Abstract
Den calcineurinhæmmer tacrolimus er hjørnestenen i de fleste immunosuppressive behandling protokoller efter organtransplantation i USA. Tacrolimus er et snævert terapeutisk indeks narkotika, og som sådan kræver terapeutisk drug monitorering og dosisjustering baseret på hele dens blod dalkoncentrationer. For at lette hjem terapeutisk lægemiddel og overholdelse overvågning, indsamling af tørrede blodpletter er en attraktiv koncept. Efter en finger stick, patienten samler en bloddråbe på filterpapir derhjemme. Efter blodet tørres, er det sendt til analyselaboratoriet hvor tacrolimus kvantificeres ved hjælp af høj-performance væskekromatografi-tandem-massespektrometri (HPLC-MS / MS) i kombination med en enkel manuel protein udfældningstrin og online kolonne ekstraktion.
For tacrolimus analyse, er en 6-mm plade udstanset fra mættet centrum af blodet stedet. Blodet stedet homogeniseres ved hjælp af en blender bullet and derefter proteiner udfældes med methanol / 0,2 M ZnSO4 indeholdende den interne standard D 2, 13 C-tacrolimus. Efter hvirvelblanding og centrifugering 100 pi supernatant injiceres i et online ekstraktion søjle og vasket med 5 ml / min på 0,1 myresyre / acetonitril (7: 3, vol: vol) i 1 min. I det følgende er skifteventilen aktiveret og analysander back-skyllet på den analytiske søjle (og separeret under anvendelse af en 0,1% myresyre / acetonitrilgradient). Tacrolimus er kvantificeret i den positive multi reaktionsmåden (MRM) med en tandem-massespektrometer.
Assayet er lineært fra 1 til 50 ng / ml. Inter-assay variation (3,6% -6,1%) og nøjagtighed (91,7% -101,6%) som vurderes over 20 dage mødes godkendelseskriterier. Gennemsnitlig udvinding opsving er 95,5%. Der er ingen relevant overførsel, matrix interferens og matrix effekter. Tacrolimus er stabil i tørrede blodpletter ved stuetemperatur og ved +4 ° C i 1 uge. Ekstraherede prøver iautosampler er stabile ved 4 ° C i mindst 72 timer.
Introduction
Tacrolimus er en potent immonosuppressant 1-7, der har en makrolidstruktur 8 (figur 1). På grund af cis - trans isomeri af KN obligationer det danner to rotamerer i opløsning 9, der kan adskilles ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC) Tacrolimus er lipofilt og opløselig i alkoholer (methanol: 653 g / l, ethanol: 355 g / L), halogenerede carbonhydrider (chloroform: 573 g / l) og ether. Det er tungt opløseligt i alifatiske carbonhydrider (hexan: 0,1 g / L og vand (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 Molekylet indeholder ikke nogen kromofor og dens maksimale UV-absorption er 192 nm Tacrolimus virker via hæmning af calcineurin. . Dens virkningsmekanisme er blevet revideret i referencerne 10,11. Det er i øjeblikket anvendes i mere end 80% af fast-organtransplanterede patienter i USA 12.
Det terapeutiske indeks af tacrolimus er begynder at betragted til at være smalt 13. Hertil kommer, at sammenhængen mellem tacrolimus doser og koncentrationer i blodet er dårlig og farmakokinetik er variabel 14,15. Terapeutisk drug monitorering til at vejlede tacrolimus dosering hos transplanterede patienter er derfor almindelig klinisk praksis 16-20. Målet er at holde koncentrationen tacrolimus i blodet inden for en foruddefineret terapeutiske område. Tacrolimus blod koncentrationer under det terapeutiske område kan resultere i øget aktivitet af kroniske eller akutte allo-immune reaktioner, mens koncentrationer over det terapeutiske vindue øge risikoen for over-immunosuppression, kræft og toksiciteter, såsom nefrotoksicitet, neurotoksicitet, forhøjet blodtryk og diabetes. Høj farmakokinetisk intraindividuelle variation af tacrolimus kan være til skade for både transplantation orgel og patientoverlevelse 21,22. Mens inter-individuel variation af tacrolimus farmakokinetik hovedsageligt er forårsaget af CYP3A5 polymorfier, årsager til intra-individuellevariabilitet omfatter, men er ikke begrænset til, lægemiddel-lægemiddel, sygdomsfremkaldende narkotika og mad-lægemiddelinteraktioner 14,15. Også mangel på overholdelse af immunosuppressive terapeutisk lægemiddel regime er en medvirkende faktor, og en væsentlig årsag til graft tab 23,24.
