Abstract
Ингибитор кальциневрина такролимуса является краеугольным камнем большинства иммуносупрессивных протоколов лечения после трансплантации солидных органов в Соединенных Штатах. Циклоспорин представляет собой узкий терапевтический индекс наркотиков и, соответственно, требует терапевтического мониторинга наркотиков и корректировка дозы на основе всей его концентрации корыто крови. Для облегчения домашнего терапевтический препарат и контроля за соблюдением, сбор сухих пятен крови является привлекательным понятием. После прокола пальца, пациент собирает капли крови на фильтровальной бумаге в домашних условиях. После того, как кровь сушат, она по почте в аналитическую лабораторию, где циклоспорин количественно с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС / МС) в сочетании с простой ручной стадии осаждения белка и экстракции онлайн колонки.
Для анализа такролимус, 6-мм диск выбиты из насыщенного центре пятна крови. Пятно крови гомогенизируют, используя пули смесителе сЗатем белки й осаждают метанолом / 0,2 М ZnSO 4, содержащий внутренний стандарт D 2, 13 С-такролимус. После вихревого и центрифугирования добавляли 100 мкл супернатанта вводят в колонну онлайн экстракции и промывают 5 мл / мин 0,1 муравьиной кислоты / ацетонитрила (7: 3, по объему) в течение 1 мин. Далее, переключающий клапан активируется и аналиты обратно промыть на аналитической колонке (и разделяли, используя 0,1% муравьиной кислоты / ацетонитрил градиент). Циклоспорин количественно в положительном режиме реакции несколькими (MRM) с использованием тандемной масс-спектрометра.
Анализ линейной от 1 до 50 нг / мл. Вариабельность-анализ (3,6% -6,1%) и точность (91,7% -101,6%), а проверяется в течение 20 дней отвечают критериям приемлемости. Средняя восстановление добыча 95,5%. Там нет соответствующих перенос, матричные помехи и матричные эффекты. Циклоспорин является стабильным в сухой капли крови при комнатной температуре и при + 4 ° С в течение 1 недели. Извлеченные образцы впробоотборник стабильны при температуре +4 ° С в течение, по крайней мере 72 часов.
Introduction
Циклоспорин является мощным immonosuppressant 1-7, который имеет структуру макролидное 8 (рис 1). Благодаря цис - транс изомерии связей CN образует два ротамеров в растворе 9, которые могут быть разделены с обращенной фазой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Циклоспорин обладает липофильными и растворим в спиртах (метанол: 653 г / л, этанол: 355 г / л), галогенированные углеводороды (хлороформ: 573 г / л) и эфир. Это редко растворимы в алифатических углеводородов (гексан: 0,1 г / л и воды (рН 3:. 0,0047 г / л) 9 молекула не содержат каких-либо хромофора и его максимум УФ-поглощения 192 нм Циклоспорин действует через ингибирование кальцинейрина. . Механизм его действия был рассмотрен в ссылках 10,11. В настоящее время используется более чем в 80% больных после трансплантации твердых органов в Соединенных Штатах 12.
Терапевтический индекс такролимуса составляет considered, чтобы быть узкой 13. Кроме того, корреляция между такролимуса доз и концентрации в крови низкое, и фармакокинетики является переменной 14,15. Терапевтический лекарственный мониторинг, чтобы направлять циклоспорин дозирования у пациентов после трансплантации поэтому вообще клинической практике 16-20. Целью является, чтобы держать концентрацию такролимуса в крови в течение заранее определенного терапевтического диапазона. Концентрации Циклоспорин крови ниже терапевтического диапазона может привести к повышенной активности хронических или острых алло-иммунных реакций, в то время как при концентрации выше терапевтического окна увеличивают риск избыточного иммунитета, рак и токсичность, например, нефротоксичности, нейротоксичность, гипертензию и сахарный диабет. Высокая Фармакокинетические внутри индивидуальная изменчивость такролимуса может быть вредным для обоих пересадки органов и выживаемость пациентов 21,22. В то время как между индивидуальная изменчивость фармакокинетики такролимуса в основном вызвано CYP3A5 полиморфизмов, причин внутрииндивидуальнаяИзменчивость включают, но не ограничиваются ими, межлекарственных, болезни лекарственного средства и пищевого наркотиков взаимодействий 14,15. Также не хватает приверженности к иммуносупрессивной терапевтического лечения наркотиков является фактором, и одной из основных причин потери трансплантата 23,24.
Эти соображения показывают, что частое домашнего терапевтическое лекарственное средство и соблюдение контроль такролимуса целых концентрации в крови может быть полезным для того, чтобы пациенты имеют циклоспорин экспозицию в желаемой терапевтической окна в любой момент времени. Тем не менее, логистика и стоимость чаще терапевтического лекарственного мониторинга, как это текущий клинической практики 15 является запретительной. Одной из причин является то, что пациент должен видеть Phlebotomist иметь необходимую образце венозной крови обращается. Сухих пятен крови недавно появились в качестве привлекательного концепции 25-28. После простой пальца придерживаться пациента собирает капли крови на специальный бумажный фильтр карты и после пятно крови DРид, он может быть отправлен по почте в центральную лабораторию для анализа такролимуса и любой другой иммунодепрессант, что пациент может принимать в данный момент. Это стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и конкретных ЖХ-МС / МС анализов для количественного такролимуса и других иммунодепрессантов в очень малых объемах крови, таких как сушеные пятна крови (обычно 20 мкл крови) 25,29-43. Еще одним преимуществом является то, что минимально инвазивные, низкие стратегии сбора образцов, таких как объем сухих пятен крови значительно облегчит лекарственного мониторинга и фармакокинетические исследования у маленьких детей 28.
Циклоспорин, как правило, измеряется в венозной крови с ЭДТА всей 15. Причины в том, что такролимус широко распространяет в клетки крови и клинические исследования показали, лучшую корреляцию между концентрациями такролимуса в крови корыто, чем в плазме с клиническими событиями 15,18. Для сравнения, анализ таcrolimus в сухой капли крови на основе капиллярной крови, который смешивается с фильтровальной бумаги матрицы. Это создает проблемы с точки зрения солюбилизации такролимуса и потенциальных помех с анализом ЖХ-МС / МС. Здесь мы представляем установленную и проверенную анализа, основанного на усреднении высушенного месте в крови, используя пули блендер в сочетании с высокой пропускной образца онлайн колонки очистить процедуры и анализа ЖХ-МС / МС. На сегодняшний день, этот анализ был успешно использован для количественного определения более пяти тысяч такролимуса сушат точечных проб крови для мониторинга приверженности в клинических испытаниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Де-идентифицированные образцы крови от здоровых лиц были из университета Колорадо больницы (Аврора, Колорадо). Использование образцов крови банковских обезличенной для исследований по валидации, а также для подготовки калибраторов и контрольных образцов качества считалась "освобождаются" от Колорадо нескольких Экспертный совет (COMIRB, Аврора, Колорадо).
