Abstract
Den kalcineurinhämmare takrolimus är en hörnsten i de flesta immunosuppressiva behandlingsprotokoll efter organtransplantation i USA. Takrolimus är ett smalt terapeutiskt index läkemedel och som sådan kräver terapeutisk övervakning läkemedel och dosjustering baserad på hela sin blod dalvärden. För att underlätta hem terapeutiskt läkemedel och följsamhet övervakning, är den samling av torkade blodfläckar ett attraktivt koncept. Efter ett finger pinne, patienten samlar en bloddroppe på filterpapper hemma. Efter blodet torkas, det skickas till analyslaboratoriet där takrolimus kvantifieras med hjälp av HPLC-tandem masspektrometri (HPLC-MS / MS) i kombination med en enkel manuell proteinutfällning steg och online kolumn utvinning.
För takrolimus analys, är en 6-mm-skiva stansas från mättade mitten av blodfläcken. Blodfläcken homogeniseras med hjälp av en kula mixer ennd sedan proteiner fälls ut med metanol / 0,2 M ZnSO 4 med den interna standarden D 2, 13 C-takrolimus. Efter virvling och centrifugering 100 fil supernatant injiceras i en online-extraktionskolonn och tvättades med 5 ml / min av 0,1 myrsyra / acetonitril (7: 3, volym: volym) under 1 minut. Härefter är omkopplingsventilen aktiveras och analyter backspolas på den analytiska kolonnen (och separerades med användning av en 0,1% myrsyra / acetonitril-gradient). Takrolimus kvantifieras i den positiva multireaktionssätt (MRM) med en tandem masspektrometer.
Analysen är linjär från 1 till 50 ng / ml. Inter-assay variation (3,6% -6,1%) och noggrannhet (91,7% -101,6%) som utvärderas under 20 dagar uppfyller acceptanskriterier. Genomsnittlig extraktion återhämtning är 95,5%. Det finns ingen relevant carry-over, matris störningar och matriseffekter. Takrolimus är stabilt i torkade blodfläckar vid RT och vid 4 ° C under en vecka. Extraherade prover iautosampler är stabila vid 4 ° C under minst 72 timmar.
Introduction
Takrolimus är en potent immonosuppressant 1-7 som har en makrolidstruktur 8 (Figur 1). På grund av cis - trans isomerism av KN obligationer bildar två rotamerer i lösning 9 som kan separeras genom omvänd fas HPLC (HPLC) Takrolimus är lipofil och löslig i alkoholer (metanol: 653 g / L, etanol: 355 g / L), halogenerade kolväten (kloroform: 573 g / liter) och eter. Det är svårlösligt i alifatiska kolväten (hexan: 0,1 g / L och vatten (pH 3. 0,0047 g / L) 9 Molekylen innehåller inte någon kromofor och dess högsta UV-absorption är 192 nm Takrolimus verkar via hämning av kalcineurin. . Dess verkningsmekanism har granskats i referenserna 10,11. Det används idag i mer än 80% av transplanterade patienter fast organ i USA 12.
Det terapeutiska indexet för takrolimus är considered att vara smal 13. Dessutom är korrelationen mellan takrolimusdoser och blodkoncentrationer fattiga och farmakokinetik är variabel 14,15. Terapeutisk läkemedelsövervakning för att vägleda takrolimus dosering vid transplanterade patienter är därför generell klinisk praxis 16-20. Målet är att hålla koncentrationen takrolimus blodet inom ett fördefinierat terapeutiska intervallet. Koncentrationer takrolimus blod ligger under det terapeutiska intervallet kan resultera i ökad aktivitet av kroniska eller akuta alloimmunreaktioner, medan koncentrationer över det terapeutiska fönstret ökar risken för över immunosuppression, cancer och toxicitet, såsom nefrotoxicitet, neuro högt blodtryck och diabetes. Hög farmakokinetiska intraindividuella variationen av takrolimus kan vara skadlig för både transplantationsorgan och patientöverlevnad 21,22. Medan interindividuella variabiliteten för farmakokinetik takrolimus orsakas främst av CYP3A5 polymorfism, skälen till intraindividuellavariationer inkluderar, men är inte begränsade till, läkemedels, sjukdoms läkemedel och mat-läkemedelsinteraktioner 14,15. Saknar också för anslutning till immunsuppressiva terapeutisk läkemedelsbehandling är en bidragande faktor och en viktig orsak till transplantatförlust 23,24.
Dessa överväganden antyder att täta hem terapeutiskt läkemedel och följsamhet övervakning av takrolimus i helblod kan vara fördelaktigt att se till att patienter har takrolimusexponering inom det önskade terapeutiska fönstret vid alla tidpunkter. Men logistik och kostnader för mer frekvent terapeutisk läkemedelsövervakning som är aktuell klinisk praxis 15 är oöverkomliga. En av anledningarna är att patienten måste visa en Phlebotomist att ha det venösa provet krävs blod dras. Torkade blodfläckar har nyligen dykt upp som ett attraktivt koncept 25-28. Efter en enkel finger stick patienten samlar en bloddroppe på ett speciellt filter papper kort och efter blodfläcken har dRied, kan det skickas till en central laboratorium för analys av takrolimus och annan immunsuppressiv att patienten för närvarande kan ta. Detta har blivit möjligt tack vare utvecklingen av mycket känsliga och specifika LC-MS / MS-analyser för kvantifiering av takrolimus och andra immunosuppressiva läkemedel i mycket små blodvolymer såsom torkade blodfläckar (typiskt 20 | il blod) 25,29-43. En annan fördel är att minimalt invasiva, låg insamlingsstrategier volym prov såsom torkade blodfläckar i hög grad underlätta terapeutisk övervakning läkemedel och farmakokinetiska studier på små barn 28.
Takrolimus brukar mätas i venöst EDTA helblod 15. Skälen är att takrolimus distribuerar utsträckning i blodceller och att kliniska studier har rapporterat bättre korrelation mellan takrolimus dalkoncentrationerna i blod än i plasma med kliniska händelser 15,18. I jämförelse, analys av TAcrolimus i torkade blodfläckar är baserad på kapillärblod som blandas med filterpappersmatris. Detta innebär utmaningar när det gäller upplösning av takrolimus och potentiella störningar med LC-MS / MS-analys. Här presenterar vi en etablerad och validerad metod baserad på homogenisering av torkat blod plats med hjälp av en kula mixer i kombination med en högt flöde på nätet kolumn prov städa upp förfarandet och LC-MS / MS-analys. Från och med idag, har denna analys framgångsrikt använts för kvantifiering av mer än fem tusen takrolimus torkat blod stickprover för efterlevnad övervakning i kliniska prövningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De identifierade blodprover från friska individer var från University of Colorado Hospital (Aurora, Colorado). Användningen av de identifierade blodbanksprover för valideringsstudier samt för framställning av kalibratorer och kvalitetskontrollprover ansågs "befriade" av Colorado Multi-institutionella Review Board (COMIRB, Aurora, Colorado).