Disse overvejelser antyder, at hyppig hjem terapeutisk lægemiddel og overholdelse overvågning af tacrolimus hele blodkoncentrationer kan være gavnligt at sikre, at patienter har tacrolimus eksponering inden for det ønskede terapeutiske vindue på alle tidspunkter. Logistik og udgifter til hyppigere terapeutisk lægemiddelmonitorering som det er dog gældende klinisk praksis 15 er uoverkommelige. En af grundene er, at patienten har for at se en bioanalytikeren at have den krævede venøs blodprøve trukket. Tørrede blodpletter har for nylig vist sig som en attraktiv koncept 25-28. Efter en simpel finger stick patienten samler en bloddråbe på et særligt filter papir kort, og efter blod plet har dRied, kan det blive sendt til et centralt laboratorium til analyse af tacrolimus og alle andre immunundertrykkende at patienten aktuelt kan tage. Dette er blevet muligt på grund af udvikling af meget følsomme og specifikke LC-MS / MS analyser til kvantificering af tacrolimus og andre immunosuppressiva i meget små mængder blod, såsom tørrede blodpletter (typisk 20 pi blod) 25,29-43. En anden fordel er, at minimalt invasive og lave indsamlingsstrategier volumen prøve, såsom tørrede blodpletter i høj grad lette terapeutisk lægemiddel overvågning og farmakokinetiske undersøgelser hos små børn 28.
Tacrolimus måles normalt i venøst EDTA fuldblod 15. Årsager er, at tacrolimus i udstrakt grad fordeles i blodlegemer, og at kliniske undersøgelser har rapporteret bedre sammenhæng mellem tacrolimus trough-koncentrationer i blodet end i plasma med kliniske hændelser 15,18. Til sammenligning analysen af tacrolimus i tørrede blodpletter er baseret på kapillærblod der er blandet med filtrerpapiret matrix. Dette giver udfordringer i forhold til opløsning af tacrolimus og potentielle interferenser med LC-MS / MS-analyse. Vi præsenterer her en etableret og valideret assay baseret på homogenisering af tørret blod stedet ved hjælp en kugle blender i kombination med et højt flow online kolonne prøve rense procedure og LC-MS / MS-analyse. Som i dag, har denne analyse med succes været anvendt til kvantificering af mere end fem tusinde tacrolimus tørret blod stikprøver for at overholde overvågning i kliniske forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De-identificerede blodprøver fra raske individer var fra University of Colorado Hospital (Aurora, Colorado). Brugen af de-identificerede blod bank prøver til valideringsundersøgelser samt til udarbejdelse af kalibratorer og kvalitet kontrolprøver blev betragtet som "fritaget" af Colorado Multi-institutionelle Review Board (COMIRB, Aurora, Colorado).
1. Udarbejdelse af referencer og løsninger
- Indkøb tacrolimus og den interne standard D 2, 13C-tacrolimus fra kreditorer, der er anført i Materialer List.
- Forbered stamopløsninger i ren methanol ved en koncentration på 1 mg / ml for tacrolimus og en koncentration på 10 ug / ml for D2, 13C-tacrolimus. Gøre stamopløsninger af referencematerialer baseret på tre uafhængige vægtninger. Alikvote stamopløsninger og opbevares ved -70 ° C eller derunder.