1. Подготовка справки и решения
- Покупка такролимус и внутренний стандарт D 2, 13 С-такролимус от поставщиков, перечисленных в Списке материалов.
- Подготовка исходных растворов в чистого метанола в концентрации 1 мг / мл для такролимуса и концентрации 10 мкг / мл для D 2, 13 С-такролимуса. Сделайте растворы справочных материалов на основе трех независимых весов. Кратные растворы и хранят при -70 ° С или ниже.
- Приготовьте раствор для осаждения белкови извлекать такролимус, используя метанол / 0,2М ZnSO 4 в воде (7: 3, по объему). Это решение также содержит внутренний стандарт D 2, 13 С-такролимус в концентрации 2,5 нг / мл и используется для извлечения всех образцов для извлечения образцов, кроме пустых (см 1.3.3).
- Подготовьте осаждения белка раствор свежей каждый день экстракции и установить истечение раствора при 12 ч.
- Подготовка калибровочной кривой и (КК) образцов контроля качества
- Подготовка исходных растворов такролимуса, выполняя соответствующие разведения исходного раствора использовании чистого метанола.
- Чтобы приготовить калибраторов и контрольных образцов качества, шип 20 мкл соответственно разбавленного раствора в ЭДТА цельной крови, инкубируют при 37 ° С при осторожном встряхивании на водяной бане, чтобы обеспечить однородное распределение такролимуса в клеточных компонентов крови в течение 20 минут и аликвоты в 1,5 мл полипаropylene трубки с коническим днищем и оснастки крышками. Убедитесь, что относительный объем органического растворителя не превышает 5%.
- Пятно 50 мкл цельной крови шипами в середине каждого круга на фильтре карт с использованием пипетки.
- Сушат пятна крови на фильтровальной карт при комнатной температуре в течение 3 часов.
- Подготовка калибровочных такролимус стандарты человеческого ЭДТА цельной крови при концентрации такролимуса 1, 2.5, 5, 10, 25, и 50 нг / мл. Приготовьте чистый образец для извлечения как калибровочных с осаждения белка раствора, содержащего внутренний стандарт D 2, 13 C-такролимус ("нулевой образец").
- Подготовка образцов QC в человеческой цельной крови EDTA в концентрации 0, 2, 4, 20, 40 нг / мл. Приготовьте чистый образец. В отличие от образцов QC, которые извлекаются с осадками, содержащего внутренний стандарт D 2, 13 С-циклоспорин, извлечь этот холостой пробе с осаждения белка решение, котороене содержит внутреннего стандарта D 2, 13 C-такролимус ("пустой образец").
- Коллекция образцов клинических
- Соберите высушенные пятна крови, как описано в 43,44.
2. Добыча такролимуса засохшей крови пятна Образцы
- Осмотрите сухой капли крови, чтобы обеспечить приемлемое качество образца и объем 45.
- Удар центре пятна крови на фильтровальной карты с 6-мм дырокола.
Примечание: Качество ударов может контролироваться путем взвешивания. Пробивки насыщенный фильтр диска весит в среднем 5,02 мг ± 0,09 мг (диапазон: 4.83- 5.14 мг, N = 12). - Место диски в 1,5 мл полипропиленовые пробирки с коническим дном и оснастки крышками.
- Добавить 20-30 пули в каждую пробирку.
- Добавить 500 мкл раствора осаждения белка (метанол: 0,2 М ZnSO 4, 7: 3, по объему с 2,5 нг / мл внутреннего стандарта) в каждую пробирку. Для ОтбораДействие холостых проб, используйте белка осадков решение без внутреннего стандарта.
- Перемешать диски в блендере пули за 1 мин (максимальная скорость, установив "10").
- Взболтать образцы при комнатной температуре на несколько труб вихря (максимальной скорости, установив "10") в течение 10 мин.
- Центрифуга образцов при 16000 х г и 4 ° С в течение 10 мин.
- Передача супернатанты в стеклянные флаконы для ВЭЖХ, оснащенных 300 мкл вставки. Используйте предварительно щели тефлоновые уплотнения.
Примечание: Выдержки пробы могут храниться при температуре -20 ° С или ниже до анализа ЖХ-МС / МС.
3. ЖХ-МС / МС анализ
- Нагрузка 100 мкл супернатанта извлеченного образца на экстракционной колонне С8 картриджа и мыть с 7: 3 соотношение 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле: воде при скорости потока 5 мл / мин в течение 1 мин. Соединения переключающего клапана показаны на рисунке 2, а градиент ведении экстракции насосом в таблице 1
- Далее, активировать клапан переключения в результате обратной промывки аналитов из предварительно колонке на аналитической колонке.
- Установите термостат колонки 65 ° С.
- Элюируйте анализируемых из аналитической колонки, используя скорость потока и градиента, показанные в таблице 1.
- Подключение аналитической колонки с помощью масс-спектрометра тандеме с помощью источника ионизации электрораспылением турбо. Отрегулируйте основные параметры масс-спектрометра в соответствии с таблицей 2.
- Обнаружение положительных ионов ([M + Na] +) в режиме множественного реакционного (MRM). Используйте следующие ионные переходы для количественного: циклоспорин: M / Z (масса / заряд) = 826,6 → 616,2 и D 2, 13 C-такролимус: м / г = 829.6 → 619,2.
Примечание: Общее время работы составляет 4,6 мин.
4. Количественное
- Для каждого прогона, генерировать калибровочную кривую на основе калибраторов, полученных в 1.3.5 ивключать в каждый аналитической перспективе.
- Создание калибровочный график, откладывая концентрации номинальные против фактора отклика анализируемого (площадь пика [Аналит] / площадь пика [внутренний стандарт]) с помощью программного обеспечения масс-спектрометра.
- Установите калибраторы использованием квадратичной аппроксимации в сочетании с 1 / X взвешивания.
- Для количественной такролимуса в сухих пятен крови интегрировать такролимус и внутренний стандарт пики в извлеченных MRM хроматограмм. Рассчитать коэффициент отклика для такролимуса (площадь пика [аналита] / площадь пика [внутренний стандарт]) и сравнить с калибровочной кривой с использованием масс-спектрометрии программное обеспечение.
5. Процедуры валидации
- Нижний предел обнаружения (LLOD) и нижний предел количественного (LLOQ).
- Рассмотрим самую низкую концентрацию такролимусом с соотношением пик-шум 4: 1 в качестве нижнего предела обнаружения (LLOD). Определить нижний предел количественного (LLOQ) в качественизкая концентрация по калибровочной кривой с точностью, равной или лучшей, чем ± 20% отклонения от номинальной концентрации и точности, равной или выше, чем 20% (коэффициент дисперсии).
- Внутри- и дня точность и уточнений.
- Испытание точность и четырех уровней концентрации 2 нг / мл (QC1), 4 нг / мл (QC2), 20 нг / мл (QC3) и 40 нг / мл (Qc4).
