Summary
Här beskriver vi en teknik för att studera hippocampus postnatal neurogenes använder organotypisk bit kultur teknik. Denna metod gör det möjligt för in vitro-manipulering av vuxna neurogenes och möjliggör en direkt tillämpning av farmakologiska medel till den odlade hippocampus.
Abstract
Här beskriver vi en teknik för att studera hippocampus postnatal neurogenes i gnagare hjärnan med hjälp av organotypisk bit kultur teknik. Denna metod bibehåller den karakteristiska topografiska morfologin av hippocampus samtidigt direkt tillämpning av farmakologiska medel till utvecklings hippocampus dentate gyrus. Dessutom kan slice kulturer hållas i upp till fyra veckor och därmed tillåter en att studera mognadsprocessen av nyfödda granulat nervceller. Slice kulturer möjliggör effektiv farmakologisk manipulation av hippocampus skivor samtidigt exklusive komplexa variabler såsom osäkerheter relaterade till djupa anatomiska placeringen av hippocampus samt blodhjärnbarriären. Av dessa skäl, försökte vi optimera organotypiska slice kulturer speciellt för postnatal neurogenes forskning.
Protocol
OBS: Alla djurförsök överensstämde med riktlinjerna djurens hälsa och välbefinnande i Institutionen för medicin vid universitetet i Toronto.
1. Beredning av hippocampus skivor
- Sterilisera följande instrument som använder den torra autoklav vid 125 ° C: Skalpell handtag (# 3) (2), standardmönster pincett, stor (1), Small dissektorn sax (vinklad till sida) (1), Micro sked (sked och platt spatel ändar) (1), Mikro spatlar (rundade och rundade avsmalnande ändar) (2), Fin pensel (1), polerad Fire pasteurpipett (2), Gauze torg, 2 x 2 inches (5).
- När steril, sätta instrumenten i en steril behållare och hålla täckt fram till användning. Omedelbart före dissekering, sänk instrument i en 70% etanollösning.
- Förbered en 6-brunnars odlingsplatta med odlingsbladet innan dissekering förfarandet genom att tillsätta 1 ml odlingsmedium / brunn och lagra plattan i inkubatorn vid 35 ° C av ennd 5% CO2.
2. Ordna Dissektionsverktyg i Steril laminärflödeshuv
- Spraya laminärt flöde huva med 70% etanol och ta steriliserade dissektion instrument från alkohol. Låt instrumenten torka medan de vilar på en steril petriskål för att undvika kontakt mellan alkoholen och den dissekerade hjärnvävnad.
- Deposition 5-7 ml steriliserad iskall dissekera lösning i 2 stora sterila petriskålar. En maträtt kommer kyla och rengör huvudet (smutsigt), den andra för kylning och sköljning av öste ut hjärnan (ren). Placera en steriliserad filterpapper i en petriskålens lock för dissekera ut hjärnan.
- Placera en liten, steriliserad filterpapper i en av de små petriskål lock för dissekera ut hippocampus. Deposition 3-5 ml steriliserad iskall dissekera lösning i 2 små, sterila petriskålar. En maträtt kommer att hålla öste ut hippocampus, en kommer att hålla sektionerna under separation av hippocampus sektionerenligt dissektion mikroskop.
- Förbered vävnadskvarn genom att tejpa en bit steriliserat filterpapper för att skärsteget och monterings ett sterilt rakblad. Blöt filterpapper med steriliserat dissekera lösning.
- Spraya en ren bio-väska med alkohol och placera den i laminärt flöde ren bänk.
3. hippocampus Dissection
- Spraya P7 Sprague Dawley råttungar med 70% etanol utanför det laminära flödet ren bänk och snabbt decapitate djuret med användning av stora sterila kirurgiska saxar inuti laminärflödesbänk. Låt huvudet sjunka i iskallt dissekera lösning i ett av de petriskålar.