- Forbered løsning til udfældning proteinerog udtrække tacrolimus anvendelse af methanol / 0,2 M ZnSO4 i vand (7: 3, vol: vol). Denne opløsning indeholder også den interne standard D 2, 13 C-tacrolimus i en koncentration på 2,5 ng / ml og anvendes til udvinding af alle prøver undtagen til udvinding af blindprøver (se 1.3.3).
- Forberede denne proteinudfældning opløsning frisk på hver ekstraktion dag og indstil udløbet af opløsningen ved 12 timer.
- Udarbejdelse af kalibreringskurven og kvalitetskontrol (QC) prøver
- Forbered stamopløsninger af tacrolimus ved at udføre passende fortyndinger af stamopløsningen med ren methanol.
- For at forberede kalibratorer og kontrolprøver kvalitet, spike 20 pi passende fortyndet stamopløsning i EDTA fuldblod, inkuberes ved 37 ° C under forsigtig omrystning i et vandbad for at tillade homogen fordeling af tacrolimus i det cellulære blodkomponenter til 20 minutter og alikvot i 1,5 ml polypropylene rør med konisk bund og snap-on låg. Sørg for, at den relative mængde af organisk opløsningsmiddel ikke overstiger 5%.
- Spot 50 pi af den spikede fuldblod i midten af hver cirkel på filterkort ved hjælp af en pipette.
- Tør blod pletter på filterkort ved stuetemperatur i 3 timer.
- Forbered tacrolimus kalibreringsstandarder i humant EDTA fuldblod ved tacrolimus koncentrationer på 1, 2,5, 5, 10, 25, og 50 ng / ml. En blindprøve til ekstraktion ligesom kalibreringsstandarder med proteinudfældelse opløsning indeholdende den interne standard D 2, 13 C-tacrolimus ("nul prøve") udarbejde.
- Forbered QC prøver i humant EDTA fuldblod i koncentrationer på 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. En blindprøve forberede. I modsætning til QC prøver, der er ekstraheret med nedbør indeholder intern standard D 2, 13C-tacrolimus, udtrække denne blindprøve med protein nedbør løsning, der gørikke indeholder den interne standard D 2, 13 C-tacrolimus ("blindprøve").
- Indsamling af kliniske prøver
- Saml tørrede blodpletter, som beskrevet i 43,44.
2. Ekstraktion af Tacrolimus tørret blod stikprøver
- Visuel kontrol af tørret blod stedet for at sikre acceptabel prøve kvalitet og volumen 45.
- Punch centrum af blodet plet på filteret kort med en 6-mm hul punch.
Bemærk: Kvaliteten af stemplerne kan overvåges ved vejning. En udstanset mættet filterskiven vejer i gennemsnit 5,02 mg ± 0,09 mg (interval: 4.83- 5.14 mg, n = 12). - Placer diske i 1,5 ml polypropylen rør med konisk bund og snap-on låg.
- Føj 20-30 kugler til hvert rør.
- Der tilsættes 500 pi af proteinudfældning opløsning (methanol: 0,2 M ZnSO4, 7: 3, vol: vol med 2,5 ng / ml intern standard) i hvert rør. For Udvindingvirkning af blindprøver, bruge proteinudfældelse løsning uden den interne standard.
- Homogenisere skiverne i blenderen kugle i 1 min (maksimal hastighed, indstilling "10").
- Ryst prøver ved RT på multi-tube vortex (maksimal hastighed, indstilling "10") i 10 min.
- Centrifuger prøverne ved 16.000 xg og 4 ° C i 10 minutter.
- Overfør supernatanterne i glas HPLC-hætteglas udstyret med en 300 ul insert. Brug præskåret Teflon sæler.
Note: ekstraherede prøver kan opbevares ved -20 ° C eller derunder, indtil LC-MS / MS-analyse.
3. LC-MS / MS-analyse
- Load 100 pi af supernatanten af den ekstraherede prøve onto C8 patron ekstraktion kolonne og vaskes med en 7: 3-forhold på 0,1% myresyre i vand: acetonitril ved en strømningshastighed på 5 ml / minut i 1 min. Tilslutningerne af skifteventilen er vist i figur 2 og gradienten køre ved udvinding pumpen i tabel 1
- Herefter aktiverer skifteventilen resulterer i returskylning af analytter fra forkolonne på den analytiske kolonne.