1. Beredning av referenser och lösningar
- Inköps takrolimus och den interna standarden D 2, 13 C-takrolimus från leverantörer som anges i materiallistan.
- Bered förrådslösningar i ren metanol vid en koncentration av 1 mg / ml för takrolimus och en koncentration av 10 | ag / ml för D 2, 13 C-takrolimus. Gör stamlösningar av referensmaterial som bygger på tre oberoende viktning. Alikvot stamlösningar och förvara vid -70 ° C eller lägre.
- Bered lösningen för att fälla ut proteineroch extrahera takrolimus med användning av metanol / 0,2 M ZnSO 4 i vatten (7: 3, volym: volym). Denna lösning innehåller också den interna standarden D 2, 13 C-takrolimus vid en koncentration av 2,5 ng / ml och används för utvinning av alla prover utom för utvinning av blankprover (se 1.3.3).
- Bered denna proteinutfällning lösning nyligen på varje extraktion dag och ställa utgången av lösningen vid 12 timmar.
- Beredning av kalibreringskurvan och kvalitetskontroll (QC) prover
- Bered stamlösningar av takrolimus genom att utföra lämpliga utspädningar av stamlösningen med användning av ren metanol.
- För att framställa kalibrerings- och kontrollprover kvalitets, Spike 20 pl lämpligt utspätt förrådslösning i EDTA helblod, inkubera vid 37 ° C under försiktig skakning i ett vattenbad för att möjliggöra homogen fördelning av takrolimus i de cellulära blodkomponenter för 20 minuter och delprov i 1,5 ml polypropylene rör med konisk botten och snap-on lock. Se till att den relativa volymen av organiskt lösningsmedel inte överstiger 5%.
- Spot 50 il av spetsade helblod in i mitten av varje cirkel på filterkort med hjälp av en pipett.
- Torka blod fläckar på filterkorten vid RT i 3 h.
- Förbered takrolimus kalibreringsstandarder i humant EDTA-helblod vid takrolimus koncentrationer av 1, 2,5, 5, 10, 25, och 50 ng / ml. Bered en blankprov för extraktion som kalibreringsstandarder med proteinutfällning lösningen med den interna standarden D 2, 13 C-takrolimus ("noll prov").
- Förbered QC prover i humant EDTA-helblod vid koncentrationer av 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Bered en blindprov. I motsats till de QC prover som extraheras med utfällning med den interna standarden D 2, 13 C-takrolimus, extrahera denna blankprov med proteinfällningslösningen som görinte innehåller den interna standarden D 2, 13 C-takrolimus ("blankprov").
- Insamling av kliniska prover
- Samla torkade blodfläckar som beskrivs i 43,44.
2. Utvinning av takrolimus torkat blod Spot Prover
- Inspektera torkat blod platsen för att säkerställa acceptabel prov kvalitet och volym 45.
- Central stans av blodfläcken på filterkort med en 6-mm hålslag.
Obs: Kvaliteten på stansar kan övervakas genom vägning. En stansad mättad filterskiva väger i genomsnitt 5,02 mg ± 0,09 mg (intervall: 4.83- 5.14 mg, n = 12). - Placera skivor i 1,5 ml polypropylenrör med konisk botten och snäpplock.
- Lägg 20-30 kulor till varje rör.
- Tillsätt 500 l av proteinutfällning lösning (metanol: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, volym: volym med 2,5 ng / ml intern standard) i varje rör. För extrverkan av blankprover, använd proteinutfällning lösning utan den interna standarden.
- Homogeni skivorna i kulan mixer under 1 minut (maximal hastighet, inställning "10").
- Skaka prover vid RT på flera rör virvel (maximal hastighet, inställning "10") under 10 minuter.
- Centrifugera proverna vid 16 tusen xg och 4 ° C under 10 min.
- Överför supernatanterna i glasflaskor HPLC utrustad med en 300 ul insats. Använd spårade teflon tätningar.
Note: Extraherade prover kan förvaras vid -20 ° C eller lägre tills LC-MS / MS-analys.
3. LC-MS / MS-analys
- Belastning 100 | il av supernatanten från det extraherade provet har laddats in i C8 patron extraktionskolonnen och tvätta med en 7: 3-förhållande av 0,1% myrsyra i vatten: acetonitril vid ett flöde av 5 ml / min under 1 min. Anslutningarna hos omkopplingsventilen är visade i fig 2 och gradienten körs av extraktionen pumpen i tabell 1
- Härefter aktivera omkopplingsventilen resulterar i återflödes av analyterna från förkolonnen på den analytiska kolonnen.
- Ställ in kolonntermostat till 65 ° C.
- Eluera analyt från den analytiska kolonnen med användning av de flödeshastigheter och lutning som visas i tabell 1.
- Anslut den analytiska kolonnen till en tandemmasspektrometer via turbo elektrosprayjonisering källa. Justera de viktigaste parametrarna för masspektrometern enligt tabell 2.
- Identifiera positiva joner ([M + Na] +) i multipla reaktionssätt (MRM). Använd följande ion övergångar för kvantifiering: takrolimus: m / z (massa / laddning) = 826,6 → 616,2 och D2, 13 C-takrolimus: m / z = 829,6 → 619,2.
Obs: Den totala körtiden är 4,6 minuter.
4. Kvantifiering
- För varje körning, generera en kalibreringskurva baserad på kalibratorerna framställda i 1.3.5 ochingå i varje analysomgång.
- Skapa en kalibreringskurva genom att markera nominella koncentrationer versus responsfaktorn för analyt (Peak Area [analyt] / Peak Area [intern standard]) med hjälp av masspektrometer programvaran.
- Montera kalibratorer med hjälp av en kvadratisk passning i kombination med 1 / X viktning.
- Kvantitet takrolimus i de torkade blodfläckarna integrera takrolimus och interna standarden i de extraherade MRM kromatogrammen. Beräkna responsfaktorn för takrolimus (Peak Area [analyt] / Peak Area [intern standard]) och jämföra med kalibreringskurvan med massan programvara spektrometri.
5. Valideringsförfaranden
- Lägre detektionsgränsen (LLOD) och undre gräns för kvantifiering (LLOQ).
- Tänk på lägsta takrolimuskoncentrationen med ett förhållande topp-till-brus av 4: 1 som den nedre detektionsgränsen (LLOD). Definiera den nedre gränsen för kvantifiering (LLOQ) somlägsta koncentrationen av kalibreringskurvan med en noggrannhet som är lika med eller bättre än ± 20% avvikelse från den nominella koncentrationen och precision som är lika med eller bättre än 20% (variationskoefficient).