- Подготовка образцов КК на каждый день проверки в человеческой цельной крови с ЭДТА, сушат на фильтрующих карт, экстракта и анализируют, как описано выше.
- Определить точность внутри-дневной и точность, с 6 образцов в уровне концентрации КК.
- Оценка точности между дневной и точность в течение 20 дней. Измерьте каждый уровень контроля качества с 4 образцов каждый день.
- Анализ двух калибровочных кривых вместе с образцами КК на каждый день.
- Рассчитать точность внутри-дневной как% от номинальной концентрации (шесть образцов на уровне концентрации, пожалуйста, см 5.2.2). CalcУлате точность как коэффициент дисперсии (CV%).
- Рассмотрим точность внутри дня приемлемым, если он попадает в принятие ограничивает 85% до 115% от номинальной концентрации. Рассмотрим внутри-дневной точность приемлемым, если он равен или лучше, чем CV (коэффициент дисперсии) в 15%.
- Рассчитать точность среди дня и точность как среднее для каждого уровня концентрации анализируемого QC над 20 дней проверки.
- Рассмотрим среднее точность между день приемлемой, если она попадает в принятие ограничивает 85% до 115% от номинальной концентрации. Рассмотрим между день точности приемлемо, если он равен или лучше, чем CV (коэффициент дисперсии) в 15%.
- Исключение матричных помех.
- Для исключения помех, которые могут быть вызваны матричных сигналов, анализа пустые сухих пятен крови (8 разных людей, предпочтительно 4 мужчин и 4 женщины).
- Осмотрите ионные хроматограммы. Если пики в пределах времени удерживанияОкно такролимуса обнаружены, интегрировать и сравнивать их площади под кривой с тех такролимуса пиков в чистых проб с шипами такролимуса в LLOQ. Площадь пиков в чистых проб не должны превышать 15% от тех, такролимуса в LLOQ.
- Ион подавление / усиление ионом.
- Используйте протокол вливания пост-столбца, как описано 45 для оценки потенциального вмешательства повышения ионной подавление / ионов, вызванные совместно элюирование компонентов матрикса.
- Наполните такролимус в концентрации 10 мкг / мл, растворенные в 0,1% муравьиной кислоты: метанол (30:70, об / об) пост-колонки со скоростью 10 мкл / мин.
- Подключение шприцевого насоса через тройник между аналитической колонки и электрораспылением источник масс-спектрометра.
- Монитор интенсивности МС / МС сигнала MRM переходов для такролимуса и его внутренний стандарт (м / Z = 826,6 → 616,2 и м / Z = 829,6 → 619,2) после инъекции ExtracТед пустые образцы (N = 8 образцов из разных людей).
Примечание: При отсутствии улучшения ионный подавление / ионов непрерывный сигнал вызван вливанием анализируемых не должны быть затронуты инъекции пустой матрицы, в то время как подавление ионного вызывает падение сигнала и ионов повышения пика.
- Переноситься.
- Оценка потенциального перенесение анализируя извлечены пустые образцы после самых высоких калибраторов (50 нг / мл, п = 6).
- Осмотрите ионные хроматограммы. Если пики в пределах времени удерживания окне такролимуса обнаружены, интегрировать и сравнивать их площади под кривой с тех такролимуса пиков в чистых проб с шипами такролимуса в LLOQ. Площадь пиков в чистых проб не должны превышать 15% от тех, такролимуса в LLOQ.
- Добыча восстановление.
- Определить извлечения путем сравнения сигналов аналитов после извлечения QC СэмаПлес на всех четырех уровнях концентрации (п = 6) за концентрации с тем, пустых сухих пятен крови шипами с соответствующими количествами такролимуса после экстракции.
- Подготовьте четыре набора КК (уровни концентрации: 2, 4, 20, 40 нг / мл).
- Подготовьте еще 4 комплекта соответствующих испытательных образцов "восстановления", определяя 50 мкл ЭДТА заготовки цельной крови на фильтровальной бумаги карт и сушки в течение 2 ч.
- Далее, как для контроля качества и пустых "тестовых образцов восстановления", вырезать всю пятно крови на фильтровальной карты с ножницами и поместить в результате диски в полипропиленовую трубку с коническим днищем и оснастки на крышке.
- Извлечение всех образцов.
- Передача супернатанты (400 мкл) в стеклянные флаконы ВЭЖХ.
- Добавить такролимус маточного раствора с пустыми »образцов экстрагировали восстановления" для достижения концентрации 2, 4, 20 и 40 нг / мл (4 мкл 200, 400, 2000, 4000 нг / мл циклоспорин фондовой зольutions к 400 мкл надосадочной жидкости).
- После анализа ЖХ-МС / МС, сравнить сигналы в обоих образцах КК и «образцов восстановления" в соответствующей концентрации (восстановление% = сигнал образцы шипами, прежде чем образцы добыча / сигнал шипами после экстракции х 100).
- Целостность Разведение.
- Установление целостности разбавления с помощью пробы с шипами аналитов в 500, 250 и 100 нг / мл.
- После экстракции разбавленным образцы, используя осаждение белка решение (1:10, п = 3 на уровень концентрации).
- Рассчитать отклонения от номинальных концентрациях. Рассмотрим результаты, которые находятся в пределах 85% -115% от номинального приемлемым.
- Стабильность.
- Исследовать стабильностью, используя образцы QC на всех четырех уровней концентрации (N = 4 в концентрации) анализировали в различных временных точках и при различных условиях хранения.
- Сравните результаты после хранения с номинальными значениями. Рассмотрим RРЕЗУЛЬТАТЫ, которые входят в 85% -115% от номинального приемлемым.
- Установление стабильности образцов в течение 1 недели при температуре окружающей среды, 1 неделю при 4 ° С, 1 месяца при -20 ° С и 1 месяц при -80 ° С.
- Тест на стабильность при замораживании-оттаивании в течение трех циклов (20 ° C). Тест извлечены выборки и стабильность пробоотборник путем размещения образцов в термостатированный пробоотборником доводили до 4 ° С. Вводите образцы после 72 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные ионные хроматограммы холостой пробе, образец шипами на нижнем пределе квантификации и образца пациента показаны на рисунке 3.
Калибровочные кривые
Нижний предел обнаружения был 0,5 нг / мл, а нижний предел количественного составила 1,0 нг / мл. Пятьдесят нг / мл была выбрана в качестве наивысшего калибратора, как более высокие концентрации вряд ли будет достигнут в клинике при нормальных обстоятельствах.