- Indstil kolonnen termostaten til 65 ° C.
- Eluere analytter fra den analytiske søjle ved anvendelse af strømningshastigheder og gradient vist i tabel 1.
- Forbind analytisk kolonne til en tandem massespektrometer via turbo elektrosprayionisering kilde. Juster nøgleparametre massespektrometret henhold til tabel 2.
- Detect positive ioner ([M + Na] +) i reaktionsmåden multiple (MRM). Brug følgende ion overgange til kvantificering: tacrolimus: m / z (masse / opladning) = 826,6 → 616,2 og D 2, 13C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2.
Bemærk: Den totale kørselstid er 4,6 minutter.
4. Kvantificering
- For hver kørsel, generere en kalibreringskurve baseret på kalibratorer udarbejdet i 1.3.5 ogomfatter i hvert analytisk kørsel.
- Generer en Kalibreringskurven afbildes nominelle koncentrationer versus respons faktor analyt (Peak Samarbejdsområde [analyt] / Peak Samarbejdsområde [intern standard]) ved hjælp af massespektrometer-softwaren.
- Monter kalibratorer ved hjælp af en kvadratisk pasform i kombination med 1 / X vægtning.
- Til mængde tacrolimus i de tørrede blodpletter integrere tacrolimus og intern standard toppene i ekstraheret MRM kromatogrammer. Beregn respons faktor for tacrolimus (Peak Samarbejdsområde [analyt] / Peak Samarbejdsområde [intern standard]) og sammenligne med kalibreringskurven ved hjælp af massespektrometri software.
5. valideringsprocedurer
- Nedre detektionsgrænse (LLOD) og nedre grænse for kvantificering (LLOQ).
- Overvej den laveste tacrolimuskoncentrationen med en top-til-støj-forhold på 4: 1 som den nedre grænse for detektion (LLOD). Definer den nedre grænse for kvantificering (LLOQ) somlaveste koncentration af kalibreringskurven med en nøjagtighed lig med eller bedre end ± 20% afvigelse fra den nominelle koncentration og præcision lig med eller bedre end 20% (varianskoefficient).
- Inden for og mellem dages nøjagtighed og præciseringer.
- Test nøjagtighed og præcision ved fire koncentrationer af 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) og 40 ng / ml (QC4).
- Forbered QC prøver på hver validering dag i humant EDTA fuldblod, tørt på filterkort, ekstrakt, og analysere som beskrevet ovenfor.
- Bestem intra-dages nøjagtighed og præcision med 6 prøver pr QC koncentrationsniveau.
- Vurdere inter-dages nøjagtighed og præcision i løbet af 20 dage. Mål hver QC niveau med 4 prøver hver dag.
- Analyser to kalibreringskurver sammen med QC prøver på hver dag.
- Beregn inden for dagen nøjagtighed som% af den nominelle koncentration (seks prøver pr koncentrationsniveau, se 5.2.2). CalcUlate præcision som koefficienten af varians (CV%).
- Overvej inden for dagen nøjagtighed acceptabelt, hvis det falder i accepten begrænser 85% til 115% af den nominelle koncentration. Overvej inden for dagen præcision acceptabelt, hvis det er lig med eller bedre end et CV (varianskoefficient) på 15%.
- Beregn inter-dages nøjagtighed og præcision som middelværdien for hvert QC koncentrationsniveau analyseret i løbet af de 20 validering dage.
- Overvej gennemsnitlige inter-dages nøjagtighed acceptabelt, hvis det falder i accepten begrænser 85% til 115% af den nominelle koncentration. Overvej inter-dag præcision acceptabelt, hvis det er lig med eller bedre end en CV (varianskoefficient) på 15%.
- Udelukkelse af matrix interferens.