- Inom och mellan dag noggrannhet och preciseringar.
- Testa noggrannhet och precision vid fyra koncentrationsnivåer av 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) och 40 ng / ml (QC4).
- Förbered QC prover på varje validering dag i humant EDTA-helblod, torra på filterkorten, extrahera och analysera, såsom beskrivits ovan.
- Bestäm intradaglig noggrannhet och precision med 6 prover per QC koncentrationsnivå.
- Bedöma mellan dag noggrannhet och precision över 20 dagar. Mät varje QC nivå med 4 prover varje dag.
- Analysera två kalibreringskurvor tillsammans med QC prover på varje dag.
- Beräkna intra-day noggrannhet som% av den nominella koncentrationen (sex prover per koncentrationsnivå, se 5.2.2). Beräknulate precision som variationskoefficient (CV%).
- Överväga intradaglig noggrannhet acceptabelt om det faller i acceptans begränsar 85% till 115% av den nominella koncentrationen. Överväga intradaglig precision acceptabelt om det är lika med eller bättre än ett CV (variationskoefficient) på 15%.
- Beräkna mellan dag noggrannhet och precision som medelvärdet för varje QC koncentrationsnivå analyseras under 20 validerings dagar.
- Överväga medelvärdet mellan dag noggrannhet acceptabelt om det faller i acceptans begränsar 85% till 115% av den nominella koncentrationen. Överväga mellan dag precision acceptabelt om det är lika med eller bättre än ett CV (variationskoefficient) på 15%.
- Uteslutning av matris störningar.
- För att utesluta störningar som kan orsakas av matrissignaler, analysera tomma torkade blodfläckar (8 olika individer, företrädesvis 4 män och 4 kvinnor).
- Inspektera visuellt jonkromatogram. Om toppar inom retentionstidenfönster takrolimus upptäcks, integrera och jämföra deras områden under kurvan med de takrolimus toppar i blankprover spetsade med takrolimus på LLOQ. Området av topparna i de tomma proven ska inte överstiga 15% av de av takrolimus på LLOQ.
- Ion suppression / jon förbättring.
- Använd en post-kolonn infusionsprotokoll som beskrivits 45 för att bedöma risken för störningar av jon undertryckande / jon förbättring orsakas av samtidig eluering matriskomponenter.
- Infundera takrolimus vid en koncentration av 10 | j, g / ml upplöst i 0,1% myrsyra: metanol (30:70, volym / volym) efter-kolonnen med en hastighet av 10 ul / min.
- Anslut en sprutpump via T-stycke mellan den analytiska kolonnen och elektroskällan masspektrometern.
- Övervaka MS / MS-signalintensiteten hos MRM övergångar för takrolimus och dess inre standard (m / z = 826,6 → 616,2 och m / z = 829,6 → 619,2) efter injektion av extracted blankprover (n = 8 prov från olika individer).
Obs: I avsaknad av jon undertryckande / jon förbättring av kontinuerlig signal som orsakas av infusion av analyt inte bör påverkas genom injektion av ämnet matris, medan jon undertryckande orsakar ett dopp av signalen och jon förbättring en topp.
- Carry-over.
- Bedöma potentiella överföring genom att analysera extraherade blankprov efter de högsta kalibratorer (50 ng / ml, n = 6).
- Inspektera visuellt jonkromatogram. Om toppar inom uppehållstid fönster takrolimus upptäcks, integrera och jämföra deras områden under kurvan med de takrolimus toppar i blankprover spetsade med takrolimus på LLOQ. Området av topparna i de tomma proven ska inte överstiga 15% av de av takrolimus på LLOQ.
- Extraction återvinningar.
- Bestäm återvinningar genom att jämföra signalerna från analyterna efter extraktion av QC Sampel på alla fyra koncentrationsnivåer (n = 6 per koncentration) med de blanka torkade blodfläckar spetsade med motsvarande belopp av takrolimus efter utvinningen.
- Förbered fyra uppsättningar QC (koncentrationsnivåer: 2, 4, 20, 40 ng / ml).
- Förbered ytterligare 4 uppsättningar av motsvarande "återhämtning testprov" genom observation 50 il blank EDTA helblod på filterpapperskort och torkning under 2 timmar.
- Härefter, både för QC och tomma "återhämtning testprov", klipp ut hela blodfläcken på filterkortet med sax och placera de resulterande skivor i ett polypropenrör med konisk botten och snap-on lock.
- Extrahera alla prover.
- Överför supernatanterna (400 pl) i glas HPLC flaskor.
- Lägg takrolimus stamlösning till de tomma "extraherade återställningstestprov" för att nå koncentrationer av 2, 4, 20 och 40 ng / ml (4 | il av 200, 400, 2000, 4000 ng / ml takrolimus lager solutions till 400 | il av supernatanten).
- Efter LC-MS / MS-analys, jämföra signaler i båda QC prover och "återhämtning testprov" av motsvarande koncentration (återvinning% = signalsamplena spetsade före extraktion / signalsamplena spetsade efter extraktion x 100).
- Utspädning integritet.
- Upprätta utspädnings integritet med användning av prover spetsade med analyterna vid 500, 250 och 100 ng / ml.
- Efter extraktion, späd prover med proteinutfällning lösning (1:10, n = 3 per koncentrationsnivå).
- Beräkna avvikelser från nominella koncentrationer. Överväg resultat som faller inom 85% -115% av nominell acceptabelt.
- Stabiliteter.
- Undersök stabiliteten med hjälp av QC prover vid alla fyra koncentrationsnivåer (n = 4 per koncentration) analyserades vid olika tidpunkter och under olika lagringsförhållanden.
- Jämför resultat efter lagring med de nominella värdena. Betrakta resultat som faller inom 85% -115% av nominell acceptabelt.
- Upprätta prov stabilitet under en vecka vid omgivningstemperatur, en vecka vid 4 ° C, 1 månad vid -20 ° C och en månad vid -80 ° C.
- Testfrysnings-upptiningsstabilitet över tre cykler (-20 ° C). Test extraherade provet och autosampler stabilitet genom att placera prover i termostaterad autosampler justerades till 4 ° C. Injicera prover efter 72 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa jonkromatogram av ett blankprov, ett prov spiked vid den nedre gränsen för kvantifiering och ett patientprov visas i figur 3.
Kalibreringskurvor
Den lägre detektionsgränsen var 0,5 ng / ml och den undre gränsen för kvantifiering var 1,0 ng / ml. Femtio ng / ml valdes som den högsta kalibrator som högre koncentrationer är osannolikt att nås på kliniken under normala omständigheter.