Калибровочные кривые были свежеприготовленными на каждый день проверки в человеческой цельной крови с ЭДТА, сушат над фильтром карт и экстрагировали смесью метанол / 0,2 М ZnSO 4 (70:30 об / об) + внутренний стандарт (конечная концентрация внутреннего стандарта: 2,5 нг / мл ). Для проверки день 1 (п = 6 для калибраторов и N = 6 для уровня КК) и в течение нескольких дней 2 - 20 (п = 2 для калибраторов и п = 4 для каждого уровня КК) были проанализированы с концентрациями 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 нг / мл для CALIBрение. Типичный калибровочной кривой показан на рисунке 4. Средняя точность на 85% до 115% от номинального, в течение рабочего диапазона для 2/3 калибраторов (с минимум 6 ненулевых калибраторов) были считается приемлемым. Средний коэффициент корреляции был (г) = 0,999 (п = 40 калибровочные кривые).
Погрешность и уточнений
Результаты показаны подробно в таблице 3.
Добыча Восстановление
Средние восстановление добычи были 98,2% (2 нг / мл), 92,2 (4 нг / мл), 95,5 (20 нг / мл), 96,2 (40 нг / мл).
Матрица Интерференция Ион Подавление / Ион Повышение Тестирование с использованием непрерывной пост-колонки Настой и Перенос
Анализ холостых проб из восьми различных лиц (п = 4 самки и N = 4 мужчин) показали сигналов менее 15% от LLOQ (1 нг / мл) в момент удержания, соответствующегоПик такролимус, указывающий, что обнаруженное пиковое такролимус можно считать конкретными. Типичный пример показан на рисунке 3. Потенциальные помехи по ионного подавления / усиления ионов были протестированы с использованием пустых высушенных образцов крови от восьми различных здоровых лиц. Представитель эксперимента показан на рисунке 5. Не наблюдалось никаких признаков значительного повышения ионной подавление / ионов. Нет соответствующих перенос в результате пиков, превышающих 15% от сигнала на LLOQ не были обнаружены.
Разведение целостности
Целостность Разбавление была исследована с помощью анализа образцов, полученных при концентрациях выше максимального калибратора (100, 250 и 500 нг / мл) и разводили 1:10 в растворе белка осадков после экстракции, чтобы достичь целевых концентраций: 10, 25 и 50 нг / мл. Средние точности пришлось подпадают под критерии приемки 85% до 115% от номинальной концентрации. Все разведения TESТед встретился критерии приемки (таблица 4).
Стабильность
Стабильность такролимуса в сухих пятен крови была исследована с помощью анализа образцов КК на всех четырех уровнях (п = 4 / уровень концентрации), которые хранились в различных условиях.
Средние точности пришлось подпадают под критерии приемки 85% до 115% от номинальной концентрации. Результаты показаны в деталях в Таблице 5. Нет потери после 1 недели хранения при комнатной температуре, после 1 недели хранения при 4 ° С, после 1 месяца хранения при -20 ° С, после 1 месяца хранения при -80 ° С, после 3 размораживать циклов, и после 72 ч добытых образцов в автосэмплера при 4 ° С были очевидны.
| Добыча насос | Аналитический (элюирования) Насос | ||||||
| Вода + 0,1% муравьиной кислоты | Ацетонитрил | Расход [мкл / мин] | Время [мин] | Вода + 0,1% муравьиной кислоты | Ацетонитрил | Расход [мкл / мин] | |
| 0 | 70 | 30 | 5000 | 0 | 13 | 87 | 1000 |
| 1 | 70 | 30 | 5000 | 2 | 2 | 98 | 1200 |
| 1.1 | 2 | 98 | 100 | 3.5 | 2 | 98 | 1200 |
| 3 | 2 | 98 | 100 | 3.6 | 13 | 87 | 1000 |
| 3.1 | 20 | 80 | 2000 | 4.6 | 13 | 87 | 1000 |
| 4 | 70 | 30 | 5000 | ||||
| 4.6 | 70 | 30 | 5000 | ||||
Таблица 1. Градиент Программа для извлечения и аналитической ВЭЖХ Насосы.
| Параметр | Установка |
| Столкновение газа (CAD) | 10 |
| Шторы газа (CUR) (фунтов на квадратный дюйм) | 30 |
| Источник ионов газа 1 (GS1) (фунтов на квадратный дюйм) | 50 |
| Ионный источник газа 2 (GS2) (фунтов на квадратный дюйм) | 30 |
| Распылитель тока (NC), (V) | 1 |
| Температура (ПЭМ) (° С) 600 | |
| IonSpray напряжения (IS) (V) | 5500 |
| Нагреватель интерфейса (ИГЕ) | На |
| Декластеризация потенциал (ДП) (V) | 136 |
| Вход потенциал (ЕР) (V) | 10 |
| Столкновение энергии (CE) (V) | 47 |
| Клетка выход возможного столкновения (CXP) (V) | 16 |
Таблица 2. Турбо Электроспрей Интерфейс и масс-спектрометр Параметры. Номенклатура соответствует тому, который используется в массовом программного обеспечения спектрометрии (подробнее производителя, пожалуйста, см список материалов).
