Summary
Nous décrivons ici une technique pour étudier la neurogenèse postnatale hippocampe en utilisant la technique de culture organotypique. Cette méthode permet la manipulation in vitro de la neurogenèse adulte et permet l'application directe d'agents pharmacologiques à l'hippocampe en culture.
Abstract
Nous décrivons ici une technique pour étudier la neurogenèse postnatale l'hippocampe dans le cerveau de rongeurs en utilisant la technique de culture organotypique. Cette méthode maintient la morphologie caractéristique topographique de l'hippocampe, tout en permettant l'application directe des agents pharmacologiques pour les développement gyrus denté de l'hippocampe. En outre, les cultures tranche peuvent être maintenues jusqu'à quatre semaines et donc, permettent d'étudier le processus de maturation des neurones granulaires nouveau-nés. Trancher les cultures permettent la manipulation pharmacologique efficace des tranches d'hippocampe tout en excluant les variables complexes tels que les incertitudes liées à la localisation anatomique profonde de l'hippocampe ainsi que la barrière hémato-encéphalique. Pour ces raisons, nous avons cherché à optimiser les cultures organotypique spécifiquement pour la recherche de la neurogenèse postnatale.
Protocol
NOTE: Toutes les procédures d'animaux étaient conformes aux lignes directrices du ministère de médecine comparée à l'Université de Toronto et de santé bien-être animal.
1. Préparation des tranches hippocampiques
- Stériliser les instruments suivants en utilisant l'autoclave sec à 125 ° C: Manche de bistouri (# 3) (2), une pince de modèle standard, grande (1), Petit dissecteur ciseaux (angle à l'autre) (1), Micro cuillère (cuillère et plat extrémités de spatule) (1), Micro-spatules (arrondis et arrondis extrémités effilées) (2), pinceau fin (1), polie au feu pipette Pasteur (2), des carrés de gaze, 2 x 2 pouces (5).
- Lorsque stérile, mettre les instruments dans un récipient stérile et de garder couvert jusqu'à utilisation. Immédiatement avant la dissection, immerger les instruments dans une solution d'éthanol à 70%.
- Préparer une plaque de culture à 6 puits avec insert de culture avant de commencer la procédure de dissection par addition de 1 ml de milieu de culture / puits et le stockage de la plaque dans l'incubateur à 35 ° C unee 5% de CO 2.
2. Disposer d'instruments de dissection stérile dans la hotte à flux laminaire
- Vaporiser la hotte à flux laminaire avec 70% d'éthanol et de supprimer des instruments de dissection stérilisés de l'alcool. Laissez les instruments sécher tout en reposant sur une boîte de Pétri stérile pour éviter tout contact entre l'alcool et le tissu du cerveau disséqué.
- Dépôt 5-7 ml de solution de dissection glacée stérilisé dans deux grandes boîtes de Pétri stériles. Un plat se détendre et de nettoyer la tête (sale), l'autre pour le refroidissement et le rinçage du cerveau creusé (propre). Placer un papier filtre stérilisé dans l'un des couvercles plat de Pétri pour disséquer le cerveau.
- Placez un petit papier filtre stérilisé dans une des petites boîtes de Petri couvercle pour disséquer l'hippocampe. Dépôt 3-5 ml de solution de dissection glacée stérilisé dans deux petites boîtes de Pétri stériles. Un plat tiendra l'hippocampe creusé, une tiendra sections lors de la séparation des sections de l'hippocampesous microscope de dissection.
- Préparer le broyeur de tissus en collant un morceau de papier filtre stérilisé à l'étape de coupe et le montage d'une lame de rasoir stérile. Mouiller le papier filtre avec une solution de dissection stérilisés.
- Vaporiser un sac bio propre avec de l'alcool et le placer dans un écoulement laminaire banc propre.
3. hippocampe Dissection
- Vaporisez le raton P7 Sprague Dawley éthanol à 70% à l'extérieur du banc de nettoyage à écoulement laminaire et décapiter rapidement l'animal en utilisant de grands ciseaux chirurgicaux stériles à l'intérieur du banc de flux laminaire. Laissez tomber la tête en solution de dissection glacée dans l'une des boîtes de Pétri.
- Dans la boîte de Pétri, rincer le sang et les transférer à la tête de papier filtre stérilisé, de face ventrale rapidement.