- I petriskål, skölj av blodet och snabbt överföra huvudet till steriliserade filterpapper, ventrala sidan nedåt.
- Med användning av skalpell, skär längs den dorsala ytan i sagittalplanet för att exponera den underliggande skallen. Skär genom huden, men inte det underliggande benet, som är mjukt och lättgenomträng i råttor av thans ålder. Avsätt detta "smutsiga" skalpell och använd inte på hjärnvävnad.
- Använda de små dissektorn sax (vinklade till sida) och pincett, skära öppna skallen längs sagittal sutur av skallen till bregma, den anatomiska punkt på skallen där kronsömmen korsas vinkelrätt av sagittal sutur. Använd pincett för att dra skallen klaffar upp och bort från mittlinjen av skallen.
- Placera mikro sked på undersidan av hjärnan, under hjärnstammen, för att försiktigt lyfta hjärnan ur skallen. Lyft hjärnan att exponera synnerverna och luktloben på basala yta hjärnan. Skär dessa strukturer med en liten sax för att helt ta bort hjärnan från skallen. Ta ut och överföra den intakta hjärnan till den andra stora petriskål med iskall dissekera lösning.
- Med hjälp av mikro sked, överföra hjärnan till en liten petriskål lock innehåller sterilt filterpapper. Med en steril pasteurpipett, skölj hjärnan med några droppar dissecting lösning för att hålla vävnaden fuktig.
- Med hjälp av en "ren" skalpell blad skär de två hjärnhalvorna isär. Överför den vänstra hjärnhalvan tillbaka till stora petriskål med mikro sked och placera halvklotet pia sidan nedåt i iskall dissekera lösning för senare användning.
- Visa den mediala ytan av den högra hjärnhalvan och identifiera kanten fornix, en framstående band av vit substans längs mediala kanten av hippocampus. Med en steril skalpell görs en sagittal snitt genom fornix, men ta hand eftersom endast 0,5 cm av skalpell spetsen kommer att vara tillräckligt för att skära fornix.
- Använda 2 mikro spatlar, ta bort den första hippocampus från höger hjärnhalva genom att placera den högra-spatel på hjärnstammen och lyfta den överliggande cortex med vänster spatel. Lyft försiktigt cortex för att avslöja den laterala ventrikeln och mediala ytan av hippocampus. En vit böjd linje, fimbria, nu ska synas.
- Rikta krökning spateln med curvaning av fimbria och tryck försiktigt spateln under fimbria. Skjut spateln vänster och cykla längs rostralt-caudal axeln och lyft sedan spatel i rygg riktning för att ta bort hippocampus.
- Överför hippocampus till en 2: a liten petriskål med iskall dissekera lösning. Upprepa samma procedur på den vänstra hjärnhalvan för att ta bort den vänstra hippocampus.
- Med hjälp av en mikro spatel, försiktigt överföra hippocampi till vävnaden chopper stadiet. Ordna dem intill och parallellt med varandra och vinkelräta mot axeln för falsbladet. Använd en pensel för att placera vävnaden och tillsätt några droppar av dissekera lösningen ovanpå hippocampi.
- Skär vävnaden i 400 nm skivor utan att pausa för att ta bort enskilda skivor (oftast de inte kommer att följa bladet). Efter hela hippocampus har skurits, använd pensel för att försiktigt föra sektionerna till en 2: a liten petriskål med dissektion lösning.
- Enligt annonsenissecting mikroskop, försiktigt separera de flytande skivor med hjälp amicro-spatel och pensel.
- Avlägsna förberedda odlingsplatta med kultur insats från inkubatorn och placera i ett laminärt flöde huva.
- Med hjälp av en brand-polerat pasteurpipett, rita 4-5 skivor i pipetten och överföra skivor till den apikala ytan kulturinsats membran. Därefter justerar positionering med en pensel och lämna plats mellan enskilda avsnitt och gränsen till kulturinsats.