Kalibreringskurvor nyberedda på varje validering dag i humant EDTA-helblod, torkades på filterkorten och extraherades med metanol / 0,2 M ZnSO 4 (70:30 vol / vol) + intern standard (slutlig koncentration av inre standard: 2,5 ng / ml ). För dag 1 validering (n = 6 för kalibratorer och n = 6 för QC nivå) och för dagar 2 - 20 (n = 2 för kalibratorer och n = 4 för varje QC nivå) analyserades med koncentrationer 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 ng / ml för calibrators. En typisk kalibreringskurva visas i figur 4. Mean noggrannhet 85% till 115% av den nominella, inom arbetsområdet för 2/3 av kalibratorerna (med ett minimum av 6 icke-noll kalibratorer) ansågs acceptabla. Medelkoefficienten för korrelation var (R) = 0,999 (n = 40 kalibreringskurvor).
Noggrannhet och Precisions
Resultaten visas i detalj i tabell 3.
Extraktion Återhämtning
Genomsnittliga utvinning återvinningar var 98,2% (2 ng / ml), 92,2 (4 ng / ml), 95,5 (20 ng / ml), 96,2 (40 ng / ml).
Matrix Störningar, Ion bekämpande / Ion Enhancement Testing Bilds Post-kolumn Infusion och Överföring
Analys av blankprov från åtta olika individer (n = 4 kvinnliga och n = 4 manliga) visade signaler mindre än 15% av LLOQ (1 ng / ml) vid uppehållstiden som motsvarartakrolimus topp indikerar att den detekterade takrolimus topp kan anses vara specifik. Ett representativt exempel visas i figur 3. Potentiella störningar från jon undertryckande / jon förstärkning testades med tomma torkade blodprover från åtta olika friska individer. Ett representativt experiment visas i Figur 5. Inga tecken på betydande jon undertryckande / jon förbättring observerades. Ingen relevant överföring resulterar i toppar över 15% av signalen vid LLOQ upptäcktes.
Utspädning Integritet
Späd integritet undersöktes genom att analysera prover framställda vid koncentrationer över den högsta kalibrator (100, 250 och 500 ng / ml) och efter utspädning 1:10 i proteinutfällning lösningen efter extraktion för att nå målet koncentrationerna av: 10, 25, och 50 ng / ml. Mean noggrannhet måste falla inom kriterierna för 85% acceptans till 115% av de nominella koncentrationerna. Alla spädningar tested träffade acceptanskriterier (tabell 4).
Stabilitet
Stabilitet av takrolimus i torkade blodfläckar undersöktes genom att analysera QC prover på alla fyra nivåer (n = 4 / koncentrationsnivå), som förvarades under varierande förhållanden.
Mean noggrannhet måste falla inom kriterierna för 85% acceptans till 115% av de nominella koncentrationerna. Resultat visas i detalj i tabell 5. Inga förluster efter en veckas lagring vid RT, efter en veckas lagring vid 4 ° C, efter en månads lagring vid -20 ° C, efter en månads lagring vid -80 ° C, efter 3 frysa och upptiningscykler, och efter 72 timmar av extraherade prover i auto sampler vid 4 ° C var uppenbara.
| Extraktion Pump | Analytisk (Eluering) Pump | ||||||
| Vatten + 0,1% myrsyra | Acetonitril | Flödeshastighet [il / min] | Tid [min] | Vatten + 0,1% myrsyra | Acetonitril | Flödeshastighet [il / min] | |
| 0 | 70 | 30 | 5000 | 0 | 13 | 87 | 1000 |
| 1 | 70 | 30 | 5000 | 2 | 2 | 98 | 1200 |
| 1,1 | 2 | 98 | 100 | 3,5 | 2 | 98 | 1200 |
| 3 | 2 | 98 | 100 | 3,6 | 13 | 87 | 1000 |
| 3,1 | 20 | 80 | 2000 | 4,6 | 13 | 87 | 1000 |
| 4 | 70 | 30 | 5000 | ||||
| 4,6 | 70 | 30 | 5000 | ||||
Tabell 1. Gradient Program för Extraction och analytisk HPLC pumpar.
| Parameter | Inställning |
| Kollision gas (CAD) | 10 |
| Gardin gas (CUR) (psi) | 30 |
| Ion källgas 1 (GS1) (psi) | 50 |
| Ion källgas 2 (GS2) (psi) | 30 |
| Nebulisatorn Ström (NC) (V) | 1 |
| Temperatur (TEM) (° C) 600 | |
| Jonspray spänning (IS) (V) | 5500 |
| Interface värmare (IHE) | På |
| Declustering potential (DP) (V) | 136 |
| Ingång potential (EP) (V) | 10 |
| Kollisionsenergin (CE) (V) | 47 |
| Kollisionscell exit potential (CXP) (V) | 16 |
Tabell 2. Turbo Elektro gränssnitt och masspektrometer parametrar. Nomenklaturen motsvarar den som används i mass programvara spektrometri (för tillverkare information, vänligen se Materials List).