- Utilisation du scalpel, couper le long de la surface dorsale dans le plan sagittal afin d'exposer le crâne sous-jacent. Couper à travers la peau, mais pas l'os sous-jacent, qui est doux et facilement pénétrable chez les rats de tson âge. Mettez de côté ce scalpel «sale» et ne pas utiliser sur les tissus du cerveau.
- Utilisation des petits ciseaux de dissecteur (inclinées à l'autre) et des pinces, couper ouvert le crâne long suture sagittale du crâne au bregma, le point anatomique sur le crâne où la suture coronale est coupée perpendiculairement par la suture sagittale. Utilisez une pince pour tirer volets du crâne et loin de la ligne médiane du crâne.
- Placez le micro cuillère sur la face inférieure du cerveau, en dessous du tronc cérébral, de soulever légèrement le cerveau sur le crâne. Soulevez le cerveau pour exposer les nerfs optiques et bulbe olfactif sur la surface de base de cerveau. Coupez ces structures avec de petits ciseaux à détacher entièrement le cerveau du crâne. Retirer et transférer le cerveau intact à l'autre grand plat de Pétri contenant une solution de dissection glacée.
- Utilisation de la micro cuillère, transférer le cerveau à un petit couvercle boîte de Petri contenant du papier filtre stérile. Avec une pipette Pasteur stérile, rincer le cerveau avec quelques gouttes de DISsecting solution pour maintenir le tissu humide.
- En utilisant une lame de scalpel "propre" couper les deux hémisphères à part. Transférer l'hémisphère arrière gauche à la grande boîte de Pétri avec micro cuillère et placez côté pia de l'hémisphère dans une solution de dissection glacée pour une utilisation ultérieure.
- Voir le visage médiale de l'hémisphère droit et identifier le cul de sac de bord, une bande importante de la matière blanche le long du bord médial de l'hippocampe. L'utilisation d'un scalpel stérile, faire une coupe sagittale à travers le cul de sac, mais attention, car seulement 0,5 cm de la pointe de scalpel seront suffisants pour couper le cul de sac.
- Utilisation de deux micro-spatules, supprimer le premier hippocampe de l'hémisphère droit en plaçant la main-spatule droite sur le tronc cérébral et la levée du cortex sus-jacente avec la spatule gauche. Soulevez doucement le cortex pour révéler le ventricule latéral et face médiale de l'hippocampe. Une ligne courbe blanche, la frange, doit maintenant être visible.
- Aligner la courbure de la spatule avec le curvature du fimbria et appuyez doucement sur la spatule sous la frange. Faites glisser la spatule à gauche et rouler le long de l'axe de rostrale-caudale et puis soulevez spatule direction dorsale pour enlever hippocampe.
- Transférer l'hippocampe à un deuxième petit plat 2 Petri avec une solution de dissection glacée. Répétez la même procédure sur l'hémisphère gauche pour retirer l'hippocampe gauche.
- Utilisation d'un micro-spatule, transférer soigneusement la hippocampes à l'étape de découpage de tissu. Disposer les adjacente et parallèle les uns aux autres et perpendiculaires à l'axe de la lame de hachage. Utilisez un pinceau pour positionner le tissu et ajouter quelques gouttes de la solution de dissection sur le dessus de l'hippocampe.
- Coupez le tissu dans 400 um tranches sans se arrêter pour enlever des tranches individuelles (en général, ils ne adhèrent pas à la lame). Après l'ensemble de l'hippocampe a été coupé, utilisez le pinceau pour transférer doucement les sections à un deuxième petit plat 2 Petri avec une solution de dissection.
- Sous annonceissecting microscope, séparer soigneusement les tranches flottantes utilisant amicro-spatule et le pinceau.
- Retirer la plaque de culture pré-préparés avec insert de culture de l'incubateur et le placer dans une hotte à flux laminaire.
- Avec une pipette Pasteur polie au feu, dessiner 4-5 tranches dans la pipette et de transfert des tranches à la surface apicale de la membrane de l'insert de culture. Ensuite, ajuster le positionnement avec un pinceau et laisser de l'espace entre les sections individuelles et la frontière de l'insert de culture.