- Med hjälp av en steril pasteurpipett, ta bort överskottet dissekera lösning från apikala yta membran.
OBS: när du tar bort lösning undvika att dra vävnadssnitt i pipetten. Alternativt kan du använda en vanlig pipett (P200 eller P1000) med steriliserade pipettspetsar att sakta ut lösningen. - Placera odlingsplatta med seruminnehållande odlingsmedium och de hippocampusskivor tillbaka i inkubatorn vid 35 ° C och 5% CO2.
OBS: Om experimentsamtalför att generera kulturer från flera djur, rengör laminärt flöde ren bänk mellan dissektioner. Återgå instrument alkohollösning och ersätta alla Petri-rätter, filterpapper och steril rakblad före andra dissektion.
4. Utfodring och upprätthålla Organotypiska Skivor
- Foder kulturer i ett sterilt laminärt flöde ren bänk.
- Utför den första matningen av de odlade sektionerna 2 dagar efter dissekering. Sug gamla odlingsmedium med hjälp steriliserad glaspipett.
- Använd sterila 5 ml serologisk pipett för att lägga en ml färskt, sterilt, seruminnehållande medium till brunnarna.
- Försiktigt ersätta kulturinsats och vara noga med att ta bort eventuella luftbubblor som kan ha bildats under membranytan.
- Efter den första matnings, ändra mediet varannan dag.
5. inkubation Vävnads Skivor med tymidinanaloger till Label nyfödda nervceller
- För att studeramognaden och integration av dentate granulat celler i hippocampus, inkubera organotypiska skivor med en tymidinanalog, såsom Bromodeoxyuridine (BrdU) eller Chlorodeoxyuridine (CldU). Här använder vi CldU på grund av sin högre löslighet i saltlösning.
- Efter 3DIV, tillsätt 1 pl av 10 mg / ml CldU stamlösning i saltlösning till 1 ml odlingsmedium för en slutlig koncentration av 10 pg / ml. Om BrdU används, korrigera koncentrationerna för skillnader i molekylvikt. Lägg medium med CldU till odlingsbrunnar och inkubera vävnad med CldU-innehållande medium under två timmar vid 35 ° C.
- Efter 2 h inkubation vid 35 ° C, avlägsna CldU innehållande medium och ersätta med regelbunden utfodring medium för att återgå till normal utfodring schema (som beskrivs ovan).
6. Tissue Fixering och förvaring
- Upprätta en tidsplan för att tillämpa behandlingar och fastställande vävnadsprover innan odlingsexperiment (Figur 2B). <li> Vid en förutbestämd dag efter dissektion, förbereda följande i en laboratorie dragskåp: en 10-50 ml bägare innehållande 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS); en tom bägare för kasseodlingsmedium; små pincett; och en 1000 ml pipett med engångsspetsar.
- Avlägsna odlingsplattan (er) från inkubationskammaren och överföring till ett dragskåp. Fäll de individuella Well Plate skär med pincett. Nästa, använd en pipett för att ta bort odlingsmedium och överför till en avyttring bägare. Vippa odlingsplattan i en vinkel för att hjälpa till att säkerställa att allt odlingsmedium avlägsnas.
- Avsluta borttagning medium för en odlingsplatta i taget. När mediet har tagits bort, tillsätt 1 ml 4% PFA till varje kultur väl och täta brunnar med parafilm. Upprepa för så många odlingsplattor som nödvändiga och överföra plattor till kylskåp vid 4 ° C under 24 timmar.
- Efter 24 timmar, förbereda följande i ett dragskåp: 10-50 ml bägare innehållande 0,1% natriumazid i PBS; en tombägare för kasse PFA (följ säkerhetsföreskrifter vid kasse giftiga ämnen); små pincett; och 1000 ml pipett med engångsspetsar.
