Abstract
칼시 뉴린 억제제 타 크롤리 무스는 미국에서 고체 장기 이식 후 대부분의 면역 치료 프로토콜의 초석이다. 타 크롤리 무스는 좁은 치료 지수 약물이며, 등은 치료 적 약물 모니터링 및 전체 혈액 통 농도를 기반으로 용량 조절이 필요합니다. 가정 치료 약물 및 준수 모니터링을 용이하게하기 위해, 건조 혈액 명소의 컬렉션은 매력적인 개념이다. 핑거 스틱 후, 환자는 집에서 필터 종이에 혈액 방울을 수집한다. 혈액이 건조 된 후에는 타크로리무스는 고성능 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법을 이용하여 정량화 분석 실험실로 송부 (HPLC-MS / MS) 간단한 수동 단백질 침전 단계 및 온라인 열 추출과 조합.
타 크롤리 무스 분석을 위해, 6 mm 디스크는 혈액 스폿의 중심으로부터 펀칭 포화된다. 혈액 자리는 총알 블렌더를 사용하여 균질화ND 후 단백질은 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4 내부 표준 D 2, C-13을 함유 타크로리무스로 침전된다. 볼 텍싱 및 원심 분리 후, 상청액 100 μL를가 온라인 추출 칼럼에 주입하고, 5 ㎖ / 0.1 포름산 / 아세토 니트릴로 세정 분 (7 : 3, V : V) 1 분. 이하, 전환 밸브가 작동하고 분석 물은 분석 컬럼에 백 플러시 (및 0.1 % 포름산 / 아세토 니트릴 구배를 사용하여 분리)된다. 타크로리무스는 탠덤 질량 분석 장치를 사용하여 다중 반응 양성 모드 (MRM)으로 정량화된다.
분석은 50 ng 내지 1 / ㎖에서 선형이다. 로 이십일에 걸쳐 평가 간 분석 변동 (3.6 % -6.1 %)과 정확성 (91.7 % -101.6 %)이 허용 기준을 충족. 평균 추출 회수는 95.5 %이다. 이월, 매트릭스 간섭 및 매트릭스 효과 아무런 관련이 없습니다. 타 크롤리 무스는 실온에서 1 주일 동안 4 ℃에서 건조 혈액 명소에서 안정적이다. 에서 추출 된 샘플오토 샘플러는 최소 72 시간 동안 4 ℃에서 안정하다.
Introduction
타 크롤리 무스는 마크로 라이드 구조 (8) (그림 1)이 강력한 immonosuppressant 1-7이다. 653g / L, 에탄올 : - 시스로 인한 CN 결합의 트랜스 이성질체는 역상 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리 될 수있는 용액을 9 개의 로타 머를 형성한다 (HPLC)은 타 크롤리 무스는 알코올 (메탄올 중의 지용성 및 수용성 355 G / L), 할로겐화 탄화수소 (클로로포름 : 573g / L) 및 에테르. . 0.1 G / L 및 물 (pH를 3 : 그것은 지방족 탄화수소 (헥산에 난 용성이다. 분자가 어떤 발색단과 자외선 최대 흡수를 포함하지 않는 9 0.0047 g / L) 칼시 뉴린 억제를 통해 192 nm의 타 크롤리 무스의 역할입니다 . 그 작용 메커니즘은 참조 10,11에서 검토되었다. 현재는 미국 (12)에 고체 기관 이식 환자의 80 % 이상으로 사용된다.
타크로리무스의 치료 지수는 considere있는 것이다D 13 좁은합니다. 또한, 타 크롤리 무스 및 투여 혈중 농도 간의 상관 관계는 좋지는 14,15 및 약동학 변수이다. 이식 환자에서 타 크롤리 무스 투여를 안내하는 치료 약물 모니터링 따라서 일반적으로 임상 실습 16 ~ 20입니다. 목표는 미리 정의 된 치료 범위 내에 타크로리무스의 혈중 농도를 유지하는 것이다. 치료 창 이상의 농도가 과다 면역, 암 등의 신 독성, 신경 독성, 고혈압, 당뇨병 등의 독성에 대한 위험이 증가하는 동안 치료 적 범위보다 타크로리무스 혈중 농도는 만성 또는 급성 동종 면역 반응의 활성이 증가 될 수 있습니다. 타 크롤리 무스의 높은 약동학 내 개인 변동성 이식 기관과 환자 생존율 (21, 22) 모두에 해가 될 수있다. 타 크롤리 무스의 약동학의 간 개별 변동은 주로 CYP3A5 다형성, 내 개인에 대한 이유에 의해 발생되는 동안변동성이 포함되지만, 약물 - 약물, 질병 - 약물 및 식품 - 약물 상호 작용 14, 15에 한정되는 것은 아니다. 또한 면역 억제 치료 약물 처방을 준수의 부족은 요인 및 이식 손실 (23, 24)에 대한 주요 이유입니다.
이러한 고려 사항은 빈번한 홈 치료약 및 타크로리무스 전혈 농도 부착 모니터링 환자가 항상 원하는 치료 창 내 타크로리무스 노출을 가질 수 있도록하는 것이 유익 할 수 있음을 시사한다. 그러나, 현재의 임상 15 금지 인 물류 및 더 빈번한 모니터링 치료약의 비용 때문이다. 그 이유 중 하나는 환자 phlebotomist 그린 필요한 정맥 혈액 샘플을 가지고 참조한다는 것이다. 말린 혈액 반점은 최근에 매력적인 개념 25-28로 등장했다. 환자 스틱 간단한 손가락 한 것은 특수 필터 종이 카드 및 혈액 자리가 거라고 한 후 혈액 방울을 수집리 에드, 그것은 타 크롤리 무스의 분석과 환자가 현재 복용 될 수 있음을 다른 면역 억제제를위한 중앙 실험실로 발송 될 수있다. 이는 건조 혈액 명소 (혈액의 일반적으로 20 μL) 25,29-43로 인해 아주 작은 혈액 볼륨에서 타 크롤리 무스와 다른 면역 억제제의 정량에 매우 민감하고 특정 LC-MS는 / MS 분석의 개발이 가능하게되었다. 또 다른 장점은 건조 혈액 명소로 최소 침습, 낮은 볼륨 시료 채취 전략은 크게 어린이 (28)의 치료 적 약물 모니터링 및 약동학 적 연구를 촉진한다는 것이다.
타 크롤리 무스는 일반적으로 정맥 EDTA 전혈 (15)로 측정됩니다. 이유는 타 크롤리 무스가 광범위하게 혈액 세포로 배포하는 것이 임상 연구는 임상 이벤트 15,18 플라즈마에 비해 혈중 타 크롤리 무스 통 농도 사이 좋은 상관 관계를보고했다고한다. 비교하여, TA의 분석건조 혈액 반점에서 crolimus은 여과지 매트릭스와 혼합 모세관 혈액에 기초한다. 이것은 LC-MS / MS 분석으로 타크로리무스 및 잠재적 간섭의 가용화면에서 과제를 제시한다. 여기에서 우리는 높은 흐름 온라인 열 샘플 정리 절차 및 LC-MS / MS 분석과 함께 총알 블렌더를 사용하여 건조 혈액 자리의 균질화를 기반으로 설립 검증 분석을 제시한다. 오늘날,이 분석은 임상 시험을 성공적으로 부착 모니터링 이상의 오천 타크로리무스 건조 혈액 샘플의 스폿 정량화에 사용되었다.