- Avec une pipette Pasteur stérile, retirez la solution de dissection excès de surface apicale de la membrane.
REMARQUE: Lors du retrait de solution éviter de tirer des coupes de tissus dans la pipette. Vous pouvez également utiliser une pipette régulière (P200 ou P1000) avec des embouts de pipette stérilisés pour éliminer lentement solution. - Placer la plaque de culture par du milieu de culture contenant du sérum et les tranches d'hippocampe de nouveau dans l'incubateur à 35 ° C et 5% de CO 2.
NOTE: Si les appels d'expérimentationpour générer des cultures à partir de plusieurs animaux, nettoyer soigneusement le banc de nettoyage à écoulement laminaire entre dissections. Instruments revenir à une solution d'alcool et remplacer tous les boîtes de Pétri, des papiers-filtres et des lames de rasoir stérile avant la deuxième dissection.
4. alimentation et en maintenant organotypiques tranches
- cultures d'alimentation dans un banc de nettoyage à écoulement laminaire stérile.
- Effectuer la première alimentation des sections de culture 2 jours post-dissection. Aspirer moyenne ancienne de culture en utilisant stérilisée pipette en verre.
- Utilisation stériles de 5 ml pipette sérologique pour ajouter 1 ml de milieu frais, stérile, contenant du sérum dans les puits.
- Replacez délicatement l'insert de culture et de prendre soin d'enlever les bulles d'air qui se sont formées sous la surface de la membrane.
- Après la première tétée, changement de milieu tous les deux jours.
5. en incubation des tranches de tissu avec de la thymidine analogues à l'étiquette du nouveau-né neurones
- Afin d'étudierla maturation et l'intégration des cellules granulaires du dentate dans l'hippocampe, incuber les tranches organotypiques avec un analogue de la thymidine, comme bromodésoxyuridine (BrdU) ou Chlorodeoxyuridine (CldU). Ici, nous utilisons CldU en raison de sa plus grande solubilité dans une solution saline.
- Après 3DIV, ajouter 1 pl de 10 mg ml solution mère / CldU dans une solution saline à 1 ml de milieu de culture pour une concentration finale de 10 pg / ml. Si BrdU est utilisé, corriger la concentration des différences de poids moléculaire. Ajouter à la moyenne avec CldU puits de culture et incuber le tissu avec un milieu contenant CldU pendant 2 heures à 35 ° C.
- Après 2 heures d'incubation à 35 ° C, éliminer le milieu CldU contenant et le remplacer par un milieu d'alimentation régulière de reprendre horaire d'alimentation normale (décrite ci-dessus).
6. Les tissus Fixation et stockage
- Établir un calendrier pour l'application de traitements et de fixation des échantillons de tissus avant de commencer les expériences de culture (figure 2B). <li> A un post-dissection de jours prédéterminé, à préparer une hotte de laboratoire, ce qui suit: 10 à 50 ml d'un bêcher contenant 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du tampon phosphate salin (PBS); un bécher vide milieu de culture mis au rebut; petite pince; et une pipette de 1 000 ml avec embouts jetables.
- Retirer la plaque (s) de culture provenant de la chambre d'incubation et le transfert d'une hotte de laboratoire. Inclinez les inserts et individuels de la plaque avec une pince. Ensuite, utilisez une pipette pour éliminer le milieu de culture et le transfert dans un bécher d'élimination. Inclinez la plaque de culture à un angle pour aider à assurer que tous les milieu de culture est retiré.
- Terminer la suppression moyenne pour une plaque de culture à la fois. Lorsque moyen a été supprimé, ajouter 1 ml de PFA 4% à chaque puits de culture et de bien sceller la plaque avec du parafilm. Répétez l'opération pour autant de plaques de culture que les plaques nécessaires et de transfert à un réfrigérateur à 4 ° C pendant 24 heures.
- Après 24 heures, préparer le suivant dans une hotte: 10-50 ml bécher contenant 0,1% d'azoture de sodium dans du PBS; un videbécher pour PFA rejetées (suivre les précautions de sécurité lors de l'élimination des substances toxiques); petite pince; et 1000 ml pipette à embouts jetables.