| Проверка День | КК Уровень [% от номинальной концентрации] | |||
| 2 | 4 | 20 | 40 | |
| 1 день | 93,0 | 86,3 | 88,9 | 93,4 |
| 101 | 90,4 | 95,3 | 100 | |
| 85,6 | 95,9 | 99,0 | 97,5 | |
| 88,6 | 93,6 | 105 | 103 | |
| 85,0 | 97,4 | 97,2 | 109 | |
| 89,1 | 96,7 | 100 | 101 | |
| Внутри дня Точность [%] | 90,4 | 93,4 | 97,6 | 100,7 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 6.6 | 4.6 | 5.5 | 5.2 |
| День 2 | 92,8 | 86,0 | 103 | |
| 91,1 | 88,8 | 94,7 | 87,0 | |
| 88,6 | 90,9 | 92,8 | 94.2 | |
| 97,2 | 93,7 | 94.2 | 115 | |
| Внутри дня Точность [%] | 92,4 | 89,9 | 96,2 | 97,9 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 3.9 | 3.6 | 4.8 | 12.2 |
| День 3 | 97,6 | 101 | 98,4 | 112 |
| 104 | 85,6 | 102 | 110 | |
| 99,2 | 88,4 | 99,4 | 105 | |
| 96.3 | 87,2 | 108 | 117 | |
| Внутри дня Точность [%] | 99,3 | 90,6 102,0 | 111,0 | |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 3.4 | 7.8 | 4.2 | 4.5 |
| День 4 | 95,2 | 88,6 | 112 | 94,5 |
| 105 | 87,3 | 93,2 | 116 | |
| 99,8 | 96,2 | 103 | 103 | |
| 100 | 104 | 97,2 | 99,4 | |
| Внутри дня Точность [%] | 100,0 | 94,0 | 101,4 | 103,2 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 4.0 | 8.2 | 8.1 | 8.9 |
| День 5 | 106 | 90,4 | 101 | 106 |
| 108 | 89,0 | <TD> 106100 | ||
| 102 | 101 | 96,6 | 128 | |
| 105 | 88,8 | 105 | 107 | |
| Внутри дня Точность [%] | 105.3 | 92,3 | 102.2 | 110,3 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 2.4 | 6.3 | 4.2 | 11.1 |
| День 6 | 90,9 | 93,7 | 119 | 106 |
| 98,8 | 88,1 | 96,4 | 110 | |
| 94,6 | 96.3 | 99,1 | 108 | |
| 108 | 100 | 102 | 102 | |
| Внутри дня Точность [%] | 98,1 | 94,5 | 104.1 | 106,5 |
| 7.5 | 5.3 | 9.8 | 3.2 | |
| День 7 | 85,1 | 87,5 | 99,5 | 95,4 |
| 86,4 | 85,4 | 94,7 | 101 | |
| 94,5 | 87,3 | 98,9 | 94,6 | |
| 85,5 | 97,0 | 101 | 99,6 | |
| Внутри дня Точность [%] | 87,9 | 89,3 | 98,5 | 97,7 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 5.1 | 5.8 | 2.7 | 3.2 |
| День 8 | 86,1 | 92,5 | 91,9 | 102 |
| 87,5 | 91,5 | 95,2 | 88,5 | |
| 115 | 85,6 | 92,1 | 102 | |
| 85,8 | 85,9 | 95,4 | 108 | |
| Внутри дня Точность [%] | 93,6 | 88,9 | 93,7 | 100,1 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 15.3 | 4.1 | 2.0 | 8.2 |
| День 9 | 88,9 | 91,4 | 96,9 | 100 |
| 90.0 | 89,8 | 95,0 | 100 | |
| 69,7 | 85,9 | 95,8 | 109 | |
| 91,9 | 87,0 | 105 | 101 | |
| Внутри дня Точность [%] | 85,1 | 88,5 | 98,2 | 102.5 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 12.2 | 2.9 | 4.7 | 4.3 |
| День 10 | 90,9 | 91,3 | 96,2 | 100 |
| 97,7 | 89,5 | 94,4 | 100 | |
| 99,9 | 109 | 98,7 | 96,8 | |
| 99,1 | 90.0 | 95,7 | 96,1 | |
| Внутри дня Точность [%] | 96,9 | 95,0 | 96.3 | 98,2 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 4.2 | 9.9 | 1.9 | 2.1 |
| День 11 | 92,7 | 91,9 | 88,2 | 104 |
| 96,6 | 91,2 | 97,0 | 110 | |
| 109,0 | 92,8 | 970,6 | 102 | |
| 98,3 | 107 | 93,7 | 111 | |
| Внутри дня Точность [%] | 99,2 | 95,7 | 94,1 | 106,8 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 7.0 | 7.9 | 4.6 | 4.1 |
| День 12 | 87,7 | 85,5 | 105 | 95,3 |
| 112 | 88,1 | 101 | 96,1 | |
| 102 | 89,1 | 89,7 | 97,5 | |
| 106 | 92,5 | 102 | 104 | |
| Внутри дня Точность [%] | 101,9 | 88,8 | 99,4 | 98,2 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 10.1 | 3.3 | 6.7 | 4.0 |
| День 13 | Не смогли | 85,7 | 93,3 | 102 |
| 101 | 105 | 88,0 | 93.9 | |
| 112 | 98,0 | 91,4 | 102 | |
| 104 | 113 | 104 | 101 | |
| Внутри дня Точность [%] | 105,7 | 100,4 | 94.2 | 99,7 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 5.4 | 11.5 | 7.3 | 3.9 |
| День 14 | 91,5 | 89,1 | 97,4 | 93,1 |
| 90,4 | 87,1 | 93.9 | 99,8 | |
| 89,7 | 97,0 | 94,8 | 106 | |
| 97,4 | 86,8 | 89,9 | Не смогли | |
| Внутри дня Точность [%] | 92,3 | 90.0 | 94,0 | 99,6 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 3.8 | 5.3 | 3.3 | 6.5 |
| День 15 | 92,8 | 92,8 | 92,5 | 95,4 |
| 97,5 | 96.3 | 96,2 | 95,5 | |
| 95,5 | 108 | 97,3 | 99,3 | |
| 110 | 109 | 115 | 113 | |
| Внутри дня Точность [%] | 99,0 | 101,5 | 100,3 | 100,8 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 7.7 | 8.1 | 10.0 | 8.3 |
| День 16 | 93,7 | 97,8 | 90,7 | 112 |
| 90,3 | 87,1 | Не смогли | 101 | |
| 97,9 | 88,3 | 95,5 | 107 | |
| 91,4 | 85,7 | 89,3 | 96,7 | |
| Внутри дня Точность [%] | 93,3 | 89,7 | 91,8 | 104.2 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 3.6 | 6.1 | 3.5 | 6.4 |
| День 17 | 88,0 | 86,0 | 93,7 | 103 |
| 89,8 | 90,8 | 94,8 | 93,2 | |
| 85,9 | 91,1 | 99,7 | 94,8 | |
| 86,7 | 88,1 | 95,6 | 91,7 | |
| Внутри дня Точность [%] | 87,6 | 89,0 | 96,0 | 95,7 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 1.9 | 2.7 | 2.7 | 5.3 |
| День 18 | 89,6 | 85,8 | 91,0 | 98,3 |
| 89,6 | 86,2 | 88,3 | 93,6 | |
| Не смогли | 86,7 | 96,8 | 104 | |
| 88,1 | 85,8 | 95,2 | 111 | |
| Внутри дня Точность [%] | 89,1 | 86,1 | 92,8 | 101,7 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 1.0 | 0,5 | 4.2 | 7.4 |
| День 19 | 98,0 </ TD> | 89,7 | 94.2 | 102 |
| 88,3 | 86,0 | 97,6 | 102 | |
| 91,6 | 88,1 | 95,8 | 97,5 | |
| 90,7 | 90,1 | 92,8 | 88,3 | |
| Внутри дня Точность [%] | 92,2 | 88,5 | 95,1 | 97,5 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 4.5 | 2.1 | 2.2 | 6.6 |
| День 20 | 93,0 | 87,0 | 99,4 | 101 |
| 97,3 | 87,6 | 95,5 | 91,9 | |
| 89,0 | 88,4 | 91,2 | 93,5 | |
| 104 | 90,7 | 97,7 | 115 | |
| Внутри дня Точность[%] | 95,8 | 88,4 | 96,0 | 100,4 |
| Внутри дня Неточность [CV%] | 6.7 | 1.8 | 3.7 | 10.5 |
Интер-день Точность и Воспроизводимость | ||||
| Интер-день Точность | 95,2 | 91,7 | 97,2 | 101.6 |
| Интер-день Неточность | 6.1 | 4.5 | 3.6 | 4.2 |
Таблица 3. Результаты контрольных проб качества более 20 дней. Данные представлены в виде% от номинального. Образцы, перечисленные в качестве "не удалось" образцы, которые были потеряны на ошибки лаборатории / прибора. В большинстве CASES, никаких пиков не было обнаружено вообще, либо внутренний стандарт пик отсутствует.