| Validering Dag | QC nivå [% av nominella koncentrationen] | |||
| 2 | 4 | 20 | 40 | |
| Dag 1 | 93,0 | 86,3 | 88,9 | 93,4 |
| 101 | 90,4 | 95,3 | 100 | |
| 85,6 | 95,9 | 99,0 | 97,5 | |
| 88,6 | 93,6 | 105 | 103 | |
| 85,0 | 97,4 | 97,2 | 109 | |
| 89,1 | 96,7 | 100 | 101 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 90,4 | 93,4 | 97,6 | 100,7 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 6,6 | 4,6 | 5,5 | 5,2 |
| Dag 2 | 92,8 | 86,0 | 103 | |
| 91,1 | 88,8 | 94,7 | 87,0 | |
| 88,6 | 90,9 | 92,8 | 94,2 | |
| 97,2 | 93,7 | 94,2 | 115 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 92,4 | 89,9 | 96,2 | 97,9 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 3,9 | 3,6 | 4,8 | 12,2 |
| Dag 3 | 97,6 | 101 | 98,4 | 112 |
| 104 | 85,6 | 102 | 110 | |
| 99,2 | 88,4 | 99,4 | 105 | |
| 96,3 | 87,2 | 108 | 117 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 99,3 | 90,6 102,0 | 111,0 | |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 3,4 | 7,8 | 4,2 | 4,5 |
| Dag 4 | 95,2 | 88,6 | 112 | 94,5 |
| 105 | 87,3 | 93,2 | 116 | |
| 99,8 | 96,2 | 103 | 103 | |
| 100 | 104 | 97,2 | 99,4 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 100,0 | 94,0 | 101,4 | 103,2 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 4,0 | 8,2 | 8,1 | 8,9 |
| Dag 5 | 106 | 90,4 | 101 | 106 |
| 108 | 89,0 | <td> 106100 | ||
| 102 | 101 | 96,6 | 128 | |
| 105 | 88,8 | 105 | 107 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 105,3 | 92,3 | 102,2 | 110,3 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 2,4 | 6,3 | 4,2 | 11,1 |
| Dag 6 | 90,9 | 93,7 | 119 | 106 |
| 98,8 | 88,1 | 96,4 | 110 | |
| 94,6 | 96,3 | 99,1 | 108 | |
| 108 | 100 | 102 | 102 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 98,1 | 94,5 | 104,1 | 106,5 |
| 7,5 | 5,3 | 9,8 | 3,2 | |
| Dag 7 | 85,1 | 87,5 | 99,5 | 95,4 |
| 86,4 | 85,4 | 94,7 | 101 | |
| 94,5 | 87,3 | 98,9 | 94,6 | |
| 85,5 | 97,0 | 101 | 99,6 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 87,9 | 89,3 | 98,5 | 97,7 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 5,1 | 5,8 | 2,7 | 3,2 |
| Dag 8 | 86,1 | 92,5 | 91,9 | 102 |
| 87,5 | 91,5 | 95,2 | 88,5 | |
| 115 | 85,6 | 92,1 | 102 | |
| 85,8 | 85,9 | 95,4 | 108 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 93,6 | 88,9 | 93,7 | 100,1 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 15,3 | 4,1 | 2,0 | 8,2 |
| Dag 9 | 88,9 | 91,4 | 96,9 | 100 |
| 90,0 | 89,8 | 95,0 | 100 | |
| 69,7 | 85,9 | 95,8 | 109 | |
| 91,9 | 87,0 | 105 | 101 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 85,1 | 88,5 | 98,2 | 102,5 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 12,2 | 2,9 | 4,7 | 4,3 |
| Dag 10 | 90,9 | 91,3 | 96,2 | 100 |
| 97,7 | 89,5 | 94,4 | 100 | |
| 99,9 | 109 | 98,7 | 96,8 | |
| 99,1 | 90,0 | 95,7 | 96,1 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 96,9 | 95,0 | 96,3 | 98,2 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 4,2 | 9,9 | 1,9 | 2,1 |
| Dag 11 | 92,7 | 91,9 | 88,2 | 104 |
| 96,6 | 91,2 | 97,0 | 110 | |
| 109,0 | 92,8 | 970,6 | 102 | |
| 98,3 | 107 | 93,7 | 111 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 99,2 | 95,7 | 94,1 | 106,8 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 7,0 | 7,9 | 4,6 | 4,1 |
| Dag 12 | 87,7 | 85,5 | 105 | 95,3 |
| 112 | 88,1 | 101 | 96,1 | |
| 102 | 89,1 | 89,7 | 97,5 | |
| 106 | 92,5 | 102 | 104 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 101,9 | 88,8 | 99,4 | 98,2 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 10,1 | 3,3 | 6.7 | 4,0 |
| Dag 13 | Misslyckades | 85,7 | 93,3 | 102 |
| 101 | 105 | 88,0 | 93,9 | |
| 112 | 98,0 | 91,4 | 102 | |
| 104 | 113 | 104 | 101 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 105,7 | 100,4 | 94,2 | 99,7 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 5,4 | 11,5 | 7,3 | 3,9 |
| Dag 14 | 91,5 | 89,1 | 97,4 | 93,1 |
| 90,4 | 87,1 | 93,9 | 99,8 | |
| 89,7 | 97,0 | 94,8 | 106 | |
| 97,4 | 86,8 | 89,9 | Misslyckades | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 92,3 | 90,0 | 94,0 | 99,6 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 3,8 | 5,3 | 3,3 | 6,5 |
| Dag 15 | 92,8 | 92,8 | 92,5 | 95,4 |
| 97,5 | 96,3 | 96,2 | 95,5 | |
| 95,5 | 108 | 97,3 | 99,3 | |
| 110 | 109 | 115 | 113 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 99,0 | 101,5 | 100,3 | 100,8 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 7,7 | 8,1 | 10,0 | 8,3 |
| Dag 16 | 93,7 | 97,8 | 90,7 | 112 |
| 90,3 | 87,1 | Misslyckades | 101 | |
| 97,9 | 88,3 | 95,5 | 107 | |
| 91,4 | 85,7 | 89,3 | 96,7 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 93,3 | 89,7 | 91,8 | 104,2 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 3,6 | 6,1 | 3,5 | 6,4 |
| Dag 17 | 88,0 | 86,0 | 93,7 | 103 |
| 89,8 | 90,8 | 94,8 | 93,2 | |
| 85,9 | 91,1 | 99,7 | 94,8 | |
| 86,7 | 88,1 | 95,6 | 91,7 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 87,6 | 89,0 | 96,0 | 95,7 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 1,9 | 2,7 | 2,7 | 5,3 |
| Dag 18 | 89,6 | 85,8 | 91,0 | 98,3 |
| 89,6 | 86,2 | 88,3 | 93,6 | |
| Misslyckades | 86,7 | 96,8 | 104 | |
| 88,1 | 85,8 | 95,2 | 111 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 89,1 | 86,1 | 92,8 | 101,7 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 1,0 | 0,5 | 4,2 | 7,4 |
| Dag 19 | 98,0 </ td> | 89,7 | 94,2 | 102 |
| 88,3 | 86,0 | 97,6 | 102 | |
| 91,6 | 88,1 | 95,8 | 97,5 | |
| 90,7 | 90,1 | 92,8 | 88,3 | |
| Intradagskredit Noggrannhet [%] | 92,2 | 88,5 | 95,1 | 97,5 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 4,5 | 2,1 | 2,2 | 6,6 |
| Dag 20 | 93,0 | 87,0 | 99,4 | 101 |
| 97,3 | 87,6 | 95,5 | 91,9 | |
| 89,0 | 88,4 | 91,2 | 93,5 | |
| 104 | 90,7 | 97,7 | 115 | |
| Intradagskredit Noggrannhet[%] | 95,8 | 88,4 | 96,0 | 100,4 |
| Intra-Day Imprecision [CV%] | 6,7 | 1,8 | 3,7 | 10,5 |
Inter-dagars Noggrannhet och Imprecision | ||||
| Inter-dagars Noggrannhet | 95,2 | 91,7 | 97,2 | 101,6 |
| Inter-Day Imprecision | 6,1 | 4,5 | 3,6 | 4,2 |
Tabell 3. Resultat av kvalitetskontroll Prov över 20 dagar. Data presenteras som% av nominell. Prover som anges som "misslyckades" är prover som förlorade till laboratorium / instrumentfel. I de flesta cases, fanns inga toppar detekterades alls eller inre standardtoppen saknades.