- Suivez la procédure décrite au point 6.4 pour ajouter PFA, mais ajouter 1 ml de PBS avec de l'azoture de sodium à la place. Une fois complètement transféré, les plaques d'étanchéité et pour un usage ultérieur en enveloppant les bords en parafilm et stockage dans un réfrigérateur à 4 ° C.
7. sectionnement tissus pour immunohistochimie
- Effectuer tissus coupe en utilisant un vibratome. La série d'étapes suivante aider à maximiser le rendement des coupes de tissus utilisables à partir de cultures organotypiques.
REMARQUE: Immédiatement après la dissection de l'hippocampe et le placage de tranches, le tissu a une épaisseur d'environ 400 um. Toutefois, après 2 à 3 semaines dans la chambre d'incubation, des tranches de tissu vont commencer à se aplatir, ce qui entraîne une épaisseur de section finale de 150 à 300 um. - Préparez les éléments suivants à la section tissu cultivé: un bistouri n ° 11 blade et à manipuler, une boîte de Pétri en verre contenant PBS glacé, un micro-dissection pince, et une étape de coupe de vibratome propre au tissu monter.
- Utiliser un scalpel pour couper soigneusement le long du périmètre de la membrane de l'insert circulaire de sorte qu'il peut être détaché du boîtier d'insertion en plastique. Laissez suffisamment d'espace entre la tranche de culture et le scalpel.
- Transférer la membrane insert détaché pour une boîte de Pétri contenant du PBS. Après rinçage dans du PBS, utiliser une pince pour transférer la membrane à l'étape de montage de vibratome.
- Ensuite, utilisez le scalpel pour éliminer l'excès de membrane entourant tranches de culture et de réduire les excès de matériau pour créer des bords nets. Cette étape assure que la membrane est plane et peut facilement adhérer à la surface de coupe.
- Placer 1-2 gouttes de colle sur la scène de coupe de vibratome et diffuser, même couche à l'aide d'une aiguille 22 G. Étendre l'adhésif en une forme rectangulaire avec le long bord parallèle à la lame de coupe de la vibratome. Effectuez cette étaperapidement, pour empêcher l'adhésif de sécher.
- Utilisez une pince pour transférer la membrane garni contenant des tranches d'hippocampe à l'étape de coupe et doucement positionner la membrane sur la colle et de se assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air.
- Comme le superglue sèche, transférer la scène vibratome avec la membrane collée revenir à la boîte de Pétri contenant PBS. Préparer la lame de vibratome et contenant un azoture de sodium 48 et de la plaque pour stocker des sections de tissu.
- Utilisez le vibratome pour générer 30 um sections du tissu organotypique de tranche et le transfert à un contenant de l'azoture de sodium 48 de la plaque et pour le stockage et la coloration immunohistochimique suivante.
- Reportez-vous à des protocoles de coloration immunohistochimique 26,29 préexistants.
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Representative Results
Déterminer si les cultures organotypiques seraient appropriés pour la recherche de la neurogenèse adulte nécessaires qu'ils remplissent deux critères principaux: 1) que les tranches conserver des caractéristiques morphologiques caractéristiques de tranches d'hippocampe après 10-21 jours in vitro (DIV), et 2) que DGCS nouveau-nés peuvent être quantifiés en utilisant des techniques immunohistochimiques standard habituellement utilisés dans la recherche de la neurogenèse adulte. En ce qui concerne le premier critère, la figure 1A et 1B mettent en évidence la morphologie hippocampique conservé. Caractéristiques comme le gyrus denté (DG), les régions CA1 et CA3 sont facilement identifiables.
En ce qui concerne le deuxième critère, la figure 1C (panneau supérieur) fournit un échantillon représentatif de DGCS nés co-exprimant le marqueur endogène neuronale, Doublecortin (DCX) en vert et l'analogue de la thymidine exogène, 5-chloro-2'-désoxyuridine (CldU) dans rouge. Ces neurones sont situés dans le sous-granular zone de la DG de l'hippocampe. Afin d'assurer la naissance correcte datant de neurones, nous identifions CldU + noyaux qui co-express DCX. La microscopie confocale est nécessaire à ce stade d'identifier avec succès les neurones doublement marquée parce que les cellules candidats doivent co-exprimer le marqueur d'intérêt tout au long de l'axe Z de la cellule. Données d'échantillons obtenus avec un tel rendement double marquage environ 17% des CldU + cellules qui exprimaient DCX et 35% des CldU + cellules qui exprimaient CaBP à 12 jours après l'application CldU. La valeur DCX est très similaire alors que la valeur CaBP est considérablement inférieur chiffre comparable obtenu in vivo 26. Standard conditions de culture de tissus peuvent être responsables d'un pourcentage relativement faible des cellules CABP +.