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Protocol
건강한 사람에서 드 확인 된 혈액 샘플은 콜로라도 병원의 대학 (오로라, 콜로라도)에서 있었다. 유효성 연구뿐만 아니라, 구경 및 품질 대조 시료의 제조 디 식별 혈액 은행 샘플의 사용은 콜로라도 멀티위원회 (Institutional Review Board COMIRB, 오로라, 콜로라도)에서 "제외"으로 간주 하였다.
참고 문헌 및 솔루션 1. 준비
- 구매 타 크롤리 무스와 내부 표준 D 2, 재료 목록에 나열된 공급 업체의 13 C-타 크롤리 무스.
- 타크로리무스 1 ㎎ / ㎖의 농도 및 D (2) 10 ㎍ / ㎖, 13 C-타크로리무스의 농도로 순수 메탄올 중의 스톡 용액을 준비한다. 3 개의 독립적 인 가중치를 기반으로 표준 물질의 재고 솔루션을합니다. 나누어지는 재고 솔루션 및 저장 -70 ° C에서 이하.
- 단백질을 침전 솔루션을 준비합니다(: 3 V : 7 V) 물에 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4를 사용하여 타 크롤리 무스의 압축을 풉니 다. 이 용액은 또한 내부 표준 D 2, 2.5 NG / ㎖의 농도에서 13 C-타크로리무스를 포함하고 빈 샘플의 추출을 제외한 모든 샘플 (1.3.3 참조)의 추출에 사용된다.
- 각 추출 날에 갓이 단백질 침전 솔루션을 준비하고 12 시간에서 솔루션의 만료를 설정합니다.
- 교정 곡선 및 품질 관리 (QC) 샘플의 제조
- 순수한 메탄올 원액 적절한 희석액을 행하여 타크로리무스의 스톡 용액을 준비한다.
- 교정기 및 품질 관리 샘플을 제조 EDTA 전혈로 적절히 희석 스톡 용액 20 μl를 스파이크, 20 분 및 분취위한 셀룰러 혈액 성분에 타크로리무스의 균일 분포를 허용하도록 수욕 진탕 부드러운하에 37 ℃에서 배양 1.5 ml의 용종에원뿔 바닥 ropylene 튜브 및 스냅인에 뚜껑. 유기 용매의 상대적 양이 5 %를 초과하지 않도록하십시오.
- 스팟 피펫을 사용하여 필터 카드에 각 원의 중앙으로 아군 전체 혈액의 50 μL.
- 3 시간 동안 실온에서 필터 카드에 혈액 반점을 건조.
- 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 NG / ㎖의 농도에서 타크로리무스 EDTA 인간 전혈에 타크로리무스 검정 표준을 준비한다. 내부 표준 D 2, 13 C-타 크롤리 무스 ( "제로 샘플")을 포함하는 단백질 침전 용액으로 교정 표준 등의 추출을위한 빈 샘플을 준비합니다.
- 0, 2, 4, 20, 40 NG / ㎖의 농도로 EDTA 인간 전혈에서 QC 샘플을 준비한다. 빈 샘플을 준비합니다. 내부 표준 D 2를 함유하는 침전으로 추출 QC 샘플들과 대조적으로, C-13 타크로리무스, 않는 단백질 침전 용액이 빈 샘플을 추출내부 표준 D 2, 13 C-타 크롤리 무스 ( "빈 샘플을")가 포함되어 있지.
- 임상 샘플 컬렉션
- 43, 44에 기술 된 바와 같이 건조 혈액 명소를 수집합니다.
2. 타 크롤리 무스의 추출 건조 혈액 스팟 샘플
- 시각적으로 허용되는 샘플의 품질과 양 (45)을 보장하기 위해 건조 혈액 자리를 검사합니다.
- 6 mm의 구멍 펀치 필터 카드의 혈액 자리의 펀치 센터.
주 : 펀치의 품질은 계량에 의해 모니터링 될 수있다. 천공 포화 필터 디스크는 0.09 mg의 (: 4.83- 5.14 ㎎, N = 12 범위) ± 평균 5.02 밀리그램에 무게. - 원뿔 바닥 스냅인에 뚜껑 1.5 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 장소 디스크.
- 각각의 튜브에 20 ~ 30 글 머리 기호를 추가합니다.
- 각각의 튜브에 (2.5 NG / ㎖의 내부 표준 V : 0.2 M ZnSO 4, 7 : 3, V 메탄올) 단백질 침전 용액 500 μl를 추가합니다. EXTR 들어빈 샘플의 동작은, 내부 표준없이 단백질 침전 솔루션을 사용합니다.
- ( "10"을 설정, 최대 속도) 1 분 동안 총알 블렌더에 디스크를 균질화.
- 10 분 동안 ( "10"을 설정, 최대 속도) 멀티 튜브의 소용돌이에 실온에서 샘플을 흔들어.
- 원심 분리기 샘플 16,000 XG, 10 분 동안 4 ° C에서.
- 300 μL 삽입 장착 유리 HPLC 바이알에 상층 액을 전송합니다. 미리 슬릿 테플론 씰을 사용합니다.
주 : 추출 된 샘플은 -20 ° C 이하에서 LC-MS / MS 분석 때까지 저장 될 수있다.
3. LC-MS / MS 분석
- 부하 (100) C8 카트리지 추출 컬럼으로 추출 된 샘플의 상등액 μL 및 7로 세척한다 : 물 중 0.1 % 포름산 : 3 비율을 5 ml의 아세토 니트릴 흐름 / 분으로 1 분 동안. 전환 밸브의 연결은도 2에 도시되고 구배 표 1 추출 펌프에 의해 실행
- 이하는 분석 컬럼에 미리 열에서 분석의 백 플러시의 결과로 전환 밸브를 활성화합니다.
- 65 ° C의 열 온도를 설정합니다.
- 표 1에 나타낸 유량과 구배를 사용하여 분석 컬럼에서 분석 물을 용리.
- 터보 전기 분무 이온화 소스를 통해 탠덤 질량 분석기로 분석 컬럼을 연결합니다. 표 2에있어서 질량 분석의 주요 파라미터를 조정한다.
- 여러 반응 모드 (MRM)의 양이온 ([M + 나] +)를 검출한다. 정량을 위해 다음과 같은 이온 전환을 사용하여 타 크롤리 무스 : M / Z (질량 / 충전) = 826.6를 616.2와 D 2, 13 C-타 크롤리 무스 → : M / Z = 619.2 → 829.6을.
참고 : 전체 실행 시간은 4.6 분입니다.
4. 정량
- 각 실행에 대해, 1.3.5 및 제조 교정기에 기초 검량선을 생성각각의 분석 실행에 포함.
- 질량 분석 소프트웨어를 사용하여 (피크 면적 [분석 대상 물질] / 피크 면적 [내부 표준]) 검체의 응답 인자 대 공칭 농도를 플로팅함으로써 교정 곡선을 생성한다.
- 1 / X 가중치와 함께 차 착용감을 사용하여 교정기를 장착한다.
- 건조 된 혈액 관광 명소 수량 타 크롤리 무스에 추출 된 MRM 크로마토 그램에서 타 크롤리 무스와 내부 표준 물질 피크를 통합 할 수 있습니다. 타 크롤리 무스에 대한 응답 인자 (피크 면적 [분석 대상 물질] / 피크 면적 [내부 표준)를 계산하고 질량 분석 소프트웨어를 사용하여 검량선과 비교한다.