| Разведение | 1:10 |
| Номинальная концентрация целевой после разбавления | 50 нг / мл |
| 98,6 | |
| 94,5 | |
| 91,4 | |
| Точность [%] | 94,8 |
| Неточность [CV%] | 3.6 |
| Разведение | 1:10 |
| Номинальная концентрация целевой после разбавления | 10 нг / мл |
| 103 | |
| 99,5 | |
| 101 | |
| Точность [%] | 101,2 |
| Неточность [CV%] | 1.8 |
| Разведение | 1:10 |
| Номинальная концентрация целевой после разбавления | 25 нг / мл |
| 91,7 | |
| 98,2 | |
| 103 | |
| Точность [%] | 97,6 |
| Неточность [CV%] | 5.7 |
Таблица 4. Результаты Разведение целостности тестирования. Данные представлены в виде% от номинального.
| Стабильность при комнатной температуре, день 1 | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 91,9 | 85,8 | 86,0 | 102 | |
| 86,7 | 85,7 | 88,5 | 102 | |
| 86,0 | 85,9 | 90,1 | 103 | |
| 89,2 | 98,0 | 90,8 | 112 | |
| % От номинальной концентрации | 88,5 | 88,9 | 88,9 | 104,8 |
| Неточность [% CV] | 2.7 | 6.1 | 2.1 | 4.9 |
| Стабильность при комнатной температуре, день 3 | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 88,6 | 105 | 101 | 113 | |
| 94,1 | 100 | 98,5 | 103 | |
| 100 | 101 | 106 | 109 | |
| 99,5 | 102 | 102 | 108 | |
| % От номинальной концентрации | 95,6 | 102,0 | 101,9 | 108,3 |
| Неточность [% CV] | 5.3 | 2.2 | 3.1 | 4.1 |
| Стабильность при комнатной температуре, День 7 | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 105 | 103 | 91,7 | 109 | |
| 101 | 107 | 100 | 110 | |
| 102 | 108 | 107 | 105 | |
| 93,8 105 | 109 | 111 | ||
| % От номинальной концентрации | 100,5 | 105,8 | 101,9 | 108,8 |
| Неточность [% CV] | 4.7 | 2.2 | 7.8 | 2.6 |
| В | ||||
| Стабильность при +4 ° С, день 1 | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 101 | 89,9 | 95,8 | 100 | |
| 88,9 | 91,0 | 94,1 | 99,0 | |
| 96,2 | 100 | 102 | 96,7 | |
| 89,5 | 87,8 | 95,4 | 88,6 | |
| % От номинальной концентрации | 93.9 | 92,2 | 96,8 | 96,1 |
| Неточность [% CV] | 5.8 | 5.4 | 3.5 | 5.2 |
| Стабильность при + 4 ° С, днем 3 | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 85,2 | 105 | 95,3 | |
| Не смогли | 87,8 | 101 | 96 | |
| 101 | 88,8 | 89,6 | 97,5 | |
| 106 | 92,2 | 102 | 104 | |
| % От номинальной концентрации | 98,1 | 88,5 | 99,4 | 98,2 |
| Неточность [% CV] | 9.7 | 2.9 | 6.8 | 4.0 |
| Стабильность при +4 ° С, день 7 | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 94,0 | 98,5 | 96,1 | 110 | |
| 92,9 | 96,4 | 109 | 109 | |
| 91,7 | 96.3 | 97,9 | 115 | |
| 94,7 | 96,9 | 99,8 | 113 | |
| % От номинальной концентрации | 93,3 | 97,0 | 100,7 | 111,8 |
| Неточность[%РЕЗЮМЕ] | 1.3 | 1.0 | 5.7 | 2.8 |
| С | ||||
| Стабильность при -20 ° С, днем 3 | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 98,7 | 111 | 111 | |
| 93,5 | 89,6 | 108 | 105 | |
| 89,5 | 91,5 | 107 | 112 | |
| 88,2 | 99,1 | 108 | 92,4 | |
| % От номинальной концентрации | 89,6 | 94,7 | 108,5 | 105,1 |
| Неточность [% CV] | 2.7 | 4.9 | 1.7 | 9.0 |
| Стабильность при -20 ° С, днем 7 | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 98,7 | 102 | 109 | |
| 94,8 | 94,6 | 114 | 106 | |
| 95,5 | 102 | 98,1 | 108 | |
| 107 | 99,5 | 115 | 105 | |
| % От номинальной концентрации | 98,5 | 98,7 | 107,3 | 107 |
| Неточность [% CV] | 5.7 | 3.1 | 8.5 | 1.8 |
| </ TD> | ||||
| Стабильность при -20 ° С, днем 30 | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 82,3 | 83,1 | 90,4 | 93,2 | |
| 87,9 | 85,8 | 85,3 | 97,9 | |
| 85,7 | 88,6 | 98,3 | 98,0 | |
| 92,0 | 95,6 | 110 | 103 | |
| % От номинальной концентрации | 87,0 | 88,3 | 96,0 | 98,0 |
| Неточность [% CV] | 4.1 | 5.4 | 10,8 | 4.0 |
| D </ TD> | |||||||||
| Стабильность при -80 ° С, днем 3 | |||||||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 | |||||
| 87,5 | 96,5 | 96,7 | Не смогли | ||||||
| Не смогли | 97,6 | 98,7 | 110 | ||||||
| 88,8 | 96,4 | 106 | 109 | ||||||
| 87,3 | 101 | 96,5 | 109 | ||||||
| % От номинальной концентрации | 87,9 | 97,9 | 99,5 | 109,3 | |||||
| Неточность [% CV] | 0,8 | 2.2 | 4.5 | 0,6 | |||||
| Стабильность при -80 ° С, днем 7 | Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 | ||||
| Не смогли | 98,0 | 105 | 99,8 | ||||||
| 97,1 | 106 | 104 | 105 | ||||||
| 99,7 | 102 | 99,3 | 102 | ||||||
| 101 | 99,9 | 109 | 106 | ||||||
| % От номинальной концентрации | 99,3 | 101,5 | 104.3 | 103,2 | |||||
| Неточность [% CV] | 2.0 | 3.4 | 4.0 | 2.8 | |||||
| Стабильность при -80 ° С, днем 30 | |||||||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | | 20 | 40 | | |||||
| 88,2 | 85,3 | 89,6 | 96,7 | ||||||
| 96,2 | 92,6 | 85,8 | 94,1 | ||||||
| 83,9 | 93,7 | 91,0 | 105 | ||||||
| 95,6 | 94,0 | 98,9 | 102 | ||||||
| % От номинальной концентрации | 91,0 | 91,4 | 91,3 | 99,5 | |||||
| Неточность [% CV] | 6.0 | 4.1 | 5.5 | 4.9 | |||||
| Е | ||||
| Замораживание стабильность оттепель, -20 ° С, 1 цикл | ||||
| Уровень КК [нг / мл] </ TD> | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 92,5 | 86,2 | 90,2 | 94,3 | |
| 89,8 | 90,5 | 85,4 | 104 | |
| 94,7 | 88,6 | 93,4 | 104 | |
| 101 | 89,2 | 93,7 | 96.3 | |
| % От номинальной концентрации | 94,5 | 88,6 | 90,7 | 99,7 |
| Неточность [% CV] | 4.8 | 1.8 | 3.9 | 5.1 |
| Замораживание оттепели стабильности, -20 ° С, 2 цикла | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 99,1 | 97,6 | Не смогли | 85,3 | |
| 93,1 | 88,1 | 93,4 | 92,0 | |
| 94,9 | 91,5 | 85,8 | 93.9 | |
| Не смогли | 90,5 | 86,8 | 85,4 | |
| % От номинальной концентрации | 95,7 | 91,9 | 88,7 | 89,2 |
| Неточность [% CV] | 3.1 | 4.0 | 4.1 | 4.5 |