Figure 2A présente les étapes de dissection qui procèdent de gauche à droite (1-8): à partir de la décapitation de l'animal (1), la suppression de cerveau (2), le transfert de cerveau à la solution de dissection glacée (3), disséquerion de l'hippocampe de gauche et hémisphères droit (4), le stockage des hippocampes disséqué en solution de dissection glacée (5), le transfert des deux hippocampes à Stoelting hacheur de tissus et de sectionnement à 400 um (6), la séparation des tranches individuelles sous microscope disséquant (7), et placage de tissu sur des inserts de culture cellulaire (8). En procédant de cette manière permet de maintenir un environnement stérile pendant tout le processus de culture.
Enfin, depuis l'époque-cours de développement est une caractéristique importante de la neurogenèse hippocampique, nous avons choisi d'incuber les tranches de culture avec CldU pour exactement deux heures après 3 DIV à l'étiquette la division des cellules souches neurales. La fenêtre de temps étroite pour administration CldU a été choisie pour améliorer la probabilité que les neurones marqués constituent une population homogène de cellules à peu près au même stade de maturation (figure 2). En ce qui concerne l'étiquetage CldU, une caractéristique essentielle de la neurogenèse hippocampique pour la fonction, ce est que à un given temps il ya une population hétérogène de cellules granulaires dentés à différents stades de maturation 27,28.
Figure 1. Exemples de microscope à fluorescence photographies qui mettent en évidence conservés morphologie hippocampique. (A) organotypique à partir de 12 jours après la dissection immuno-pour CldU (vert) et CaBP (rouge), 20x image composite de l'air (barre d'échelle = 500 um). (B) micrographie de l'échantillon de la tranche de 21 jours après la dissection immuno-pour CldU ( rouge) et DCX (vert) (en face de couleur système de la figure 1A), 20x air (barre d'échelle = 100 um). (C) du panneau supérieur. Représentant microscope confocal photographie de cellules co-exprimant ClXdU et marqueur neuronal immature endogène, DCX. DGCS co-exprimant DCX (vert) et CldU (rouge) sont comptées comme nouveaux neurones. La flèche indique une double-Labecellulaire conduit à un stade précoce du développement, 40X à immersion (barre d'échelle = 10 um). Cellules comparables ont été observés 10 jours post-marquage in vivo 26. Panneau inférieur. Images fluorescentes représentatifs de cellules co-exprimant CldU (vert) et CaBP (rouge). La flèche indique une cellule doublement marquée, 40X micrographie fluorescent (barre d'échelle = 10 um). Gyrus denté. DG- GCL-granules de la couche cellulaire. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. (A) Illustration des étapes séquentielles pour la dissection de l'hippocampe en écoulement laminaire banc propre. Ligne pointillée indique (à droite) zones "non stériles" (à gauche) et «stérile» de la zone de dissection. (B) Échéancier de organocultures tranche Typic préparés à partir de chiots P7 de rat (START). Notations indiquent application des analogues de la thymidine, CldU *, et «traitement» qui peuvent inclure divers agents pharmacologiques adaptées à la question expérimentale. Cultures sont fixées avec du paraformaldéhyde au temps de séjour souhaitées à l'application CldU (Fix Cultures). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Nom de réactif / Equipement | Société | Numéro de catalogue | Commentaires / Description |
| 5-chloro-2'-désoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Dangereux, cancérogènes |
| La culture cellulaire insère, 30 mm de diamètre, 0,4 um ptaille du minerai | Thermo Scientific | 140660 | Nuclon delta revêtement sur ces inserts assure une meilleure adhérence des tissus et améliore la qualité de la tranche. |
| Conique Centrifugeuse tubes (stérile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Ciseaux de dissection (angle à l'autre) | Beaux Science Tools | 14082-09 | |
| Milieu essentiel minimum (MEM) | Gibco | 11095; liquide | Conserver à 4 ° C |
| Eclipse Ni-U microscope fluorescent | Nikon | ||
| Colle pour tissu | Krazy Glue | KG585 | Utilisez la quantité minimale de colle pour obtenir une adhérence que ne importe quel tissu exposé à de la colle sera inutilisable pour IHC. |