5. 검증 절차
- 검출 (LLOD)의 하한과 정량 (LLOQ)의 하한.
- 검출부 (LLOD)의 하한으로서 1 : 4의 피크 - 대 - 잡음비와 낮은 타크로리무스 농도를 고려한다. 로서 정량화 (LLOQ)의 하한을 정의동일하거나 공칭 농도와 같거나 더 나은 20 %의 정밀도 (변동 계수)에서 ± 20 %의 편차를보다 나은 정확성으로 검량선의 최저 농도.
- 인트라 간 하루의 정확도 및 정밀도.
- 2 겨 / ㎖ (QC1), 4 겨 / ㎖ (QC2), 20 ng를 / ㎖ (QC3) 40 겨 / ㎖ (QC4)의 네 가지 농도 수준의 정확도와 정밀도를 테스트합니다.
- 인간의 EDTA 전체 혈액의 각 검증 하루에 품질 관리 샘플을 준비 필터 카드, 추출물 건조, 전술 한 바와 같이 분석한다.
- 품질 관리 농도 레벨 당 6 샘플 내 하루의 정확성과 정밀도를 결정합니다.
- 이십일 동안 간 일의 정확도와 정밀도를 평가합니다. 4 샘플을 매일 각각의 품질 관리 수준을 측정한다.
- 각각의 날에 품질 관리 샘플과 함께 두 교정 곡선을 분석합니다.
- 공칭 농도 % (농도에 6 샘플, 5.2.2 참조)로 내 하루 정확도를 계산합니다. 석회질변동 (CV %)의 계수로서 ulate 정밀도.
- 수용은 공칭 농도의 85 % 115 % 제한으로가 떨어지면 안 일 정밀도가 허용 고려한다. 그것은 15 % CV (변동 계수)과 같거나 더 나은 상 허용되는 경우 인트라 일 정밀도를 고려한다.
- 20 검증 일 동안 분석 각각의 품질 관리 농도에 대한 평균으로 간 하루 정확도와 정밀도를 계산합니다.
- 수용은 공칭 농도의 85 % 115 % 제한으로이 떨어지는 경우 평균 간 하루 정도는 허용 고려한다. 그것은 15 % CV (변동 계수)과 같거나 더 나은 상 허용되는 경우 일 간 정밀도를 고려한다.
- 매트릭스 간섭의 배제.
- 매트릭스 신호에 의해 발생할 수 있습니다 간섭의 배제를 들어, 빈 건조 혈액 명소 (8 다른 개인, 바람직하게는 4 명의 남성과 4 명의 여성)을 분석 할 수 있습니다.
- 시각적으로 이온 크로마토 그램을 검사합니다. 만약 고정 된 시간 내에 피크타 크롤리 무스의 창은 LLOQ에서 타 크롤리 무스와 스파이크 통합하고 빈 샘플 타 크롤리 무스 피크의 사람들과 곡선에서 자신의 영역을 비교, 검색됩니다. 빈 샘플 피크의 면적은 LLOQ에서 타 크롤리 무스의 사람들의 15 %를 초과 할 것으로 예상되지 않습니다.
- 이온 억제 / 이온 향상.
- 동시 용출 매트릭스 성분에 의한 이온 진압 / 이온 향상의 잠재적 인 간섭을 평가하기 위해 45 바와 같이 포스트 칼럼 주입 프로토콜을 사용한다.
- 0.1 % 포름산 10 ㎍ / ml의 농도에서 타크로리무스 달이다 : 메탄올 (30:70, v / v)로 포스트 - 컬럼을 10 μL / 분의 속도.
- 분석 컬럼과 질량 분석기의 전기 분무 소스 간 T 피스를 통해 시린지 펌프를 연결한다.
- 타 크롤리 무스에 대한 MRM 전이 MS / MS 데이터 신호 강도를 모니터링하고 내부 표준 (m / z = 616.2 및 m / z = 829.6 → 619.2 → 826.6)의 주입 후 extrac테드 빈 샘플 (N = 다른 개인 8 샘플).
주 : 이온 억제 신호 및 이온 인핸스 피크 딥이 발생하는 동안, 이온 억압 / 이온 충실한없는 분석 물 주입에 의한 연속 신호는, 빈 매트릭스 주사에 의해 영향을받지 않을 것이다.
- 이월.
- 가장 높은 구경 후 빈 샘플을 추출 분석하여 잠재적 인 캐리 오버 평가 (50 NG / ㎖, N = 6).
- 시각적으로 이온 크로마토 그램을 검사합니다. 타 크롤리 무스의 체류 시간 윈도우 내의 피크가 검출되는 경우에 타크로리무스 LLOQ 타서 통합 및 빈 샘플 타크로리무스 피크들과 그 곡선 아래 영역을 비교한다. 빈 샘플 피크의 면적은 LLOQ에서 타 크롤리 무스의 사람들의 15 %를 초과 할 것으로 예상되지 않습니다.
- 추출 회복.
- QC SAM 추출한 후 분석 물 신호를 비교하여 회수율을 결정PLES 빈 건조 혈액 명소들과 네 가지 농도 수준 (N = 농도 당 6)에서 추출 후 타 크롤리 무스의 상응하는 양의 스파이크.
- QCS의 4 세트 (2, 4, 20, 40 NG / ㎖ 농도 수준)을 준비한다.
- 필터 종이 카드에 빈 EDTA 전체 혈액의 50 μl를 파악하고, 2 시간 동안 건조하여 "복구 테스트 샘플을"대응의 또 다른 4 세트를 준비합니다.
- 이하, 품질 관리 및 빈 "복구 테스트 샘플"모두, 가위로 필터 카드의 전체 혈액의 자리를 잘라 원뿔 바닥과 스냅인에 뚜껑 폴리 프로필렌 튜브에 생성 된 디스크를 넣습니다.
- 모든 샘플을 추출합니다.
- 유리 HPLC 바이알에 상층 액 (400 μL)를 전송합니다.
- 2, 4, 20, 40 ng를 / ㎖ (200, 400, 2,000, 4,000 NG / ㎖ 타크로리무스 스톡 졸 4 μL의 농도에 도달하는 빈 "추출 회수 시험 샘플"에 타크로리무스 스톡 용액을 첨가상층 액 400 μL)에 용액 사용.
- LC-MS / MS 분석 한 결과, QC 샘플 및 해당 농도의 "회복 시험 샘플"모두에서 신호를 비교 (추출 / 신호 샘플이 추출 × 100 이후 아군 전에 회수 (%) = 신호 샘플은 아군).
- 희석의 무결성.
- 희석하여 무결성을 확립 시료 500, 250, 100ng의 / ㎖에서 분석 대상으로 스파이크.
- 추출 후, 단백질 침전 용액을 사용하여 시료 희석 (1:10, N = 3 농도 수준 당).
- 공칭 농도의 편차를 계산합니다. 85 % 내에서 공칭 허용의 -115 % 하락할 결과를 고려한다.
- 안정성.
- 네 농도 수준 (N = 농도에 따라 4) 다른 시간 지점에서와 다른 저장 조건에서 분석의 품질 관리 샘플을 사용하여 안정성을 조사합니다.
- 공칭 값을 저장 한 후 결과를 비교한다. R을 고려85 % 내에서 공칭 허용의 -115 % 하락 esults.
- 4 ° C, -20 ° C에서 1개월 및 -80 ° C에서 1 개월 일주, 상온에서 1 주일 동안 샘플의 안정성을 설정합니다.