| Замораживание оттепели стабильности, -20 ° С, 3 цикла | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 95,7 | Не смогли | 86,0 | 93,3 | |
| 95,5 | 87,4 | 85,0 | 91,3 | |
| 90,5 | 89,1 | 86,0 | 86,0 | |
| 96,9 | 85,7 | 90,2 | Не смогли | |
| % От номинальной концентрации | 94,7 | 87,4 | 86,8 | 90,2 |
| Неточность [% CV] | 2.8 | 1.7 | 2.3 | 3.8 |
| F | ||||
| Выдержки стабильность образца при +4 ° С, 24 ч | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 122 | 112 | 91,0 | 104 | |
| 93,5 | 106 | 91,8 | 96,1 | |
| 111 | 94,8 | 98,2 | 93,5 | |
| 98,4 | 97,6 | 91,3 | 89,8 | |
| % От номинальной концентрации | 106,2 | 102.6 | 93,1 | 95,9 |
| Неточность [% CV] | 12.8 | 7.9 | 3.4 | 6.0 |
| Выдержки стабильность образца при +4 ° С, 48 ч | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 106 | 108 | 93,7 | 110 | |
| 105 | 98,1 | 94,6 | 98,9 | |
| 103 | 98,4 | 95,0 | 92,6 | |
| 108 | 93,1 | 89,7 | 85,5 | |
| % От номинальной концентрации | 105.5 | 99,4 | 93,3 | 96,8 |
| Неточность [% CV] | 2.1 | 6.2 | 2.4 | 10.4 |
| Выдержки стабильность образца при +4 ° С, 72 ч | ||||
| Уровень КК [нг / мл] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 112 | 96,4 | 104 | |
| 101 | 95,3 | 103 | 95,2 | |
| 94.2 | 105 | 93,5 | 99,5 | |
| 100 | 96,9 | 92,6 | 89,3 | |
| % От номинальной концентрации | 97,9 | 102,3 | 96,4 | 97,0 |
| Неточность [% CV] | 3.1 | 7.7 | 4.7 | 6.3 |
Таблица 5. Результаты тестирования стабильности. A: Стабильность такролимуса на сухих пятен крови при комнатной температуре в течение 7 дней, В: Стабильность такролимуса на сухих пятен крови в холодильнике (+4 ° С) в течение 7 дней, C: Стабильность такролимуса на сухих пятен крови при -20 ° С в течение 1 месяца, D: Стабильность такролимуса на сухих пятен крови при -80 ° С в течение 1 месяца, Е: Стабильность такролимуса на сухих пятен крови в течение трех циклов замораживания-оттаивания (-20 ° С), F : Выдержки образец стабильности / AutoSampler при +4 ° С в течение 72 ч. Данные представлены в виде% от номинальной концентрации. Образцы, перечисленные в качестве "не удалось" образцы, которые были потеряны на ошибки лаборатории / прибора. В большинстве случаев никаких пиков не было обнаружено вообще, либо внутренний стандарт пик отсутствует.
Рисунок 1. Структура Циклоспорин. Нумерации Atom следующим Международный союз теоретической и прикладной химии (ИЮПАК) номенклатура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Подключение переключающего клапана.424fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представительства Ion Хроматограммы. (A) представитель ионная хроматограмма пустой образцов крови наносили на фильтровальную бумагу (подробнее производителя, пожалуйста, см список материалов) и сушат. Стрелка отмечает время удерживания пика такролимус, (B) представитель ионная хроматограмма пустой пробы крови шипами на нижнем пределе квантификации (1 нг / мл) наносили на фильтровальную бумагу и сушат, и (С) представитель ионная хроматограмма образца собранной трансплантата пациента на фильтровальную бумагу. Это образец корыта и измеренная концентрация такролимуса 2,1 нанограммов / мл. Этот образец собирали пациента на дому и от клинических испытаний, который был утвержден Университета Цинциннати Institutional Review Board (Цинциннати, Огайо). Все пациенты дали соответствующее письменное согласие. Ion хроматограммы оригинальные распечатки, как порождается массового программного обеспечения спектрометрии (подробнее производителя, пожалуйста, см список материалов). Синие и красные линии в ионных хроматограмм представляют внутренний стандарт D 2, 13 C-такролимус и циклоспорин, соответственно. Пик элюирование в передней части главного такролимуса и внутренних нормативных пиков являются ротамеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Представитель калибровочной кривой. Оригинальный принт-так, как генерируется массового программного обеспечения спектрометрии показано.424 / 52424fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Представитель ионная хроматограмма, измеренных в ходе пост-Column инфузии такролимуса и инъекций извлеченного образца Бланк крови для оценки потенциального эффекта Matrix (Ион Подавление / Ион совершенствование). Стрелка знаменует время удерживания пика такролимуса. Матрица проверки эффект основан на методике, описанной в 46. Нет актуальны матрица Эффект был обнаружен. Пожалуйста, не нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя, как указано выше, концепция терапевтического препарата и приверженности мониторинга такролимуса на основе сухих пятен крови является привлекательным, есть аналитические проблемы, которые выходят за рамки тех, как правило, связаны с анализом ЖХ-МС / МС такролимуса в венозной ЭДТА образцов цельной крови. Они включают, но не ограничиваются ими, с тем, что матрица выполнена капиллярная цельной крови впиталась в хлопковый пух материала фильтрующего материала карты, используемой здесь и низкого объема крови (20 мкл). Тем не менее, анализ высокой пропускной в центральной лаборатории требует быстрой и надежной метод извлечения, что приводит в образцах, которые не имеют матричных помех и матричные эффекты в сочетании с надежной, специфической и высокочувствительного ЖХ-МС / МС анализа. Надежность анализа имеет решающее значение, как там, как правило, не достаточно материала на уже пробил фильтр карта оставили для повторного анализа в случае извлечения / ЖХ-МС / МС анализ не удается.