| Solution saline équilibrée de Hank (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Conserver à 4 ° C |
| De sérum de cheval inactivé à la chaleur (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Faire 50 ml aliquotes et conserver à -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Pipettes de verre modifiées (de fond de pipette Pasteur retiré et le bord lissé avec Bunsen flamme) | |||
| Boîte de Pétri (100 mm x 15 mm) et (60 mm x 15 mm) | Fisher Marque | FB0875712 et FB0875713A | |
| lames de bistouri n ° 11 | Beaux Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel poignée # 3 | Beaux Science Tools | 10003-12 | |
| Pipettes sérologiques | Sorfa médicale Plastic Co. | P8050 | |
| Forceps modèle standard | Beaux Science Tools | 11000-12 | |
| Filtre à vide stérile | Thermo-scientifique | 565-0020 | |
| Ciseaux chirurgicaux | Beaux Science Tools | 14054-13 | |
| Seringue entraîné unité de filtre | Millipore Millex- | SLGP033RS | |
| hacheur de tissus avec une scène mobile | Stoelting | 51425 | |
| Pointe fine pinceau |
Tableau 1. Fournitures et réactifs
| Solution | Ingrédients et Instructions |
| solution de Dissection | a) 500 ml de Hank &# 39; de solution saline équilibrée (HBSS) (Gibco-14025-092). |
| b) Ajouter 2,2 g de D-glucose. | |
| c) Ajouter 0,5 g de saccharose. | |
| d) Ajouter 1,787 g HEPES. | |
| e) Mélanger pendant 30 min avec plaque d'agitation magnétique. | |
| f) Utilisation pH-mètre pour assurer solution a un pH final = 7,4. | |
| g) Utilisez osmomètre pour assurer osmolalité final = 320-330 mOsm. | |
| h) Stériliser la solution dans une hotte à flux laminaire stérile en utilisant une filtration sous vide à travers le filtre de 0,2 um. | |
| Contenant du sérum de milieu de culture: 100 ml du milieu essentiel minimum (MEM) (Gibco 11095), 50 ml de sérum de cheval (Gibco 16050-122), 50 ml de HBSS. | a) Ajoutez les lignes suivantes à 50 ml de HBSS dans le bécher et dissoudre dans 37 ° C bain d'eau. Mélanger avec un agitateur magnétique. |
| b) 1,3 g de D-glucose. | |
| c) 36 mg MgSO 4. | |
| ré) 17,6 mg d'acide ascorbique. | |
| e) 5 pi de CaCl2 2M solution stock. | |
| f) Ajouter 50 ul antibiotiques antimycotiques (100x actions, stérile; Gibco 15140-062). | |
| g) 1 ug / ml d'insuline. | |
| h) ci-dessus Stériliser la solution par filtration à travers un filtre de 0,2 um. | |
| i) Mélanger la solution filtrée avec 100 ml de MEM et 50 ml de sérum de cheval dans une hotte à flux laminaire. | |
| j) Faire portions de 50 ml dans des tubes à centrifuger coniques stériles (Fisher Scientific-14-432-22) et conserver à 4 ° C. | |
| Solution à 4% Paraformaldéhyde de fixateur. | a) Préparer tampon phosphate salin (PBS) par adjonction, à 300 ml de H 2 O distillée et le mélange sur la plaque d'agitation magnétique. |
| b) Ajouter 2,7 g de phosphate de sodium monobasique (NaH 2 PO 4). | |
| c) Ajouter 11,5 g de sodium phosphate dibasique (NaHPO 4). | |
| d) Ajouter du chlorure de sodium 9,0 g (NaCl). | |
| e) Chauffer environ. 700 ml de H 2 O distillée à 55 ° C et éteindre le feu. | |
| f) Ajouter 40 g de paraformaldéhyde (PFA) et agiter dans 700 ml d'eau en utilisant la plaque d'agitation magnétique. | |
| g) Combinez le PBS (a, b, c, d) et des solutions PFA (e, f), ajuster le pH à 7,4 et le haut jusqu'à volume final de 1000 ml. | |
| 0,1% d'azoture de sodium Solution | a) Ajouter 1 g d'azoture de sodium en poudre (NaN 3) à une solution de L de PBS. |
| b) Mélanger à l'aide plaque d'agitation magnétique et conserver à 4 ° C. |
Tableau 2. Solutions et Recettes
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Discussion
Après CldU (ou BrdU) l'administration, le calendrier d'application des agents pharmacologiques peut être choisi de cibler DGCS nouveau-né pendant particuliers fenêtres développement. Par exemple, un agent hypothétique peut être appliquée pendant la seconde injection semaines post-CldU, qui est proposé pour coïncider avec l'âge de neurones immatures qui sont à un stade de développement où GABA est dépolarisants. Les études futures utilisant ce protocole pourraient adapter l'agent pharmacologique et la fenêtre d'exposition à "sur mesure" l'approche de la question expérimentale spécifique d'intérêt.