- 3주기를 통해 테스트 동결 - 해동 안정성 (-20 ° C). 4 ℃로 조정 된 항온 자동 시료 주입기로 샘플을 배치하여 테스트 추출 된 샘플 및 오토 샘플러 안정성. 72 시간 후 샘플을 주입한다.
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Representative Results
블랭크 샘플의 대표적인 이온 크로마토 그램은, 샘플은도 3에 도시되어 정량화 및 환자 샘플의 하한에서 아군.
교정 곡선
검출 하한은 0.5 ml의 NG /이었고, 정량 하한은 1.0 ng를 / ㎖이었다. 높은 농도가 정상적인 상황에서 병원에 도달 할 가능성이 있습니다로 쉰 NG는 / ml로 가장 높은 교정기로 선정되었다.
교정 곡선은 갓, 인간의 EDTA 전체 혈액의 각 검증 하루에 준비 필터 카드에 건조하고 추출 된 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4 (70:30 V / V) + 내부 표준 (내부 표준의 최종 농도 : 2.5 NG / ㎖ ). 1 일 유효성 검사를 위해 (N = 6 품질 관리 수준에 대한 교정기 및 n = 6)과 일 2 - (각 품질 관리 수준에 대한 N = 2 교정기 및 N = 4) (20) 농도 1, 2.5, 5 분석 하였다, CALIB 10, 25, 50 ng를 / ㎖쉼. 전형적인 검량선을도 4에 도시된다. 공칭 115 %로 85 %의 평균 정확도 (6 비제 교정기의 최소) 교정기의 2/3에 대한 작동 범위 내에서 수용 가능한 것으로 간주되었다. 상관의 평균 계수 (R) = 0.999 (N = 40 교정 곡선)이었다.
정확도와 정밀도
결과를 표 3에 상세히 도시되어있다.
추출 복구
평균 추출 회수율 (2 NG / ㎖), 92.2 (4 NG / ㎖), 95.5 (20 NG / ㎖), 96.2 (40 NG / mL)을 98.2 %였다.
매트릭스 간섭, 이온 억제 / 이온 향상 테스트를 사용하여 연속 포스트 열 주입 및 이월
에 대응하는 8 개의 다른 개인들 (N = 4, N = 여성 및 남성 4) 보유 시간에서 보여 신호 LLOQ (1 NG / ㎖)의 15 % 미만에서 빈 샘플 분석검출 된 타 크롤리 무스 피크 특정 고려 될 수 있음을 나타내는 타 크롤리 무스 피크. 대표적인 예는도 3에 도시되어있다. 이온 진압 / 이온 강화하여 잠재적 인 간섭은 8 개의 다른 건강한 사람에서 빈 건조 혈액 시료를 사용하여 시험 하였다. 대표적인 실험을도 5에 도시되어있다. 현저한 억제 이온 / 이온 향상의 어떠한 징후가 관찰되지 않았다. LLOQ에서 신호의 15 %를 초과하는 피크의 결과로 어떤 관련 이월은 검출되지 않았다.
희석 무결성
희석 무결성의 목표 농도에 도달하는 최고 교정기 (100, 250, 500 NG / ㎖) 이상의 농도로 제조하고, 추출 후 단백질 침전 용액 1:10 희석 된 시료를 분석하여 조사 하였다 : 10, 25, 50 NG / ml의. 정확도는 평균 공칭 농도의 115 %로 85 %의 수용 기준 내에 있도록했다. 모든 희석의 TES테드는 허용 기준 (표 4)를 만났다.
안정성
건조 혈액 명소에서 타 크롤리 무스의 안정성은 다양한 조건에서 저장된 모든 4 단계 (N = 4 / 농도)에서 품질 관리 시료를 분석하여 조사 하였다.
정확도는 평균 공칭 농도의 115 %로 85 %의 수용 기준 내에 있도록했다. 결과를 표 5에 상세히 도시되어있다. 3 동결 및 해동 사이클 후 -80 ℃에서 저장 1 개월 후 -20 ℃에서 저장 1 개월 후 4 ℃에서 저장 일주 후 실온에서 저장 일주 후 아니 손실,,,,,과 4 ° C에서 자동 샘플러에서 추출 된 샘플의 72 시간 후 분명했다.
| 추출 펌프 | 분석 (용출) 펌프 | ||||||
| 물 + 0.1 % 포름산 | 아세토 니트릴 | 유량 [μL / 분] | 시간 [분] | 물 + 0.1 % 포름산 | 아세토 니트릴 | 유량 [μL / 분] | |
| 0 | (70) | (30) | 5,000 | 0 | (13) | 87 | 1,000 |
| 1 | (70) | (30) | 5,000 | (2) | (2) | (98) | 1,200 |
| 1.1 | (2) | (98) | (100) | 3.5 | (2) | (98) | 1,200 |
| 3 | (2) | (98) | (100) | 3.6 | (13) | 87 | 1,000 |
| 3.1 | (20) | (80) | 2,000 | 4.6 | (13) | 87 | 1,000 |
| 4 | (70) | (30) | 5,000 | ||||
| 4.6 | (70) | (30) | 5,000 | ||||
추출 표 1. 그라데이션 프로그램 및 분석 HPLC 펌프.
| 매개 변수 | 환경 |
| 충돌 가스 (CAD) | (10) |
| 커튼 가스 (현재) (PSI) | (30) |
| 이온 소스 가스 1 (GS1) (PSI) | (50) |
| 이온 소스 가스 미터 (GS2) (PSI) | (30) |
| 네뷸 라이저 전류 (NC) (V) | 1 |
| 온도 (TEM) (° C) (600) | |
| IonSpray 전압 (IS) (V) | 5500 |
| 인터페이스 히터 (IHE) | 에 |
| 디 클러스터링 전위 (DP) (V) | (136) |
| 입학 전위 (EP) (V) | (10) |
| 충돌 에너지 (CE) (V) | 47 |
| 충돌 셀 출구 전위 (CXP) (V) | (16) |
표 2. 터보 전자 분무 인터페이스 및 질량 분석기 매개 변수. 명명법은 질량 분석 소프트웨어에서 사용에 해당한다 (제조 업체 자세한 내용은, 재료 목록을 참조하십시오).