- For udelukkelse af interferenser, der kan være forårsaget af matrix-signaler, analysere tomme tørrede blodpletter (8 forskellige individer, helst 4 hanner og 4 hunner).
- Efterse ion kromatogrammer. Hvis toppe inden retentionstidenvindue af tacrolimus er opdaget, integrere og sammenligne deres områder under kurven med de tacrolimus toppe i blindprøver tilsat tacrolimus på LLOQ. Det område af toppe i blindprøver er ikke meningen at overstige 15% af dem, af tacrolimus på LLOQ.
- Ion undertrykkelse / ion ekstraudstyr.
- Brug en post-kolonne infusion protokol som beskrevet 45 for at vurdere potentielle forstyrrelser af ion undertrykkelse / ion ekstraudstyr forårsaget af medeluering matrixkomponenter.
- Infunderes tacrolimus i en koncentration på 10 ug / ml opløst i 0,1% myresyre: methanol (30:70, v / v) post-søjle ved en hastighed på 10 ul / min.
- Tilslut en sprøjtepumpe via T-stykke mellem analytisk søjle og elektrospray kilde til massespektrometeret.
- Overvåg MS / MS signal intensitet MRM overgange for tacrolimus og dens interne standard (m / z = 826,6 → 616,2 og m / z = 829,6 → 619,2) efter injektion af ekstraktionted blindprøver (n = 8 prøver fra forskellige individer).
Bemærk: I mangel af ion suppression / ion enhancement den kontinuerlige signal forårsaget af infusion af analytter ikke bør påvirkes ved indsprøjtning af matrixblindprøve, mens ion suppression forårsager en dip af signalet og ion enhancement et højdepunkt.
- Carry-over.
- Vurdere potentielle fremførsel ved at analysere udvindes blindprøver efter de højeste kalibratorer (50 ng / ml, n = 6).
- Efterse ion kromatogrammer. Hvis der registreres toppe inden retentionstiden vindue af tacrolimus, integrere og sammenligne deres områder under kurven med de tacrolimus toppe i blindprøver tilsat tacrolimus på LLOQ. Det område af toppe i blindprøver er ikke meningen at overstige 15% af dem, af tacrolimus på LLOQ.
- Ekstraktion inddrivelser.
- Bestem inddrivelser ved at sammenligne signalerne fra analytter efter udvinding af QC Sampler på alle fire koncentrationsniveauer (n = 6 pr koncentration) med de tomme tørrede blodpletter tilsat de tilsvarende beløb af tacrolimus efter udvinding.
- Forbered fire sæt QC'er (koncentrationsniveauer: 2, 4, 20, 40 ng / ml).
- Forbered anden 4 sæt af tilsvarende "Genfindingstest prøver" ved at afdække 50 pi tomt EDTA fuldblod på filtrerpapiret kortene og tørring i 2 timer.
- Herefter, for både QC og tomme "recovery test prøver", skåret ud hele blod plet på filteret kort med en saks og placere de resulterende skiver ind i et rør af polypropylen med konisk bund og snap-on låg.
- Uddrag alle prøver.
- Overfør supernatanterne (400 pi) i glas HPLC-hætteglas.
- Tilføj tacrolimus stamopløsning til de tomme "udvundet recovery test prøver" at nå koncentrationer på 2, 4, 20 og 40 ng / ml (4 pi 200, 400, 2.000, 4.000 ng / ml tacrolimus lager solutions til 400 pi supernatant).
- Efter LC-MS / MS-analyse, sammenligne signalerne i både QC prøver og "recovery testprøver" af den tilsvarende koncentration (recovery% = signaleksempleringer tilsat før ekstraktion / signaleksempleringer tilsat efter ekstraktion x 100).
- Fortynding integritet.
- Etablere fortynding integritet ved hjælp af prøver tilsat analytterne ved 500, 250 og 100 ng / ml.
- Efter ekstraktion fortyndes prøver ved anvendelse proteinpræcipitation opløsning (1:10, n = 3 pr koncentrationsniveau).