- Följ proceduren som beskrivs i 6,4 för adde PFA, men tillsätt 1 ml PBS med natriumazid istället. När helt överföras, tätning hålsplattor för framtida bruk genom att linda kanter i parafilm och lagring i kylskåp vid 4 ° C.
7. Sektione Mjukpapper för Immunohistokemi
- Utför vävnad sektione hjälp av en vibratome. Följande serie steg att maximera avkastningen av användbara sektioner vävnads från organotypiska kulturer.
OBSERVERA: Omedelbart efter hippocampus dissektion och plätering av skivor, har vävnaden en tjocklek av ungefär 400 um. Men efter 2-3 veckor i inkubationskammaren kommer vävnadsskivor börjar att platta, vilket resulterar i en slutlig snittjocklek av 150-300 um. - Förbered följande avsnitt odlad vävnad: a # 11 skalpell blade och handtag, ett glas petriskål med iskall PBS, en mikro-dissektion pincett, och en ren vibratome skär skede att montera vävnad.
- Använd en skalpell för att noggrant skära längs omkretsen av den cirkulära insatsen membranet, så att den kan lösgöras från plastinsatshuset. Lämna gott om utrymme mellan den odlade skiva och skalpellen.
- Överför fristående insatsen membranet till en petriskål med PBS. Efter sköljning i PBS, använd pincett för att överföra membranet till vibratome monteringsstadiet.
- Nästa, använd skalpell för att eliminera överskott membran som omger odlade skivor och skär bort överflödigt material för att skapa rena kanter. Detta steg kommer att säkerställa membranet är platt och kan lätt fastna på skärytan.
- Placera 1-2 droppar lim på vibratome skärstadiet och spridas i jämnt lager med hjälp av en 22 G nål. Sprid lim till en rektangulär form med långsidan parallell med skärblad i vibratome. Utför detta stegsnabbt, för att förhindra att limmet torkar.
- Använd pincett för att överföra den trimmade membranet innehåller hippocampus skivor till skärstadiet och försiktigt placera membranet på lim och se till att det inte finns några luftbubblor.
- Som superlim torkar, överföra vibratome scenen med den limmade membranet tillbaka till PBS innehållande petriskål. Förbered vibratome blad och en 48 brunnar innehåller natriumazid att lagra vävnadssnitt.
- Använd vibratome att generera 30 um sektioner av organotypisk slice vävnad och överföring till en 48 brunnar innehåller natriumazid för lagring och efterföljande immunhistokemisk färgning.
- Se tidigare existerande protokoll för immunhistokemisk färgning 26,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avgöra om organotypiska kulturer skulle vara lämplig för vuxna neurogenes forskning krävs att de uppfyller två huvudkriterier: 1) att skivor bibehålla karakteristiska morfologiska funktioner i hippocampus skivor efter 10-21 dagar in vitro (DIV), och 2) att nyfödda DGCs kan kvantifieras användning av standard immunhistokemiska tekniker som vanligen används i vuxenneurogenes forskning. När det gäller det första kriteriet, figur 1A och 1B markera bevarade hippocampus morfologi. Karakteristiska funktioner som gyrus dentatus (GD), CA1 och CA3 regioner är lätta att identifiera.
När det gäller det andra kriteriet, Figur 1C (övre panelen) ger ett representativt urval av nyfödda DGCs samuttrycka den endogena neuronal markör, Doublecortin (DCX) i grönt och den exogena tymidinanalog, 5-klor-2'-deoxiuridin (CldU) i rött. Dessa neuroner är belägna i den sub-grringformig zon av hippocampus GD. För att säkerställa korrekt födelse datering av nervceller, identifierar vi CldU + kärnor som samar express DCX. Konfokalmikroskopi behövs i detta skede att framgångsrikt identifiera dubbelmärkta nervceller eftersom kandidatceller måste samarbeta uttrycka markör för intresset i hela Z-axeln av cellen. Exempeldata som erhållits med en sådan avkastning dubbelmärkning ca 17% av CldU + celler som uttryckte DCX och 35% av CldU + celler som uttryckte CABP på 12 dagar efter CldU ansökan. Det DCX värdet är mycket lik medan CABP värdet är betydligt lägre än jämförbara siffran erhållits in vivo 26. Standardvävnadsodlingsbetingelser kan vara ansvarig för en relativt låg procentandel av CABP + celler.