| Utspädning | 01:10 |
| Nominell målkoncentration efter utspädning | 50 ng / ml |
| 98,6 | |
| 94,5 | |
| 91,4 | |
| Noggrannhet [%] | 94,8 |
| Imprecision [CV%] | 3,6 |
| Utspädning | 01:10 |
| Nominell målkoncentration efter utspädning | 10 ng / ml |
| 103 | |
| 99,5 | |
| 101 | |
| Noggrannhet [%] | 101,2 |
| Imprecision [CV%] | 1,8 |
| Utspädning | 01:10 |
| Nominell målkoncentration efter utspädning | 25 ng / ml |
| 91,7 | |
| 98,2 | |
| 103 | |
| Noggrannhet [%] | 97,6 |
| Imprecision [CV%] | 5,7 |
Tabell 4. Resultat av Utspädning Integrity testning. Data presenteras som% av nominell.
| EN | ||||
| Stabilitet vid RT, Dag 1 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 91,9 | 85,8 | 86,0 | 102 | |
| 86,7 | 85,7 | 88,5 | 102 | |
| 86,0 | 85,9 | 90,1 | 103 | |
| 89,2 | 98,0 | 90,8 | 112 | |
| % Av nominell koncentration | 88,5 | 88,9 | 88,9 | 104,8 |
| Imprecision [% CV] | 2,7 | 6,1 | 2,1 | 4,9 |
| Stabilitet vid RT, Dag 3 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 88,6 | 105 | 101 | 113 | |
| 94,1 | 100 | 98,5 | 103 | |
| 100 | 101 | 106 | 109 | |
| 99,5 | 102 | 102 | 108 | |
| % Av nominell koncentration | 95,6 | 102,0 | 101,9 | 108,3 |
| Imprecision [% CV] | 5,3 | 2,2 | 3,1 | 4,1 |
| Stabilitet vid RT, Dag 7 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 105 | 103 | 91,7 | 109 | |
| 101 | 107 | 100 | 110 | |
| 102 | 108 | 107 | 105 | |
| 93,8 105 | 109 | 111 | ||
| % Av nominell koncentration | 100,5 | 105,8 | 101,9 | 108,8 |
| Imprecision [% CV] | 4,7 | 2,2 | 7,8 | 2,6 |
| B | ||||
| Stabilitet vid 4 ° C, Dag 1 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 101 | 89,9 | 95,8 | 100 | |
| 88,9 | 91,0 | 94,1 | 99,0 | |
| 96,2 | 100 | 102 | 96,7 | |
| 89,5 | 87,8 | 95,4 | 88,6 | |
| % Av nominell koncentration | 93,9 | 92,2 | 96,8 | 96,1 |
| Imprecision [% CV] | 5,8 | 5,4 | 3,5 | 5,2 |
| Stabilitet vid 4 ° C, Dag 3 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 85,2 | 105 | 95,3 | |
| Misslyckades | 87,8 | 101 | 96 | |
| 101 | 88,8 | 89,6 | 97,5 | |
| 106 | 92,2 | 102 | 104 | |
| % Av nominell koncentration | 98,1 | 88,5 | 99,4 | 98,2 |
| Imprecision [% CV] | 9,7 | 2,9 | 6,8 | 4,0 |
| Stabilitet vid 4 ° C, Dag 7 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 94,0 | 98,5 | 96,1 | 110 | |
| 92,9 | 96,4 | 109 | 109 | |
| 91,7 | 96,3 | 97,9 | 115 | |
| 94,7 | 96,9 | 99,8 | 113 | |
| % Av nominell koncentration | 93,3 | 97,0 | 100,7 | 111,8 |
| Imprecision[%CV] | 1,3 | 1,0 | 5,7 | 2,8 |
| C | ||||
| Stabilitet vid -20 ° C, Dag 3 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 98,7 | 111 | 111 | |
| 93,5 | 89,6 | 108 | 105 | |
| 89,5 | 91,5 | 107 | 112 | |
| 88,2 | 99,1 | 108 | 92,4 | |
| % Av nominell koncentration | 89,6 | 94,7 | 108,5 | 105,1 |
| Imprecision [% CV] | 2,7 | 4,9 | 1,7 | 9,0 |
| Stabilitet vid -20 ° C, Dag 7 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 98,7 | 102 | 109 | |
| 94,8 | 94,6 | 114 | 106 | |
| 95,5 | 102 | 98,1 | 108 | |
| 107 | 99,5 | 115 | 105 | |
| % Av nominell koncentration | 98,5 | 98,7 | 107,3 | 107 |
| Imprecision [% CV] | 5,7 | 3,1 | 8,5 | 1,8 |
| </ td> | ||||
| Stabilitet vid -20 ° C, Dag 30 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 82,3 | 83,1 | 90,4 | 93,2 | |
| 87,9 | 85,8 | 85,3 | 97,9 | |
| 85,7 | 88,6 | 98,3 | 98,0 | |
| 92,0 | 95,6 | 110 | 103 | |
| % Av nominell koncentration | 87,0 | 88,3 | 96,0 | 98,0 |
| Imprecision [% CV] | 4,1 | 5,4 | 10,8 | 4,0 |
| D </ td> | |||||||||
| Stabilitet vid -80 ° C, Dag 3 | |||||||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | |||||
| 87,5 | 96,5 | 96,7 | Misslyckades | ||||||
| Misslyckades | 97,6 | 98,7 | 110 | ||||||
| 88,8 | 96,4 | 106 | 109 | ||||||
| 87,3 | 101 | 96,5 | 109 | ||||||
| % Av nominell koncentration | 87,9 | 97,9 | 99,5 | 109,3 | |||||
| Imprecision [% CV] | 0,8 | 2,2 | 4,5 | 0,6 | |||||
| Stabilitet vid -80 ° C, Dag 7 | QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | ||||
| Misslyckades | 98,0 | 105 | 99,8 | ||||||
| 97,1 | 106 | 104 | 105 | ||||||
| 99,7 | 102 | 99,3 | 102 | ||||||
| 101 | 99,9 | 109 | 106 | ||||||
| % Av nominell koncentration | 99,3 | 101,5 | 104,3 | 103,2 | |||||
| Imprecision [% CV] | 2,0 | 3,4 | 4,0 | 2,8 | |||||
| Stabilitet vid -80 ° C, Dag 30 | |||||||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | | 20 | 40 | | |||||
| 88,2 | 85,3 | 89,6 | 96,7 | ||||||
| 96,2 | 92,6 | 85,8 | 94,1 | ||||||
| 83,9 | 93,7 | 91,0 | 105 | ||||||
| 95,6 | 94,0 | 98,9 | 102 | ||||||
| % Av nominell koncentration | 91,0 | 91,4 | 91,3 | 99,5 | |||||
| Imprecision [% CV] | 6,0 | 4,1 | 5,5 | 4,9 | |||||
| E | ||||
| Freeze tiningsstabilitet, -20 ° C, 1 cykel | ||||
| QC nivå [ng / ml] </ td> | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 92,5 | 86,2 | 90,2 | 94,3 | |
| 89,8 | 90,5 | 85,4 | 104 | |
| 94,7 | 88,6 | 93,4 | 104 | |
| 101 | 89,2 | 93,7 | 96,3 | |
| % Av nominell koncentration | 94,5 | 88,6 | 90,7 | 99,7 |
| Imprecision [% CV] | 4,8 | 1,8 | 3,9 | 5,1 |
| Frys tiningsstabilitet, -20 ° C, 2 cykler | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 99,1 | 97,6 | Misslyckades | 85,3 | |
| 93,1 | 88,1 | 93,4 | 92,0 | |
| 94,9 | 91,5 | 85,8 | 93,9 | |
| Misslyckades | 90,5 | 86,8 | 85,4 | |