- Beregn afvigelser fra de nominelle koncentrationer. Overveje resultater, der falder inden for 85% -115% af den nominelle acceptabel.
- Stabiliteter.
- Undersøg stabiliteter ved hjælp af QC prøver på alle fire koncentrationsniveauer (n = 4 pr koncentration) analyseret på forskellige tidspunkter og under de forskellige opbevaringsbetingelser.
- Sammenligne resultater efter opbevaring med de nominelle værdier. Overvej rESULTATER, der falder inden for 85% -115% af den nominelle acceptabel.
- Indføre prøven stabilitet i 1 uge ved stuetemperatur, 1 uge ved 4 ° C, 1 måned ved -20 ° C og 1 måned ved -80 ° C.
- Test fryse-tø stabilitet over tre cykler (-20 ° C). Test ekstraherede prøve og autosampler stabilitet ved at placere prøver i termostateret autosampler justeret til 4 ° C. Injicere prøver efter 72 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative ionchromatogrammer af en blindprøve, en prøve tilsat ved den nedre grænse for kvantificering og en patientprøve er vist i figur 3.
Kalibreringskurver
Den nedre detektionsgrænse var 0,5 ng / ml og den nedre grænse for kvantificering var 1,0 ng / ml. Halvtreds ng / ml blev valgt som den højeste kalibrator som er usandsynligt, at blive nået i klinikken under normale omstændigheder højere koncentrationer.
Kalibreringskurver blev frisk fremstillet hver validering dag i humant EDTA fuldblod, tørret på filterkort og ekstraheret med methanol / 0,2 M ZnSO4 (70:30 vol / vol) + intern standard (slutkoncentration af intern standard: 2,5 ng / ml ). For dag 1 validering (n = 6 for kalibratorer og n = 6 for QC niveau) og for dag 2 - 20 (n = 2 for kalibratorer og n = 4 for hver QC-niveau) blev analyseret med koncentrationer 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 ng / ml for calibpå håndværkere. En typisk kalibreringskurve er vist i figur 4. Mean nøjagtighed på 85% til 115% af den nominelle, inden for arbejdsområdet for 2/3 af kalibratorer (med et minimum af 6 nul kalibratorer) blev anset for acceptabel. Den gennemsnitlige korrelationskoefficient var (R) = 0,999 (n = 40 kalibreringskurver).
Nøjagtighed og præciseringer
Resultaterne er vist i detaljer i tabel 3.
Ekstraktion Recovery
Gennemsnitlige udvinding tilbagebetalinger var 98,2% (2 ng / ml), 92,2 (4 ng / ml), 95,5 (20 ng / ml), 96,2 (40 ng / ml).
Matrix Interferens, Ion Suppression / Ion Enhancement Test Brug af kontinuerlig Post-kolonne Infusion og Carry-over
Analyse af blindprøver fra otte forskellige individer (n = 4 kvinder og n = 4 mandlige) viste signaler mindre end 15% af LLOQ (1 ng / ml) ved retentionstiden svarende tiltacrolimus peak indikerer, at den detekterede tacrolimus peak kan betragtes som specifik. Et repræsentativt eksempel er vist i figur 3. Eventuelle interferenser ved ion suppression / ion enhancement blev testet ved anvendelse datoer tørrede blodprøver fra otte forskellige raske individer. Et repræsentativt eksperiment er vist i figur 5. Ingen tegn på betydelig ion suppression / ion forbedring blev observeret. Ingen relevante fremførsel resulterer i toppe, der overstiger 15% af signalet ved LLOQ blev påvist.
Fortynding Integritet
Fortynding integritet blev undersøgt ved at analysere prøver fremstillet ved koncentrationer over den højeste kalibrator (100, 250 og 500 ng / ml) og fortyndet 1:10 i proteinpræcipitation opløsning efter ekstraktion for at nå målet koncentrationer af: 10, 25 og 50 ng / ml. Mean nøjagtigheder måtte falde inden for de acceptkriterier på 85% til 115% af de nominelle koncentrationer. Alle fortyndinger TESTed mødte godkendelseskriterier (tabel 4).