Figur 2A presenterar de dissektion steg som går vidare från vänster till höger (1-8): börjar med halshuggning av djur (1), avlägsnande av hjärnan (2), överföring av hjärnan till iskall dissektion lösning (3), dissekeraion av hippocampus från vänster och höger halvklot (4), förvaring av dissekeras hippocampi i iskallt dissektion lösning (5), överföring av både hippocampi till Stoelting vävnads chopper och snitt vid 400 nm (6), separation av enskilda skivor i dissekera mikroskop (7), och plätering vävnad på cellodlingsinlägg (8). Genom att förfara på detta sätt bidrar till att upprätthålla en steril miljö under hela odlingsprocessen.
Slutligen, eftersom tidsförloppet för utveckling är ett viktigt inslag i hippocampus neurogenes, valde vi att inkubera de odlade skivor med CldU för exakt 2 h efter 3 DIV till etikett dividera neurala stamceller. Den smala tidsfönster för CldU administrering valdes för att öka sannolikheten att märkta neuroner utgjorde en homogen population av celler vid ungefär samma mognads- steg (fig 2). När det gäller CldU märkning, är ett kritiskt inslag i nybildning av nervceller för hippocampus funktion som på ett given tid finns det en heterogen population av dentate granulceller vid olika mognadsstadier 27,28.
Figur 1. Exempel på fluorescensmikroskop bilder med höjdpunkter bevaras hippocampus morfologi. (A) Organotypiska skiva från 12 dagar efter dissektion immunolabeled för CldU (grön) och CABP (röd), 20x luft sammansatt bild (Skalstreck = 500 | im). (B) Prov mikrograf av skiva från 21 dagar efter dissektion immunolabeled för CldU ( rött) och DCX (grön) (motsatt färg-systemet i Figur 1A), 20x luft (Skala bar = 100 nm). (C) Övre panelen. Representant konfokalmikroskop fotografi av celler samuttrycker ClXdU och endogena omogna neuronala markör, DCX. DGCs samuttrycker DCX (grön) och CldU (röd) räknas som nyfödda nervceller. Pilen anger en dubbel labeledde cell vid tidigt skede av utvecklingen, 40X oljeimmersions (Skala bar = 10 nm). Jämförbara celler har observerats 10 dagar efter märkning in vivo 26. Nedre panelen. Representativa fluorescerande bilder av celler som samuttrycker CldU (grön) och CABP (röd). Arrow indikerar en dubbelmärkt cell, 40X fluorescerande mikrograf (Skala bar = 10 nm). GD-dentate gyrus. GCL-granulat cellager. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. (A) Illustration av de sekventiella steg för hippocampus dissektion i laminärt flöde ren bänk. Streckade linjen visar "osterila" (vänster) och "sterila" (höger) zoner av dissektion området. (B) Tidslinje för organotypic slice kulturer framställda från P7 råttungar (start). Beteckningar indikerar applicering av tymidinanalog, CldU *, och "behandling", som kan inkludera olika farmakologiska medel som är anpassade till den experimentella fråga. Kulturer är fasta med paraformaldehyd vid önskade uppehållstider från CldU ansökan (Fix kulturer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn på reagens / utrustning | Företag | Katalognummer | Kommentarer / Beskrivning |
| 5-klor-2'-deoxiuridin (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Farligt, Cancerframkallande |
| Cellodling infogar, 30 mm i diameter, 0,4 um pmalm storlek | Thermo Scientific | 140660 | Nuclon delta beläggning på dessa skär ger bättre vidhäftning vävnad och förbättrar skiva kvalitet. |
| Koniska centrifugrör (steril) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissektorn sax (vinklad till sida) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095; vätska | Förvaras vid 4 ° C |
| Eclipse Ni-U fluorescerande mikroskop | Nikon | ||
| Lim för mjukpapper | Krazy Lim | KG585 | Använd minsta mängd lim för att uppnå vidhäftning som någon vävnad utsätts för lim blir oanvändbar för IHC. |
| Hanks balanserade saltlösning (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Förvaras vid 4 ° C |