| % Av nominell koncentration | 95,7 | 91,9 | 88,7 | 89,2 |
| Imprecision [% CV] | 3,1 | 4,0 | 4,1 | 4,5 |
| Frys tiningsstabilitet, -20 ° C, 3 cykler | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 95,7 | Misslyckades | 86,0 | 93,3 | |
| 95,5 | 87,4 | 85,0 | 91,3 | |
| 90,5 | 89,1 | 86,0 | 86,0 | |
| 96,9 | 85,7 | 90,2 | Misslyckades | |
| % Av nominell koncentration | 94,7 | 87,4 | 86,8 | 90,2 |
| Imprecision [% CV] | 2,8 | 1,7 | 2,3 | 3,8 |
| F | ||||
| Extraherade provet stabilitet vid 4 ° C, 24 h | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 122 | 112 | 91,0 | 104 | |
| 93,5 | 106 | 91,8 | 96,1 | |
| 111 | 94,8 | 98,2 | 93,5 | |
| 98,4 | 97,6 | 91,3 | 89,8 | |
| % Av nominell koncentration | 106,2 | 102,6 | 93,1 | 95,9 |
| Imprecision [% CV] | 12,8 | 7,9 | 3,4 | 6,0 |
| Extraherade provet stabilitet vid 4 ° C, 48 h | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 106 | 108 | 93,7 | 110 | |
| 105 | 98,1 | 94,6 | 98,9 | |
| 103 | 98,4 | 95,0 | 92,6 | |
| 108 | 93,1 | 89,7 | 85,5 | |
| % Av nominell koncentration | 105,5 | 99,4 | 93,3 | 96,8 |
| Imprecision [% CV] | 2,1 | 6,2 | 2,4 | 10,4 |
| Extraherade provet stabilitet vid 4 ° C, 72 h | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 112 | 96,4 | 104 | |
| 101 | 95,3 | 103 | 95,2 | |
| 94,2 | 105 | 93,5 | 99,5 | |
| 100 | 96,9 | 92,6 | 89,3 | |
| % Av nominell koncentration | 97,9 | 102,3 | 96,4 | 97,0 |
| Imprecision [% CV] | 3,1 | 7,7 | 4,7 | 6,3 |
Tabell 5. Resultat av stabilitetstest. A: Stabilitet av takrolimus på torkade blodfläckar vid RT under 7 dagar, B: Stabilitet av takrolimus på torkade blodfläckar i kylskåp (4 ° C) under 7 dagar, C: Stabilitet av takrolimus på torkade blodfläckar vid -20 ° C under en månad, D: Stabilitet av takrolimus på torkade blodfläckar vid -80 ° C under en månad, E: Stabilitet av takrolimus på torkade blodfläckar över tre frys-tiningscykler (-20 ° C), F : Extraherade prov / autosampler stabilitet vid 4 ° C under 72 h. Data presenteras som% av nominell koncentration. Prover som anges som "misslyckades" är prover som förlorade till laboratorium / instrumentfel. I de flesta fall inga toppar detekterades alls eller inre standardtoppen saknades.
Figur 1. Struktur av takrolimus. Atom numrering följer International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) nomenklatur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Anslutning av omkopplingsventilen.424fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa jonkromatogram. (A) representant jonkromatogrammet av en tom blodprov spotted på filterpapper (för tillverkare information, vänligen se Material List) och torkas. Pilen markerar retentionstiden för takrolimus topp, (B) Representativa jonkromatogrammet av en tom blodprover spetsade vid den nedre gränsen för kvantifiering (1 ng / ml) fläckades på filterpapper och torkades, och (C) Representant jonkromatogram av ett prov som tagits av en transplanterad patient på filterpapper. Detta är en trågprov och den uppmätta takrolimus koncentrationen var 2,1 ng / ml. Detta prov uppsamlades av patienten i hemmet och är från en klinisk prövning som var godkänd av University of Cincinnati Institutional Review Board (Cincinnati, OH). Alla patienter gav sitt lämpliga skriftligt medgivande. Jonkromatogram är original utskrifter som genereras av mass programvara spektrometri (för tillverkare information, vänligen se Materials List). Blå och röda linjer i jonkromatogram representerar den interna standarden D 2, 13 C-takrolimus och takrolimus, respektive. Elueringstoppen framför huvud takrolimus och interna standardtopparna är rotamerer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representant kalibreringskurva. Ett original utskrift som genereras av mass programvara spektrometri visas.424 / 52424fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa jonkromatogram Mätt under Post-kolumn Infusion av takrolimus och Injektion av en extraherad Blank blodprov för att bedöma en potentiell Matrix Effect (Ion bekämpande / Ion Enhancement). Pilen markerar retentionstiden för takrolimus topp. Matriseffekt tester baserades på det förfarande som beskrivs i 46. Ingen relevant matriseffekt upptäcktes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om, som tidigare nämnts, är begreppet terapeutiskt läkemedel och följsamhet övervakning av takrolimus baserat på torkade blodfläckar attraktiva, det finns analytiska utmaningar som går utöver dem som vanligtvis förknippas med LC-MS / MS-analys av takrolimus i venöst EDTA hela blodprov. Dessa innefattar, men är inte begränsade till, det faktum att matrisen är kapillärt helblod dränkts in i bomullsavfall materialet i filterkortmaterialet som används här och den låga volymen blod (20 ^ il). Trots hög genomströmning analys i ett centralt laboratorium kräver en snabb och tillförlitlig extraktionsmetod som resulterar i prover som saknar matris störningar och matriseffekter i kombination med en robust, specifik och mycket känslig LC-MS / MS-analysen. Tillförlitligheten analysen är viktigt eftersom det är oftast inte tillräckligt med material om den redan stansade filter kort kvar för återanalys vid utvinning / LC-MS / MS-analys misslyckas.