| 검증의 날 | 품질 관리 수준 [농도와의 %] | |||
| (2) | 4 | (20) | (40) | |
| 1 일 | 93.0 | 86.3 | 88.9 | 93.4 |
| (101) | 90.4 | 95.3 | (100) | |
| 85.6 | 95.9 | 99.0 | 97.5 | |
| 88.6 | 93.6 | (105) | (103) | |
| 85.0 | 97.4 | 97.2 | (109) | |
| 89.1 | 96.7 | (100) | (101) | |
| 안 일 정도 [%] | 90.4 | 93.4 | 97.6 | 100.7 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 6.6 | 4.6 | 5.5 | 5.2 |
| 2 일 | 92.8 | 86.0 | (103) | |
| 91.1 | 88.8 | 94.7 | 87.0 | |
| 88.6 | 90.9 | 92.8 | 94.2 | |
| 97.2 | 93.7 | 94.2 | (115) | |
| 안 일 정도 [%] | 92.4 | 89.9 | 96.2 | 97.9 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 3.9 | 3.6 | 4.8 | 12.2 |
| 3 일 | 97.6 | (101) | 98.4 | (112) |
| (104) | 85.6 | (102) | (110) | |
| 99.2 | 88.4 | 99.4 | (105) | |
| 96.3 | 87.2 | (108) | 117 | |
| 안 일 정도 [%] | 99.3 | 90.6 102.0 | 111.0 | |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 3.4 | 7.8 | 4.2 | 4.5 |
| 4 일 | 95.2 | 88.6 | (112) | 94.5 |
| (105) | 87.3 | 93.2 | (116) | |
| 99.8 | 96.2 | (103) | (103) | |
| (100) | (104) | 97.2 | 99.4 | |
| 안 일 정도 [%] | 100.0 | 94.0 | 101.4 | 103.2 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 4.0 | 8.2 | 8.1 | 8.9 |
| 5 일 | (106) | 90.4 | (101) | (106) |
| (108) | 89.0 | <TD> (106)(100) | ||
| (102) | (101) | 96.6 | (128) | |
| (105) | 88.8 | (105) | (107) | |
| 안 일 정도 [%] | 105.3 | 92.3 | 102.2 | 110.3 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 2.4 | 6.3 | 4.2 | 11.1 |
| 6 일 | 90.9 | 93.7 | 119 | (106) |
| 98.8 | 88.1 | 96.4 | (110) | |
| 94.6 | 96.3 | 99.1 | (108) | |
| (108) | (100) | (102) | (102) | |
| 안 일 정도 [%] | 98.1 | 94.5 | 104.1 | 106.5 |
| 7.5 | 5.3 | 9.8 | 3.2 | |
| 7 일 | 85.1 | 87.5 | 99.5 | 95.4 |
| 86.4 | 85.4 | 94.7 | (101) | |
| 94.5 | 87.3 | 98.9 | 94.6 | |
| 85.5 | 97.0 | (101) | 99.6 | |
| 안 일 정도 [%] | 87.9 | 89.3 | 98.5 | 97.7 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 5.1 | 5.8 | 2.7 | 3.2 |
| 8 일 | 86.1 | 92.5 | 91.9 | (102) |
| 87.5 | 91.5 | 95.2 | 88.5 | |
| (115) | 85.6 | 92.1 | (102) | |
| 85.8 | 85.9 | 95.4 | (108) | |
| 안 일 정도 [%] | 93.6 | 88.9 | 93.7 | 100.1 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 15.3 | 4.1 | 2.0 | 8.2 |
| 9 일 | 88.9 | 91.4 | 96.9 | (100) |
| 90.0 | 89.8 | 95.0 | (100) | |
| 69.7 | 85.9 | 95.8 | (109) | |
| 91.9 | 87.0 | (105) | (101) | |
| 안 일 정도 [%] | 85.1 | 88.5 | 98.2 | 102.5 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 12.2 | 2.9 | 4.7 | 4.3 |
| 10 일째 | 90.9 | 91.3 | 96.2 | (100) |
| 97.7 | 89.5 | 94.4 | (100) | |
| 99.9 | (109) | 98.7 | 96.8 | |
| 99.1 | 90.0 | 95.7 | 96.1 | |
| 안 일 정도 [%] | 96.9 | 95.0 | 96.3 | 98.2 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 4.2 | 9.9 | 1.9 | 2.1 |
| 날 11 | 92.7 | 91.9 | 88.2 | (104) |
| 96.6 | 91.2 | 97.0 | (110) | |
| 109.0 | 92.8 | (97).6 | (102) | |
| 98.3 | (107) | 93.7 | (111) | |
| 안 일 정도 [%] | 99.2 | 95.7 | 94.1 | 106.8 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 7.0 | 7.9 | 4.6 | 4.1 |
| 날 12 | 87.7 | 85.5 | (105) | 95.3 |
| (112) | 88.1 | (101) | 96.1 | |
| (102) | 89.1 | 89.7 | 97.5 | |
| (106) | 92.5 | (102) | (104) | |
| 안 일 정도 [%] | 101.9 | 88.8 | 99.4 | 98.2 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 10.1 | 3.3 | 6.7 | 4.0 |
| 날 13 | 실패한 | 85.7 | 93.3 | (102) |
| (101) | (105) | 88.0 | 93.9 | |
| (112) | 98.0 | 91.4 | (102) | |
| (104) | (113) | (104) | (101) | |
| 안 일 정도 [%] | 105.7 | 100.4 | 94.2 | 99.7 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 5.4 | 11.5 | 7.3 | 3.9 |
| 주 (14) | 91.5 | 89.1 | 97.4 | 93.1 |
| 90.4 | 87.1 | 93.9 | 99.8 | |
| 89.7 | 97.0 | 94.8 | (106) | |
| 97.4 | 86.8 | 89.9 | 실패한 | |
| 안 일 정도 [%] | 92.3 | 90.0 | 94.0 | 99.6 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 3.8 | 5.3 | 3.3 | 6.5 |
| 날 15 | 92.8 | 92.8 | 92.5 | 95.4 |
| 97.5 | 96.3 | 96.2 | 95.5 | |
| 95.5 | (108) | 97.3 | 99.3 | |
| (110) | (109) | (115) | (113) | |
| 안 일 정도 [%] | 99.0 | 101.5 | 100.3 | 100.8 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 7.7 | 8.1 | 10.0 | 8.3 |
| 16 일 | 93.7 | 97.8 | 90.7 | (112) |
| 90.3 | 87.1 | 실패한 | (101) | |
| 97.9 | 88.3 | 95.5 | (107) | |
| 91.4 | 85.7 | 89.3 | 96.7 | |
| 안 일 정도 [%] | 93.3 | 89.7 | 91.8 | 104.2 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 3.6 | 6.1 | 3.5 | 6.4 |
| 날 17 | 88.0 | 86.0 | 93.7 | (103) |
| 89.8 | 90.8 | 94.8 | 93.2 | |
| 85.9 | 91.1 | 99.7 | 94.8 | |
| 86.7 | 88.1 | 95.6 | 91.7 | |
| 안 일 정도 [%] | 87.6 | 89.0 | 96.0 | 95.7 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 1.9 | 2.7 | 2.7 | 5.3 |
| 날 18 | 89.6 | 85.8 | 91.0 | 98.3 |
| 89.6 | 86.2 | 88.3 | 93.6 | |
| 실패한 | 86.7 | 96.8 | (104) | |
| 88.1 | 85.8 | 95.2 | (111) | |
| 안 일 정도 [%] | 89.1 | 86.1 | 92.8 | 101.7 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 1.0 | 0.5 | 4.2 | 7.4 |
| 날 19 | 98.0 </ TD> | 89.7 | 94.2 | (102) |
| 88.3 | 86.0 | 97.6 | (102) | |
| 91.6 | 88.1 | 95.8 | 97.5 | |
| 90.7 | 90.1 | 92.8 | 88.3 | |
| 안 일 정도 [%] | 92.2 | 88.5 | 95.1 | 97.5 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 4.5 | 2.1 | 2.2 | 6.6 |
| 날 20 | 93.0 | 87.0 | 99.4 | (101) |
| 97.3 | 87.6 | 95.5 | 91.9 | |
| 89.0 | 88.4 | 91.2 | 93.5 | |
| (104) | 90.7 | 97.7 | (115) | |
| 안 일 정도[%] | 95.8 | 88.4 | 96.0 | 100.4 |
| 안 일 부정확 [이력서 %] | 6.7 | 1.8 | 3.7 | 10.5 |
간 날의 정확성과 부정확성 | ||||
| 간 하루 정확도 | 95.2 | 91.7 | 97.2 | 101.6 |
| 인터 일 부정확 | 6.1 | 4.5 | 3.6 | 4.2 |
표는 품질 관리 샘플 3. 결과를 통해 20 일. 데이터는 공칭 %로 제시됩니다. "실패"로 표시 샘플을 실험실 / 장비 오류로 손실 된 샘플입니다. 대부분의 CA에서ES, 더 피크가 전혀 검출되지 않았거나 내부 표준 물질 피크가 누락되었습니다.