| Hästserum värmeinaktiverad (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Gör 50 ml portioner och förvara vid -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modifierade glaspipetter (botten av pasteurpipett bort och kanten jämnas med Bunsen låga) | |||
| Petriskål (100 mm x 15 mm) och (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 och FB0875713A | |
| Skalpellblad # 11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Skalpell handtag # 3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serologiska pipetter | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standardmönster pincett | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterilvakuumfilter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Kirurgisk sax | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Spruta driven filterenhet | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper med flyttbara steget | Stoelting | 51425 | |
| Fin spets pensel |
Tabell 1. Förbrukningsmaterial och reagenser
| Lösning | Ingredienser och Instruktioner |
| Dissektion lösning | a) 500 ml Hank &# 39; s Balanced Salt Solution (HBSS) (Gibco-14025-092). |
| b) Tillsätt 2,2 g D-glukos. | |
| c) Tillsätt 0,5 g sackaros. | |
| d) Lägg 1,787 g HEPES. | |
| e) Blanda under 30 min med magnetisk omrörningsplatta. | |
| f) Använd pH-mätare för att garantera lösning har ett slutligt pH = 7,4. | |
| g) Använd osmometer att säkerställa slut osmolalitet = 320-330 mOsm. | |
| h) Sterilisera lösning i sterilt laminärt flöde huva med hjälp vakuumfiltrering genom 0,2 ìm filter. | |
| Seruminnehållande odlingsmedium: 100 ml minimalt essentiellt medium (MEM) (Gibco 11095), 50 ml hästserum (Gibco 16050-122), 50 ml HBSS. | a) Lägg till följande i 50 ml HBSS i bägare och lös i 37 ° C vattenbad. Blanda med magnetomrörare. |
| b) 1,3 g D-glukos. | |
| c) 36 mg MgSO 4. | |
| d) 17,6 mg askorbinsyra. | |
| e) 5 | il 2M CaCl2 förrådslösning. | |
| f) Tillsätt 50 pl Antibiotika antimykotikum (100x lager, steril, Gibco 15.140-062). | |
| g) 1 ^ g / ml insulin. | |
| h) Sterilisera lösningen ovan genom filtrering genom ett 0,2 pm filter. | |
| i) Blanda filtrerad lösning med 100 ml MEM och 50 ml Häst serum i laminärt flöde huva. | |
| j) Gör 50 ml alikvoter i sterila koniska centrifugrör (Fisher Scientific-14-432-22) och förvara vid 4 ° C. | |
| 4% paraformaldehyd fixeringslösning. | a) Preparera fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att lägga till följande till 300 ml destillerat H2O och blandning på magnetisk omrörningsplatta. |
| b) Lägg 2,7 g natriumfosfat monobasisk (NaH 2 PO 4). | |
| c) Lägg 11,5 g natrium phosphate dibasiskt (NaHPO 4). | |
| d) Tillsätt 9,0 g natriumklorid (NaCl). | |
| e) värm ca.. 700 ml destillerat H2O till 55 ° C och stäng av värmen. | |
| f) Tillsätt 40 g paraformaldehyd (PFA) och rör om i 700 ml vatten med användning av magnetisk omrörningsplatta. | |
| g) Kombinera PBS (a, b, c, d) och PFA (e, f) lösningar, justera pH till 7,4 och fyll upp till den slutliga volymen av 1000 ml. | |
| 0,1% natriumazidlösning | a) Lägg till 1 g pulveriserad natriumazid (NaN3) till en L PBS-lösning. |
| b) Blanda med hjälp av magnetisk omrörarplatta och förvara vid 4 ° C. |
Tabell 2. Lösningar och Recept
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efter CldU (eller BrdU) administrering, kan tidslinje tillämpning av farmakologiska medel väljas för att rikta nyfödda DGCs under särskilda utvecklings fönster. Till exempel kan en hypotetisk medel appliceras under den andra veckan efter CldU injektion, vilket föreslås att sammanfalla med en ålder av omogna nervceller som är i ett utvecklingsstadium där GABA depolariserande. Framtida studier med detta protokoll kunde anpassa det farmakologiska ämnet och fönstret för exponering för "skräddarsy" den inställning till den specifika experimentella frågan av intresse.
