, T., Maimon, T., Grossman, E., Dahan, I., Medalia, O. Cryo-electron tomography: gaining insight into cellular processes by structural approaches. Curr Opin Struct Biol. 21 (5), 670-677 (2011).
- Briggs, J. A. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 261-267 (2013).
- Harapin, J., Eibauer, M., Medalia, O. Structural analysis of supramolecular assemblies by cryo-electron tomography. Structure. 21 (9), 1522-1530 (2013).
- Samso, M., Wagenknecht, T., Allen, P. D. Internal structure and visualization of transmembrane domains of the RyR1 calcium release channel by cryo-EM. Nat Struct Mol Biol. 12 (6), 539-544 (2005).
- Sharma, M. R., et al. Cryoelectron microscopy and image analysis of the cardiac ryanodine receptor. J Biol Chem. 273 (29), 18429-18434 (1998).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
- Zhu, J., Penczek, P. A., Schroder, R., Frank, J. Three-dimensional reconstruction with contrast transfer function correction from energy-filtered cryoelectron micrographs: procedure and application to the 70S Escherichia coli ribosome. J Struct Biol. 118 (3), 197-219 (1997).
- Thon, F. Phase contrast electron microscopy. , Academic Press. New York. (1971).