| 희석 | 1시 10분 |
| 희석 후 공칭 목표 농도 | 50 ng를 / ㎖ |
| 98.6 | |
| 94.5 | |
| 91.4 | |
| 정확도 [%] | 94.8 |
| 부정확 [이력서 %] | 3.6 |
| 희석 | 1시 10분 |
| 희석 후 공칭 목표 농도 | 10 ng를 / ㎖ |
| (103) | |
| 99.5 | |
| (101) | |
| 정확도 [%] | 101.2 |
| 부정확 [이력서 %] | 1.8 |
| 희석 | 1시 10분 |
| 희석 후 공칭 목표 농도 | 25 ng를 / ㎖ |
| 91.7 | |
| 98.2 | |
| (103) | |
| 정확도 [%] | 97.6 |
| 부정확 [이력서 %] | 5.7 |
희석 무결성 테스트. 데이터 표 4. 결과 명목의 %로 제시됩니다.
| 실온에서 안정성, 1 일 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 91.9 | 85.8 | 86.0 | (102) | |
| 86.7 | 85.7 | 88.5 | (102) | |
| 86.0 | 85.9 | 90.1 | (103) | |
| 89.2 | 98.0 | 90.8 | (112) | |
| 공칭 농도 % | 88.5 | 88.9 | 88.9 | 104.8 |
| 부정확 [%의 CV] | 2.7 | 6.1 | 2.1 | 4.9 |
| 실온에서 안정성, 3 일 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 88.6 | (105) | (101) | (113) | |
| 94.1 | (100) | 98.5 | (103) | |
| (100) | (101) | (106) | (109) | |
| 99.5 | (102) | (102) | (108) | |
| 공칭 농도 % | 95.6 | 102.0 | 101.9 | 108.3 |
| 부정확 [%의 CV] | 5.3 | 2.2 | 3.1 | 4.1 |
| 실온에서 안정성, 7 일 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| (105) | (103) | 91.7 | (109) | |
| (101) | (107) | (100) | (110) | |
| (102) | (108) | (107) | (105) | |
| 93.8 (105) | (109) | (111) | ||
| 공칭 농도 % | 100.5 | 105.8 | 101.9 | 108.8 |
| 부정확 [%의 CV] | 4.7 | 2.2 | 7.8 | 2.6 |
| (B) | ||||
| 4 ° C를 1 일에서 안정성 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| (101) | 89.9 | 95.8 | (100) | |
| 88.9 | 91.0 | 94.1 | 99.0 | |
| 96.2 | (100) | (102) | 96.7 | |
| 89.5 | 87.8 | 95.4 | 88.6 | |
| 공칭 농도 % | 93.9 | 92.2 | 96.8 | 96.1 |
| 부정확 [%의 CV] | 5.8 | 5.4 | 3.5 | 5.2 |
| 4 ° C를 3 일에서 안정성 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 87.3 | 85.2 | (105) | 95.3 | |
| 실패한 | 87.8 | (101) | (96) | |
| (101) | 88.8 | 89.6 | 97.5 | |
| (106) | 92.2 | (102) | (104) | |
| 공칭 농도 % | 98.1 | 88.5 | 99.4 | 98.2 |
| 부정확 [%의 CV] | 9.7 | 2.9 | 6.8 | 4.0 |
| 4 ° C를 7 일에서 안정성 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 94.0 | 98.5 | 96.1 | (110) | |
| 92.9 | 96.4 | (109) | (109) | |
| 91.7 | 96.3 | 97.9 | (115) | |
| 94.7 | 96.9 | 99.8 | (113) | |
| 공칭 농도 % | 93.3 | 97.0 | 100.7 | 111.8 |
| 부정확[%이력서] | 1.3 | 1.0 | 5.7 | 2.8 |
| C | ||||
| -20 ° C, 3 일에서 안정성 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 87.3 | 98.7 | (111) | (111) | |
| 93.5 | 89.6 | (108) | (105) | |
| 89.5 | 91.5 | (107) | (112) | |
| 88.2 | 99.1 | (108) | 92.4 | |
| 공칭 농도 % | 89.6 | 94.7 | 108.5 | 105.1 |
| 부정확 [%의 CV] | 2.7 | 4.9 | 1.7 | 9.0 |
| -20 ℃, 7 일에서 안정성 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 96.5 | 98.7 | (102) | (109) | |
| 94.8 | 94.6 | (114) | (106) | |
| 95.5 | (102) | 98.1 | (108) | |
| (107) | 99.5 | (115) | (105) | |
| 공칭 농도 % | 98.5 | 98.7 | 107.3 | (107) |
| 부정확 [%의 CV] | 5.7 | 3.1 | 8.5 | 1.8 |
| </ TD> | ||||
| -20 ℃, 일 30시 안정성 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 82.3 | 83.1 | 90.4 | 93.2 | |
| 87.9 | 85.8 | 85.3 | 97.9 | |
| 85.7 | 88.6 | 98.3 | 98.0 | |
| 92.0 | 95.6 | (110) | (103) | |
| 공칭 농도 % | 87.0 | 88.3 | 96.0 | 98.0 |
| 부정확 [%의 CV] | 4.1 | 5.4 | 10.8 | 4.0 |
| D </ TD> | |||||||||
| -80 ° C, 3 일에서 안정성 | |||||||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) | |||||
| 87.5 | 96.5 | 96.7 | 실패한 | ||||||
| 실패한 | 97.6 | 98.7 | (110) | ||||||
| 88.8 | 96.4 | (106) | (109) | ||||||
| 87.3 | (101) | 96.5 | (109) | ||||||
| 공칭 농도 % | 87.9 | 97.9 | 99.5 | 109.3 | |||||
| 부정확 [%의 CV] | 0.8 | 2.2 | 4.5 | 0.6 | |||||
| -80 ° C, 7 일에서 안정성 | 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) | ||||
| 실패한 | 98.0 | (105) | 99.8 | ||||||
| 97.1 | (106) | (104) | (105) | ||||||
| 99.7 | (102) | 99.3 | (102) | ||||||
| (101) | 99.9 | (109) | (106) | ||||||
| 공칭 농도 % | 99.3 | 101.5 | 104.3 | 103.2 | |||||
| 부정확 [%의 CV] | 2.0 | 3.4 | 4.0 | 2.8 | |||||
| -80 ° C, 하루 30에서 안정성 | |||||||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | | (20) | (40) | | |||||
| 88.2 | 85.3 | 89.6 | 96.7 | ||||||
| 96.2 | 92.6 | 85.8 | 94.1 | ||||||
| 83.9 | 93.7 | 91.0 | (105) | ||||||
| 95.6 | 94.0 | 98.9 | (102) | ||||||