Ett viktigt kriterium för att fastställa att slice kulturer är en giltig modell för postnatal neurogenes forskningen är förmågan att färga och kvantifiera nyfödda nervceller i hippocampus. De två viktigaste resultaten till stöd för denna hypotes var att mikroskopisk analys avslöjade immunhistokemisk reaktivitet för CldU och endogena proteinmarkörer i samma nervceller.Vid användning i kombination med endogena neuronala markörer, tymidinanaloger såsom BrdU och CldU är kraftfulla verktyg för neurogenes forskning.
Tillämpningen av tymidinanaloger, såsom BrdU via intraperitoneala injektioner vanligen utnyttjas i neurogenes forskning till etikett neuroner genomgår S-fas mitos 29. Liknande metoder kan användas i organotypiska kulturer med vissa modifieringar. Till exempel, tidigare studier administrerade BrdU (0,5 ^ M i 3 dagar) för att skära kulturer efter ~ 14 DIV 18. Granska data som presenteras i detta papper visar att vissa av de mätetal som används för att kvantifiera neurogenes inte anställer de standardtekniker som används inom neurogenes området, det vill säga, stereologisk kvantifiering 30. Till exempel, vid rapportering samuttrycket av BrdU och neurala-kärnor (NeuN) positiva celler, de anger ett totalt antal celler "per kultur" istället för att tillhandahålla informationation beträffande vävnadsområde eller volym.
Senare studier förbättrades på denna metod genom sektione de odlade skivor till enskilda 10 um sektioner, vilket förbättrade visualisering och immunohistokemi protokoll genom att tillåta antikroppar mot lättare genomsyra vävnadsproverna 31. Bunk et al. 28 rapporterade dubbel märkning med BrdU (10 ^ M för 3 dagar) som antalet co-märkta celler per 10 um avsnitt, men inte ge information om den jämförande område eller specifika hippocampus regionen studerade dvs CA1, CA3 eller GD. Dessutom innebär analys av konfokala och fluorescensmikroskopi bilderna inte övertygande visar att hippocampus morfologi framgångsrikt upprätthålls.
Viktigt båda studierna använde en period BrdU exponering på 3 dagar, vilket har tillhörande nackdelar. BrdU märkning har kraftigt understödda neurogenes studier genom att låta utredarna att spåra nyligen uppdelade celler i various hjärnregioner. Men BrdU toxicitet har också väl karakteriserade. Dess användning har visats orsaka morfologiska och beteendeavvikelser 32,33 och negativa effekter på cellcykeln, differentiering, migration och överlevnad av neurala stamceller 34-36. Den långvarig administrering av BrdU i de tidigare nämnda studierna kan ha infört störande variabler som förändrade hippocampus fysiologi och medan vissa biverkningar från BrdU administration kan vara oundvikligt, var vår försöksprotokoll som syftar till att begränsa vissa av dessa komplikationer genom inkubation vävnaden med tymidinanaloger för 2 tim. Dessutom valde vi att använda CldU istället för BrdU eftersom det visade bättre löslighet än BrdU vid upprättandet av inkubation lösningen. Även om 3 dag protokollet kan vara användbart för vissa experimentella designer t.ex. maximera märkning av prolifererande celler, har detta 2 tim protokoll en fördel med puls-märkning av en relativt liten populning av celler som kan studeras vid önskade överlevnadstider (se figur 2B).