Stabiliteter
Stabilitet af tacrolimus i tørrede blodpletter blev undersøgt ved at analysere QC prøver på alle fire niveauer (n = 4 / koncentration niveau), som blev opbevaret under varierende forhold.
Mean nøjagtigheder måtte falde inden for de acceptkriterier på 85% til 115% af de nominelle koncentrationer. Resultaterne er vist i detaljer i tabel 5. Ingen tab efter 1 uges opbevaring ved stuetemperatur, efter 1 uges opbevaring ved 4 ° C, efter 1 måneds opbevaring ved -20 ° C, efter 1 måneds opbevaring ved -80 ° C, efter 3 fryse og tø cykler, og efter 72 timer af udtrukne prøver i auto sampler ved 4 ° C var synlige.
| Ekstraktionspumpe | Analytisk (eluering) Pump | ||||||
| Vand + 0,1% myresyre | Acetonitril | Strømningshastighed [pl / min] | [Min] | Vand + 0,1% myresyre | Acetonitril | Strømningshastighed [pl / min] | |
| 0 | 70 | 30 | 5.000 | 0 | 13 | 87 | 1.000 |
| 1 | 70 | 30 | 5.000 | 2 | 2 | 98 | 1.200 |
| 1.1 | 2 | 98 | 100 | 3,5 | 2 | 98 | 1.200 |
| 3 | 2 | 98 | 100 | 3.6 | 13 | 87 | 1.000 |
| 3.1 | 20 | 80 | 2.000 | 4.6 | 13 | 87 | 1.000 |
| 4 | 70 | 30 | 5.000 | ||||
| 4.6 | 70 | 30 | 5.000 | ||||
Tabel 1. Gradient Program for Udvinding og Analytisk HPLC Pumper.
| Parameter | Indstilling |
| Kollision gas (CAD) | 10 |
| Curtain gas (CUR) (psi) | 30 |
| Ion Source gas 1 (GS1) (psi) | 50 |
| Ionkilde gas 2 (GS2) (psi) | 30 |
| Nebulizer strøm (NC) (V) | 1 |
| Temperatur (TEM) (° C) 600 | |
| IonSpray Voltage (IS) (V) | 5500 |
| Grænseflade varmer (IHE) | På |
| Declustering potentiale (DP) (V) | 136 |
| Indgang potentiale (EP) (V) | 10 |
| Kollision energi (CE) (V) | 47 |
| Kollisionscelle exit potentiale (CXP) (V) | 16 |
Tabel 2. Turbo Elektrospray Interface og massespektrometer Parametre. Nomenklaturen svarer til den, der anvendes i massespektrometri software (for detaljer producenten, se venligst Materialer List).
| Validering Day | QC Level [% af den nominelle koncentration] | |||
| 2 | 4 | 20 | 40 | |
| Dag 1 | 93.0 | 86.3 | 88,9 | 93,4 |
| 101 | 90,4 | 95,3 | 100 | |
| 85.6 | 95,9 | 99,0 | 97,5 | |
| 88,6 | 93,6 | 105 | 103 | |
| 85.0 | 97,4 | 97,2 | 109 | |
| 89.1 | 96,7 | 100 | 101 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 90,4 | 93,4 | 97.6 | 100,7 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 6.6 | 4.6 | 5.5 | 5.2 |
| Dag 2 | 92,8 | 86,0 | 103 | |
| 91.1 | 88.8 | 94,7 | 87,0 | |
| 88,6 | 90.9 | 92,8 | 94,2 | |
| 97,2 | 93,7 | 94,2 | 115 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 92,4 | 89,9 | 96,2 | 97,9 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 3.9 | 3.6 | 4.8 | 12.2 |
| Dag 3 | 97.6 | 101 | 98,4 | 112 |
| 104 | 85.6 | 102 | 110 | |
| 99,2 | 88.4 | 99,4 | 105 | |
| 96,3 | 87.2 | 108 | 117 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 99,3 | 90,6 102,0 | 111,0 | |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 3.4 | 7.8 | 4.2 | 4,5 |