Un critère important pour déterminer que les cultures tranche sont un modèle valable pour la recherche de la neurogenèse postnatale est la capacité de colorer et de quantifier les nouveaux neurones dans l'hippocampe. Les deux principales conclusions à l'appui de cette hypothèse sont que l'analyse microscopique a révélé la réactivité immunohistochimique pour CldU et des marqueurs de protéines endogènes dans les mêmes neurones.Lorsqu'il est utilisé en combinaison avec des marqueurs neuronaux endogènes, analogues de la thymidine, tels que BrdU et CldU sont de puissants outils pour la recherche de la neurogenèse.
L'application des analogues de la thymidine, comme BrdU, via des injections intraperitoneales est couramment utilisé dans la recherche sur les neurones de la neurogenèse de l'étiquette en cours de la phase S de 29 la mitose. Des approches similaires peuvent être utilisés dans les cultures organotypiques avec certaines modifications. Par exemple, des études antérieures administrés BrdU (0,5 uM pour 3 jours) de trancher cultures après ~ 14 DIV 18. En examinant les données présentées dans ce document révèle que certains des paramètres utilisés pour quantifier la neurogenèse ne emploie pas les techniques classiques utilisées dans le domaine de la neurogenèse, ce est à dire, la quantification stéréologique 30. Par exemple, lors de la déclaration de la co-expression de BrdU et neuronaux-noyaux (NeuN) cellules positives, ils indiquent un nombre total de cellules "par la culture" au lieu de fournir informeration concernant la surface ou le volume des tissus.
Des études ultérieures ont amélioré cette méthode en sectionnant les tranches individuelles en culture à 10 um sections, ce qui a amélioré les protocoles de visualisation et d'immunohistochimie d'anticorps en permettant d'imprégner plus facilement les 31 échantillons de tissus. Bunk et al. 28 ont signalé un double marquage avec BrdU (10 uM pour 3 jours) que le nombre de cellules co-marqué par 10 um article, mais n'a pas fourni d'informations sur la région comparative ou de la région hippocampique spécifique étudié à-dire, CA1, CA3 ou DG. En outre, l'analyse de fluorescence confocale et les images de microscopie ne montre pas de manière convaincante que la morphologie de l'hippocampe a été maintenue avec succès.
Fait important, les deux études ont utilisé une période d'exposition de trois jours de BrdU, qui est associé inconvénients. marquage BrdU a grandement aidé études de neurogenèse en permettant aux enquêteurs de suivre les cellules nouvellement divisé en varégions du cerveau Rious. Cependant, la toxicité BrdU a également été bien caractérisé. Il a été démontré Son utilisation pour provoquer des anomalies morphologiques et comportementaux 32,33 et les effets négatifs sur le cycle cellulaire, la différenciation, la migration et la survie des cellules souches neurales 34-36. L'administration prolongée de BrdU dans les études mentionnées précédemment peut avoir introduit des variables confondantes qui ont modifié la physiologie de l'hippocampe et alors que certains effets secondaires de l'administration de BrdU peuvent être inévitables, notre protocole expérimental a été conçu pour limiter certaines de ces complications en incubant le tissu avec des analogues de la thymidine pour 2 h. En outre, nous avons choisi d'utiliser CldU lieu de BrdU, car il a montré une meilleure solubilité que BrdU lors de la préparation de la solution d'incubation. Bien que le protocole de trois jours peut être utile pour certains modèles expérimentaux par exemple, en maximisant l'étiquetage des cellules proliférantes, ce protocole 2 h a un avantage de l'impulsion-étiquetage d'un relativement petit population de cellules qui peuvent être étudiés au temps de survie souhaités (voir la figure 2B).