ФИфильтрующие карты, используемые в настоящем исследовании (подробнее производителя, пожалуйста, см список материалов) были выбраны в качестве них являются FDA одобрил класс II устройства, находятся в соответствии с NCCLS наведения LA4-A5 44 и имеют маркировку СЕ в Европе. Если полностью заполнена, один круг на фильтре карты Ватман 903 имеет ≈50 мкл крови 46. Тем не менее, размер капель крови, собранных отдельных пациентов различаются и обучение в правильной технике отбора проб имеет важное значение 46.
Первым важным шагом извлечения перфорированной отъезде сушеные пятна крови образец гомогенизации. Основываясь на нашем опыте, использование пули блендер является более эффективным и лучше, чем другие воспроизводимые методы, используемые для повышения эффективности экстракции, например ультразвуком. Использование пули блендер имеет важное значение для достижения последовательно извлечения извлечения выше 90%. Для надежности процедуры экстракции, важно также обеспечить, чтобы все были TEMPERAT центрифугиЮр контролируется (4 ° С) и что шаг вортексе был не короче 10 мин, что привело к более переменных и нижней извлечения экстракции. Кроме того, важно, чтобы отношение метанол / ZnSO 4 не изменяется, как восстановление такролимус очень чувствительна к правильному состава осаждения белка раствора.
Следующая задача заключается в получении чистой экстракт идеально лишенный материалов, которые могут вызвать помехи матричные и эффекты. Таким образом, простой один шаг осаждение белка шаг, так как часто используется для извлечения такролимуса из образцов крови с ЭДТА не считался жизнеспособным вариантом. После осаждения белка с использованием ZnSO 4 (в том числе добавлением внутреннего стандарта меченого изотопом), встряхивая и центрифугирования, супернатанты впрыскивали в системе 2D ВЭЖХ и на колонку онлайн экстракции. Извлечение Интернет колонки высокая скорость потока 5 мл / мин на обычных патронов предварительно столбцов с помощью простой 6-портпереключающий клапан для анализа такролимуса были описаны ранее 47. В качестве подвижной фазы был выбран таким образом, чтобы циклоспорин и его внутренний стандарт сосредоточены в передней части экстракционной колонны и не мигрируют через колонку в течение стадии очистки. Лайн экстракции используется в настоящем протоколе было несколько преимуществ, включая инъекции относительно больших объемах выборки без отрицательного влияния на анализ ВЭЖХ. Задняя заподлицо после обогащения аналитов в верхней части экстракционной колонны ("пик фокусировки") привело к более острых пиков позволяет более надежной интеграции по алгоритму программного обеспечения, особенно для образцов с низкой концентрацией такролимуса. 48 Интернет-шага очистки не только удалить потенциально препятствуя матричные соединения, но и де-соленая образца. Одним из важных, но редко обсуждается проблема для большого объема, высокой пропускной ЖХ-МС / МС анализов является постепенная потеря чувствительности системы ЖХ-МС / МС за счет увеличениязагрязнение электрораспылительной источника во время анализа больших партий. Не наблюдалось существенных эффектов матрица (ионный повышения подавление / ион). Отрицательное влияние потенциальных матричных эффектов были снижены / избежать комбинации следующих: эффективное осаждения белка с использованием метанола / ZnSO 4, центрифугирования после осаждения белка в 16000 мкг, высокого потока онлайн добычи, четкого разделения хроматографического такролимуса от потенциальных помех рано элюирующих от аналитической колонке и использованием меченого изотопом такролимуса в качестве внутреннего стандарта вместо структурно родственных внутренних стандартов, таких как аскомицина.
Нижний предел количественного было 1 нг / мл, и, таким образом ниже, чем у большинства иммунологических анализов, которые в настоящее часто используется для терапевтического мониторинга лекарственных препаратов такролимуса в образцах крови ЭДТА. Это нижний предел количественного достаточно даже для так называемых ингибиторов кальциневрина с низким долгосрочных immunosuppresSive протоколы технического обслуживания.
По сравнению с ранее описанными ЖХ-МС / МС анализов количественного такролимус в высушенных крови видит 29-34,36,39,41,42, настоящие анализа матчей или превышает их производительность с точки зрения нижнего предела количественного определения, восстановление добычи, точности и точность, избегая потенциально опасных такие понятия, как один шаг процедур осадков белок и ультра-короткие сроки хроматографии, которые обычно дают приемлемые результаты в ходе проверки на основании образцов крови от здоровых лиц. Тем не менее, пациенты после трансплантации являются весьма сложной группы пациентов, которые имеют заболевания, которые влияют на состав крови и которые принимают несколько препаратов. Это делает практически невозможным, чтобы исключить все возможные помехи, которые могут присутствовать в отдельных пациентов во время проверки и только жизнеспособная стратегия заключается в создании анализа таким образом, что она сводит к минимуму риск таких потенциальных помех. Сушеные SPO кровиTS имеют проблемы, такие как эффект гематокрита на вязкости крови и, таким образом, диффузионные свойства крови, нанесенного на фильтровальную бумагу 49. Это не был испытан, как здесь такие эффекты уже описаны, не влияют анализ циклоспорин в сухой капли крови на гематокрита и концентрации такролимуса в пределах клинически разумных пределах 29,32. Кроме устойчивость такролимуса в сухой капли крови при повышенных температурах уже были изучены другие, и такролимуса в сухой капли крови было установлено, что стабильность в течение 5 дней при 37 ° С и даже 60 ° С 32, что очень важно для отгрузки высохшей крови пятна в условиях, не контролируемой температуре, особенно в летнее время.
Этот анализ основан на сочетании пули блендера гомогенизации, онлайн колонки высокого потока очистки и анализа ЖХ-МС / МС может обеспечить стратегию платформы для развития биоаналитических анализов для определения количества других IMMunosuppressants, в одиночку или одновременные, а также других препаратов в сухих точечных проб крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 | |
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V | |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q | |
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Isopropanol 99.9%, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Methanol Optima LC/MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Water Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μl pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μl pipet tips with filter | Multimax | 2938T | |
| 200 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μl inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 | |
| Glass v ials, 4 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Glass vials, 20 ml | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Needle, 18 G 1.5 | Precision Glide | 305196 | |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 | |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 | |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| Tandem Mass Spectrometer | |||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 | |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
References
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
- Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
- Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
- A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
- Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
- Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
- Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
- Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
- Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
- Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
- Annual Data Report. , Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
- Draft Guidance on Tacrolimus. , Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
- Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
- Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb , 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
- Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
- Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
- Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
- Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
- Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
- Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
- Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
- Kelly, D. A.
- Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
- Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
- Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
- Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
- Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
- Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
- Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
- Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
- Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
- Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
- Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
- Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
- Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
- Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
- Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
- Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
- Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
- Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
- Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
- Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. , Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
- Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
- Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
- Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
- Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).