| 공칭 농도 % | 91.0 | 91.4 | 91.3 | 99.5 | |||||
| 부정확 [%의 CV] | 6.0 | 4.1 | 5.5 | 4.9 | |||||
| E | ||||
| 동결 해동 안정성, -20 ° C, 1주기 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] </ TD> | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 92.5 | 86.2 | 90.2 | 94.3 | |
| 89.8 | 90.5 | 85.4 | (104) | |
| 94.7 | 88.6 | 93.4 | (104) | |
| (101) | 89.2 | 93.7 | 96.3 | |
| 공칭 농도 % | 94.5 | 88.6 | 90.7 | 99.7 |
| 부정확 [%의 CV] | 4.8 | 1.8 | 3.9 | 5.1 |
| 안정성 해동 동결 -20 ° C, 2주기를 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 99.1 | 97.6 | 실패한 | 85.3 | |
| 93.1 | 88.1 | 93.4 | 92.0 | |
| 94.9 | 91.5 | 85.8 | 93.9 | |
| 실패한 | 90.5 | 86.8 | 85.4 | |
| 공칭 농도 % | 95.7 | 91.9 | 88.7 | 89.2 |
| 부정확 [%의 CV] | 3.1 | 4.0 | 4.1 | 4.5 |
| 안정성 해동 동결 -20 ° C, 3주기를 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 95.7 | 실패한 | 86.0 | 93.3 | |
| 95.5 | 87.4 | 85.0 | 91.3 | |
| 90.5 | 89.1 | 86.0 | 86.0 | |
| 96.9 | 85.7 | 90.2 | 실패한 | |
| 공칭 농도 % | 94.7 | 87.4 | 86.8 | 90.2 |
| 부정확 [%의 CV] | 2.8 | 1.7 | 2.3 | 3.8 |
| F | ||||
| +4 ℃로, 24 시간에서 추출 된 샘플의 안정성 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| (122) | (112) | 91.0 | (104) | |
| 93.5 | (106) | 91.8 | 96.1 | |
| (111) | 94.8 | 98.2 | 93.5 | |
| 98.4 | 97.6 | 91.3 | 89.8 | |
| 공칭 농도 % | 106.2 | 102.6 | 93.1 | 95.9 |
| 부정확 [%의 CV] | 12.8 | 7.9 | 3.4 | 6.0 |
| +4 ℃로, 48 시간에서 추출 된 샘플의 안정성 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| (106) | (108) | 93.7 | (110) | |
| (105) | 98.1 | 94.6 | 98.9 | |
| (103) | 98.4 | 95.0 | 92.6 | |
| (108) | 93.1 | 89.7 | 85.5 | |
| 공칭 농도 % | 105.5 | 99.4 | 93.3 | 96.8 |
| 부정확 [%의 CV] | 2.1 | 6.2 | 2.4 | 10.4 |
| +4 ℃로, 72 시간에서 추출 된 샘플의 안정성 | ||||
| 품질 관리 수준 [NG / ㎖] | (2) | 4 | (20) | (40) |
| 96.5 | (112) | 96.4 | (104) | |
| (101) | 95.3 | (103) | 95.2 | |
| 94.2 | (105) | 93.5 | 99.5 | |
| (100) | 96.9 | 92.6 | 89.3 | |
| 공칭 농도 % | 97.9 | 102.3 | 96.4 | 97.0 |
| 부정확 [%의 CV] | 3.1 | 7.7 | 4.7 | 6.3 |
안정성 시험의 표 5. 결과. 7 일 동안 실온에서 건조 혈액 관광 명소 타 크롤리 무스의 안정성, B : 냉장고에 건조 혈액 명소 (4 ℃로) 7 일 이상에 타 크롤리 무스의 안정성 C : -20 °에서 건조 혈액 관광 명소 타 크롤리 무스의 안정성 C 이상 1개월, D : -80 ° C에서 건조 혈액 관광 명소 타 크롤리 무스의 안정성 1 개월 이상, E : 건조 혈액 관광 명소 타 크롤리 무스의 안정성 세 이상 동결 해동 사이클 (-20 ° C), F : 72 시간 동안 4 ℃에서 샘플 / 오토 샘플러 안정성을 추출. 데이터는 공칭 농도 %로 제시됩니다. "실패"로 표시 샘플을 실험실 / 장비 오류로 손실 된 샘플입니다. 대부분의 경우에는 피크는 전혀 검출되지 않았거나 내부 표준 물질 피크가 누락되었습니다.
타 크롤리 무스. 원자 번호의 그림 1. 구조는 순수 및 응용 화학 (IUPAC) 명칭의 국제 연합 (EU)을 따른다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전환 밸브 2. 연결 그림.424fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 대표적인 이온 크로마토 그램. (A) 필터 용지에 발견 빈 혈액 샘플의 대표적인 이온 크로마토 그램 (제조 업체의 자세한 내용은, 재료 목록 참조) 및 건조. 화살표는 타크로리무스 피크 (B) 시료를 정량화 (1 NG / ㎖)의 하한에서 아군 빈 혈액의 대표적인 이온 크로마토 여과지 상에 발견하고, 건조하고 (C) 대표 이온 크로마토 그램의 머무름 시간을 표시 필터 종이에 이식 환자에 의해 수집 된 샘플의. 이 통 샘플과 측정 된 타 크롤리 무스의 농도는 2.1 NG / ㎖이었다. 이 샘플 재택 환자에 의해 수집하고 있었다 임상 시험에서하였습니다 신시내티 임상 시험 심사위원회의 대학 (신시내티, OH)에 의해 승인했다. 모든 환자는 적절한 서면 동의했다. 질량 분석 소프트웨어에 의해 생성 된 이온 크로마토 그램은 원본을 인쇄 아웃입니다 (제조 세부 사항, 재료 목록을 참조하십시오). 이온 크로마토 그램에 파란색과 빨간색 선은 내부 표준 D 2, 각각 13 C-타 크롤리 무스와 타 크롤리 무스를 나타냅니다. 주 타 크롤리 무스와 내부 표준 물질 피크의 앞에 용출 피크가 로타 머 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 주제 검량선. 일본어 프린트 아웃 질량 분석 소프트웨어에 의해 생성 된 바와 같이 도시된다.424 / 52424fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 대표 이온 크로마토 그램 (이온 억제 / 이온 기능 향상). 화살표는 타 크롤리 무스 피크의 유지 시간을 표시하는 잠재적 인 매트릭스 효과를 평가하기 위해 추출 된 빈 혈액 샘플의 후 열 타 크롤리 무스의 주입하고 주입하는 동안 측정. 매트릭스 효과는 시험 46에 근거하여 실시 하였다. 효과가 발견 된 어떤 관련 행렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하여 주시기 바랍니다.
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Discussion
전술 한 바와 같이, 건조 혈액 반점에 기초 치료약 및 타 크롤리 무스의 부착 모니터링 개념 매력적이며, 비록 전형적 정맥 EDTA 전혈 샘플에 타크로리무스의 LC-MS / MS 분석과 연관된 넘어 분석 과제가있다. 이들은 다음을 포함하지만, 여기에 사용되는 행렬은 필터 카드 재료와 저 혈량 (20 μL)의 코튼 린터 재료에 담가 모세관 전혈 사실, 이에 한정되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 중앙 연구소에서 높은 처리량 분석은 강력한 특이적이고 고감도 LC-MS / MS 분석과 조합하여 매트릭스 간섭 및 매트릭스 효과 부족 시료 결과 빠르고 신뢰할 추출 방법을 필요로한다. 이미 천공 필터 카드 추출 / LC-MS / MS 분석이 실패 할 경우 재분석 방치에 충분한 재료는 일반적으로이없는 분석의 신뢰성은 중요하다.