Genom att jämföra nivån av neuronal produktionen efter två olika metoder för BrdU ansökan, Namba et al. Gjort ett viktigt bidrag till märkningstekniker i organotypiska slice kulturer 37. Författarna jämfördes intraperitoneal (IP) injektion av BrdU (50 mg / kg) i postnatal dag 5 (P5) råttor med in vitro-kulturer som erhöll odlingsmedium innehållande 1 | iM BrdU under 30 minuter omedelbart efter explantation av vävnad. De rapporterar ingen statistiskt signifikant skillnad mellan in vivo och tidig in vitro BrdU injektion i odlad vävnad. Författarna har inte presentera tydliga bilder som beskriver hippocampus struktur men de rapporterar BrdU immunreaktivitet som procent av totala antalet celler i granulatcellager. Medan de använder stereologisk räkning, skulle ge ett mått per område eller volym vara värdefullt. I allmänhet, De citerade studierna nuvarande organotypiska kulturer som en grundlig detaljer av postnatal hippocampus slice kulturer, med applikationer för studier av neurogenes och farmakologiska störningar. Med denna teknik kan hippocampus skivor behållas i upp till 21 dagar in vitro (DIV) och droger kan läggas till mediet när som helst i odlingsperioden för att studera effekten på neurogenes.
Vårt mål var att märka en diskret, relativt homogen befolkning DGCs genom att tillhandahålla en kort "puls" tillämpning av CldU under 2 timmar. En allmänt används strategi för att studera neurogenes involverar identifiering av en neuron s mognads- skede via immunhistokemisk färgning av olika endogena markörer med en tymidinanalog. Konfokal och fluorescensmikroskopi bekräftade förekomsten av kärnor som inkorporerade tymidinanalogen CldU och var därför aktivt genomgår mitos under odlingsperioden. Figur 2 in vivo analys vävnad kan anpassas för slice kulturer.
Specifikt är en vanligt förekommande metod neurogenes forskning för att utföra immunhistokemisk färgning för mikrotubuli associerat protein, DCX, vilket främst uttrycks i omogna nervceller från dag 3-21 och den mogna neuronal markör, Calbindin (CABP), som är fullt uttryck efter 28 dagar efter mitos. Fenotypen av CldU + celler bestämdes med hjälp av dessa endogena markörer 26.
Förbättrade metoder för att upprätthålla slice kulturer för längre perioder kan ha den ytterligare fördelen att fler CldU + nervceller att nå den mogna, CABP + stadium. För närvarande är en begränsning av organotypisk kultur att vävnaden kontinuerligt förändras under odlingsperioden. Till exempel, omedelbart efter hippocampus dissektion och plätering av skivor, det tissue har en bredd av ungefär 400 pm. Men efter 2-3 veckor i inkubationskammaren kommer vävnadsskivor börja tunn, vilket resulterar i en slutlig bredd mellan 250-350 | im. Detta begränsar mängden av vävnad som kan användas för immunohistokemi och bör beaktas när man planerar hur många djur som ska användas för ett projekt. Ytterligare experiment hjälper karakterisera de funktionella förändringar i hippocampus fysiologi som sker in vitro.
Protokollet för sektione och färgning hippocampus skivor utvecklades för att analysera cellulära och morfologiska förändringar som sker under odlingsperioden. Slice kulturer ger en möjlighet att testa effekten av olika farmakologiska medel som hippocampus DGCs passerar distinkta utvecklingsstadier under mognad och utgör ett värdefullt verktyg för framtida vuxna neurogenes studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A.
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H.
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