Det fiLTER kort som används i den aktuella studien (för tillverkare information, vänligen se Material List) valdes eftersom dessa är ett FDA-godkända klass II-enhet, är i överensstämmelse med NCCLS riktlinjer LA4-A5 44 och är CE-märkta i Europa. Om helt fylld, en cirkel på Whatman 903 filterkortet håller ≈50 il blod 46. Men storleken av bloddroppar som samlats in av enskilda patienter varierar och utbildning i rätt provtagningsteknik är viktigt 46.
Det första viktiga steget att extrahera en utstansad torkat blod plats provet är homogenisering. Baserat på vår erfarenhet, är användningen av en kula mixer effektivare och mer reproducerbar än andra metoder som används för att öka utvinning effektiviteten såsom sonikering. Användningen av kulan biandaren var nödvändigt för att uppnå genomgående utvinning återvinningar över 90%. För tillförlitligheten extraktionsproceduren, var det också viktigt att se till att alla centrifuger var tempure kontrollerad (4 ° C) och att virvel steget var inte kortare än 10 minuter, vilket resulterade i mer rörliga och lägre utvinningsåtervinningar. Dessutom är det viktigt att metanol / ZnSO 4-förhållande inte ändras som takrolimus återhämtning är mycket känslig för det korrekta sammansättningen av proteinfällningslösningen.
Nästa utmaning är att få en ren extrakt helst saknar material som kan orsaka matris störningar och effekter. Således var en enkel steg proteinutfällning steg som ofta används för utvinning av takrolimus från EDTA blodprov inte vara ett hållbart alternativ. Efter proteinutfällning med användning ZnSO 4 (inklusive tillsats av en isotopmärkt inre standard), vortexning och centrifugering, supematantema injiceras i en 2D HPLC-system och på en online extraktionskolonn. Online kolumn extraktion med höga flöden av 5 ml / min på konventionella förkolonn patroner med hjälp av en enkel 6-portomkopplingsventil för analys av takrolimus har beskrivits tidigare 47. Den mobila fasen valdes så att takrolimus och dess inre standard koncentrerades i den främre delen av extraktionskolonnen och inte migrera över kolonnen under rensningen steget. Online extraktion som används i det nuvarande protokollet hade flera fördelar, inklusive injektion av relativt stora provvolymer utan att negativt påverka HPLC-analys. Back-flush efter att berika analytema ovanpå extraktionskolonnen ("peak fokus") resulterade i skarpare toppar möjliggör mer tillförlitlig integration av programvaran algoritm speciellt för prover med låga takrolimuskoncentrationerna. 48 Online rensning steget inte bara ta bort potentiellt störande matrisföreningar, men även avsaltades provet. En ännu sällan diskuteras viktigt problem för hög volym, hög kapacitet LC-MS / MS-analyser är den gradvisa förlusten av känslighet för LC-MS / MS-system på grund av ökadförorening av elektroskällan under analys av stora satser. Inga signifikanta matriseffekter (jon undertryckande / jon förbättring) observerades. Den negativa effekten av potentiella matriseffekter minskade / undvikas genom en kombination av följande: effektiv proteinutfällning användning av metanol / ZnSO 4, centrifugering efter proteinutfällning vid 16.000 xg, högt flöde på nätet utvinning, tydlig kromatografisk separation av takrolimus från potentiella störningar tidigt eluerande från den analytiska kolonnen och användning av isotopmärkt takrolimus som intern standard i stället för strukturellt besläktade interna standarder såsom askomycin.
Den undre gränsen för kvantifiering var 1 ng / ml, och därmed lägre än för de flesta immun som för närvarande används ofta för terapeutisk läkemedelsmonitorering av takrolimus i EDTA-blodprov. Denna lägre kvantifieringsgräns är tillräcklig även för så kallad låg kalcineurin inhibitor långsiktiga immunosuppressiva underhållsprotokoll.
I jämförelse med tidigare beskrivna LC-MS / MS-analyser för att kvantifiera takrolimus i torkade blod fläckar 29-34,36,39,41,42, de nuvarande analys lika med eller överstiger deras resultat i form av lägre kvantifieringsgränsen, utvinning återhämtning, noggrannhet och precision samtidigt som man undviker potentiellt riskfyllda begrepp som ett steg proteinutfällning förfaranden och ultrakorta kromatografi tider, som vanligtvis ger acceptabla resultat under validerings bygger på blodprov från friska individer. Emellertid transplanterade patienter en mycket komplex grupp av patienter som har sjukdomar som påverkar sammansättningen av blod och som tar flera läkemedel. Detta gör det praktiskt taget omöjligt att utesluta alla potentiella störningar som kan förekomma hos enskilda patienter under validerings och enda hållbara strategin är att inrätta analysen på ett sådant sätt att det minskar risken för sådana potentiella störningar. Torkat blod spots har utmaningar som effekten av hematokrit på blod viskositet och därmed spridningsegenskaper blodet appliceras på filterpapper 49. Detta har inte testats här igen som sådana effekter har redan beskrivits inte påverka takrolimus analys i torkade blodfläckar på hematokriter och takrolimuskoncentrationerna inom kliniskt rimliga gränser 29,32. Även stabiliteten av takrolimus i torkade blodfläckar vid förhöjda temperaturer har redan studerats av övriga och takrolimus i torkade blodfläckarna befanns vara stabil under 5 dagar vid 37 ° C och till och med 60 ° C 32, vilket är viktigt för transport av torkat blod fläckar under inte temperaturkontrollerade förhållanden, särskilt under sommaren.
Denna analys baseras på en kombination av kula mixer homogenisering, kan högt flöde nätet kolonn sanering och LC-MS / MS-analys ger en plattform strategi för utveckling av bioanalytiska analyser för kvantifiering av andra immunosuppressants, ensamma eller samtidiga, liksom av andra läkemedel i torkade blodstickprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 | |
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V | |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q | |
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Isopropanol 99.9%, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Methanol Optima LC/MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Water Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μl pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μl pipet tips with filter | Multimax | 2938T | |
| 200 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μl inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 | |
| Glass v ials, 4 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Glass vials, 20 ml | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Needle, 18 G 1.5 | Precision Glide | 305196 | |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 | |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 | |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| Tandem Mass Spectrometer | |||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 | |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
References
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
- Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
- Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
- A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
- Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
- Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
- Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
- Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
- Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
- Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
- Annual Data Report. , Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
- Draft Guidance on Tacrolimus. , Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
- Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
- Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb , 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
- Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
- Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
- Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
- Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
- Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
- Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
- Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
- Kelly, D. A.
- Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
- Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
- Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
- Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
- Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
- Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
- Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
- Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
- Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
- Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
- Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
- Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
- Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
- Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
- Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
- Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
- Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
- Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
- Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
- Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. , Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
- Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
- Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
- Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
- Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).