Fi를본 연구에 사용 된 LTER 카드는 이러한 FDA의 승인 클래스 II 장치이기 때문에, NCCLS 지침 LA4-A5 (44)을 준수하고 CE 마크 유럽에 선택되었다 (제조 업체의 자세한 내용은, 재료 목록을 참조하십시오). 완전히 충전되면, 와트 903 필터 카드에 하나 원은 보유 ≈50 혈액 46 μL. 그러나, 개개의 환자에 의해 수집 된 혈액 방울의 크기는 다양하고 적절한 샘플링 기술 훈련이 필수적이다 (46).
혈액 자리 샘플 건조 펀치 아웃을 추출의 첫 번째 중요한 단계는 균질화입니다. 우리의 경험에 기초하여, 탄환 블렌더를 사용하면보다 효율적으로 초음파 및 추출 효율을 향상시키기 위해 사용되는 다른 방법들보다 더 재현. 탄환 믹서의 사용은 일관되게 90 % 이상 추출 회수율을 달성하기 위해 필수적이다. 추출 공정의 안정성을 위해, 모든 원심 temperat이되었는지 확인하는 것도 중요URE 제어 (4 ℃로)와 소용돌이로 교반 단계는 더 많은 변수 낮은 추출 회복의 결과보다 짧은 10 분, 아니었다. 또한, 타 크롤리 무스 복구 단백질 침전 용액의 정확한 조성에 매우 민감로서 메탄올 / ZnSO 4 비율이 변경되지 않는다는 것이 중요하다.
다음 과제는 매트릭스 간섭 효과를 일으킬 수 있습니다 재료의 이상적없는 깨끗한 추출물을 얻는 것입니다. 따라서, 자주 EDTA 혈액 샘플에서 타크로리무스의 추출에 사용되는 간단한 원스텝 단백질 침전 단계는 실행 가능한 옵션으로 간주되지 않았다. 단백질 (동위 원소 표지 된 내부 표준 물질을 첨가 포함) ZnSO 4를 사용하여 침전 텍싱 및 원심 분리 후, 상청액을 HPLC 2D 시스템과 온라인으로 추출 컬럼에 주입 하였다. 간단한 6 포트를 사용하여, 종래의 프리 카트리지 컬럼에 5 ㎖ / 분의 높은 흐름을 이용한 온라인 열 추출타 크롤리 무스의 분석을위한 전환 밸브 (47)는 이전에 설명되었다. 그 타 크롤리 무스 및 내부 표준 물질은 추출 컬럼의 전방에서 농축하고 정리 단계 중에 열을 통해 이동하지 않도록 이동상 선택되었다. 본 프로토콜에 사용되는 온라인 추출 부정적인 HPLC 분석에 영향을 미치지 않고 상대적으로 큰 샘플 부피의 주입 등 여러 장점을 가지고 있었다. 추출 컬럼의 상단에 분석을 풍부 후 백 플러시 ( "초점 피크") 특히 낮은 타 크롤리 무스의 농도와 샘플 소프트웨어 알고리즘에 의해보다 안정적인 통합을 가능하게 선명 피크의 결과. (48) 온라인 정리 단계는 제거하지 않았다 잠재적 매트릭스 화합물을 방해 할뿐만 아니라 시료를 탈 소금. 고용량, 고 스루풋 LC-MS / MS 분석을위한 또 하나의 중요한 문제는 거의 언급하지 인해 증가에 LC-MS / MS 시스템의 감도의 점진적인 손실대규모 배치의 분석 기간 동안 전기 분무 소스의 오염. 유의 매트릭스 효과 (이온 억제 / 이온 향상)는 관찰되지 않았다. 잠재적 인 매트릭스 효과의 부정적인 효과의 조합에 의해 / 감소를 피할 않은 다음 : 16,000 XG, 높은 흐름 온라인으로 추출, 잠재적 인 간섭 초기 용출에서 타 크롤리 무스의 명확한 크로마토 그래피 분리에 단백질 침전 후 메탄올 / ZnSO 4, 원심 분리를 이용하여 효과적인 단백질 침전 분석 컬럼 대신 같은 아스코 마이신과 같은 구조적으로 관련된 내부 표준 물질의 내부 표준으로 동위 원소 표지 된 타 크롤리 무스의 사용에서.
정량의 하한은 1 NG / ㎖, 현재 자주 EDTA 혈액 샘플 치료약의 타크로리무스 모니터링을 위해 사용되는 대부분의 면역 따라서보다 낮았다. 정량이 하한은 심지어 소위 낮은 칼시 뉴린 억제제 장기 immunosuppres 충분하다시브 유지 관리 프로토콜.
건조 블러드에 타 크롤리 무스를 정량화하기 이전에 설명한 LC-MS / MS 분석과 비교 29-34,36,39,41,42, 본 분석 일치하는 점이나 낮은 정량 한계, 추출 복구, 정확성의 측면에서 성능을 초과 정밀도와 같은 보통 건강한 사람의 혈액 샘플에 기초하여 검증하는 동안 수용 가능한 결과를 제공 한 단계 단백질 침전 방법 및 초단 크로마토 시간, 잠재적으로 위험한 개념 피해서. 그러나 이식 환자는 혈액의 구성에 영향을 미치는 사람이 여러 약물을 복용 질병을 가진 환자의 매우 복잡한 그룹입니다. 이것은 사실상 불가능 검증으로 개별 환자에 존재하고 만 가능한 전략은 그러한 잠재적 간섭의 위험을 최소화하는 방식으로 분석을 설정할 수도있다 모든 잠재적 인 간섭을 배제 할 수있다. 말린 혈액 SPOTS는 혈액 점도의 적혈구 용적률의 효과 때문에 여과지 49에 적용되는 혈액의 확산 특성과 같은 문제가있다. 이러한 효과는 이미 임상 적으로 합리적인 제한 29,32 내의 적혈구 용적률 및 타 크롤리 무스의 농도에서 건조 혈액 명소에서 타 크롤리 무스 분석에 영향을 미치지 않도록 기재되어있다 이것은 다시 여기에 테스트되지 않았습니다. 높은 온도에서 건조 혈액 명소에서 타 크롤리 무스의 또한 안정성이 이미 건조 혈액 명소에서 다른 사람과 타 크롤리 무스에 의해 연구되어왔다 건조 혈액의 선적을위한 중요한에도 60 ° C (32), 37 ℃에서 5 일간 안정 및 밝혀졌다 특히 여름 동안하지 온도 제어 조건에서 관광 명소입니다.
탄환 블렌더 균질화의 조합에 기초하여 상기 분석은, 높은 열 흐름 온라인 정리 및 LC-MS / MS 분석은 다른 IMM의 정량 생체 시료 분석법의 개발 플랫폼 전략을 제공 할 수있다단독으로 또는 동시에뿐만 아니라, 건조 혈액 자리 샘플에서 다른 약물의 unosuppressants.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 | |
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V | |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q | |
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Isopropanol 99.9%, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Methanol Optima LC/MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Water Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μl pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μl pipet tips with filter | Multimax | 2938T | |
| 200 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μl inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 | |
| Glass v ials, 4 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Glass vials, 20 ml | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Needle, 18 G 1.5 | Precision Glide | 305196 | |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 | |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 | |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| Tandem Mass Spectrometer | |||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 | |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
References
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