En comparant le niveau de production neuronale suivant deux méthodes différentes d'application de BrdU, Namba et al. Apporté une contribution importante aux techniques d'étiquetage dans les cultures de tranches organotypiques 37. Les auteurs ont comparé intraperitoneale (IP) injection de BrdU (50 mg / kg) dans 5 jours (P5) des rats post-nataux avec des cultures in vitro qui ont reçu le milieu de culture contenant 1 uM de BrdU pendant 30 minutes immédiatement après l'explantation de tissu. Ils signalent aucune différence statistiquement significative entre in vivo et in vitro au début de l'injection de BrdU dans le tissu cultivé. Les auteurs ne ont pas présenté des images claires décrivant la structure de l'hippocampe mais ils signalent immunoréactivité BrdU en pourcentage du nombre total de cellules dans la couche de cellules granulaires. Alors qu'ils emploient comptage stéréologique, fournissant une mesure par zone ou le volume serait utile. En général, Les études citées présents cultures organotypiques comme détaillant un approfondie des cultures tranche de l'hippocampe postnatales, avec des applications pour l'étude de la neurogenèse et les perturbations pharmacologiques. En utilisant cette technique, des coupes d'hippocampe peuvent être maintenus pendant jusqu'à 21 jours in vitro (DIV) et les médicaments peuvent être ajoutés au milieu en un point quelconque pendant la période de culture pour étudier l'effet sur la neurogenèse.
Notre objectif était de marquer une population discrète, relativement homogène de DGCS en fournissant une brève 'impulsion' application de CldU pendant 2 heures. Une stratégie couramment employée pour étudier la neurogenèse implique l'identification de l'étape de maturation d'un neurone par coloration immunohistochimique pour différents marqueurs endogènes avec un analogue de la thymidine. Et microscopie par fluorescence confocale a confirmé la présence de noyaux qui incorporaient les CldU analogues de la thymidine et ont été par conséquent subissent une mitose active pendant la période de culture. Figure 2 in vivo des tissus peuvent être adaptés pour les cultures tranche.
Plus précisément, une méthode couramment utilisée dans la recherche de la neurogenèse est d'effectuer la coloration immunohistochimique pour la protéine associée aux microtubules, DCX, qui est principalement exprimé dans les neurones immatures de jours 3-21 et le marqueur de neurones matures, Calbindin (CaBP), qui se exprime pleinement suivante 28 jours après la mitose. Le phénotype des cellules CldU + a été déterminée en utilisant ces marqueurs 26 endogène.
Amélioration des méthodes pour maintenir les cultures tranche pour des périodes plus longues peuvent avoir l'avantage supplémentaire de permettre plus CldU + neurones pour atteindre la maturité, CaBP + scène. À l'heure actuelle, une limitation de la méthode de culture organotypique est que le tissu est en constante évolution pendant la période de culture. Par exemple, immédiatement après la dissection de l'hippocampe et le placage de tranches, le tiquest a une largeur d'environ 400 pm. Toutefois, après 2 à 3 semaines dans la chambre d'incubation, des tranches de tissu vont commencer à mince, ce qui conduit à une largeur finale entre 250 à 350 um. Cela limite la quantité de tissu qui peut être utilisé pour l'immunohistochimie et devrait être considéré lors de la planification du nombre d'animaux à utiliser pour un projet. Des expériences supplémentaires seront aider à caractériser les changements fonctionnels dans la physiologie de l'hippocampe qui se produisent in vitro.
Le protocole pour la coupe et la coloration des coupes d'hippocampe a été développé pour analyser les changements cellulaires et morphologiques qui ont lieu au cours de la période de culture. Trancher les cultures fournissent l'occasion de tester l'effet de divers agents pharmacologiques comme DGCS hippocampe passent par des stades de développement distincts pendant la maturation et représentent un outil précieux pour les futures études de la neurogenèse adulte.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
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