| Dag 4 | 95,2 | 88,6 | 112 | 94,5 |
| 105 | 87,3 | 93,2 | 116 | |
| 99,8 | 96,2 | 103 | 103 | |
| 100 | 104 | 97,2 | 99,4 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 100,0 | 94,0 | 101,4 | 103.2 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 4.0 | 8.2 | 8.1 | 8.9 |
| Dag 5 | 106 | 90,4 | 101 | 106 |
| 108 | 89,0 | <td> 106100 | ||
| 102 | 101 | 96.6 | 128 | |
| 105 | 88.8 | 105 | 107 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 105,3 | 92,3 | 102.2 | 110,3 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 2.4 | 6.3 | 4.2 | 11.1 |
| Dag 6 | 90.9 | 93,7 | 119 | 106 |
| 98,8 | 88,1 | 96.4 | 110 | |
| 94.6 | 96,3 | 99,1 | 108 | |
| 108 | 100 | 102 | 102 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 98,1 | 94,5 | 104,1 | 106,5 |
| 7.5 | 5.3 | 9.8 | 3.2 | |
| Dag 7 | 85.1 | 87,5 | 99,5 | 95,4 |
| 86.4 | 85.4 | 94,7 | 101 | |
| 94,5 | 87,3 | 98,9 | 94.6 | |
| 85,5 | 97.0 | 101 | 99,6 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 87,9 | 89.3 | 98,5 | 97,7 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 5.1 | 5.8 | 2.7 | 3.2 |
| Dag 8 | 86.1 | 92,5 | 91,9 | 102 |
| 87,5 | 91,5 | 95,2 | 88,5 | |
| 115 | 85.6 | 92,1 | 102 | |
| 85,8 | 85,9 | 95,4 | 108 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 93,6 | 88,9 | 93,7 | 100,1 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 15.3 | 4.1 | 2,0 | 8.2 |
| Dag 9 | 88,9 | 91.4 | 96.9 | 100 |
| 90.0 | 89,8 | 95.0 | 100 | |
| 69,7 | 85,9 | 95,8 | 109 | |
| 91,9 | 87,0 | 105 | 101 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 85.1 | 88,5 | 98,2 | 102,5 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 12.2 | 2.9 | 4.7 | 4.3 |
| Dag 10 | 90.9 | 91,3 | 96,2 | 100 |
| 97,7 | 89,5 | 94.4 | 100 | |
| 99,9 | 109 | 98,7 | 96,8 | |
| 99,1 | 90.0 | 95,7 | 96.1 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 96.9 | 95.0 | 96,3 | 98,2 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 4.2 | 9.9 | 1.9 | 2.1 |
| Dag 11 | 92,7 | 91,9 | 88.2 | 104 |
| 96.6 | 91,2 | 97.0 | 110 | |
| 109,0 | 92,8 | 970,6 | 102 | |
| 98,3 | 107 | 93,7 | 111 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 99,2 | 95,7 | 94,1 | 106,8 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 7,0 | 7.9 | 4.6 | 4.1 |
| Dag 12 | 87,7 | 85,5 | 105 | 95,3 |
| 112 | 88,1 | 101 | 96.1 | |
| 102 | 89.1 | 89,7 | 97,5 | |
| 106 | 92,5 | 102 | 104 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 101,9 | 88.8 | 99,4 | 98,2 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 10.1 | 3.3 | 6.7 | 4.0 |
| Dag 13 | Mislykkedes | 85,7 | 93,3 | 102 |
| 101 | 105 | 88,0 | 93,9 | |
| 112 | 98,0 | 91.4 | 102 | |
| 104 | 113 | 104 | 101 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 105,7 | 100,4 | 94,2 | 99,7 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 5.4 | 11.5 | 7.3 | 3.9 |
| Dag 14 | 91,5 | 89.1 | 97,4 | 93.1 |
| 90,4 | 87.1 | 93,9 | 99,8 | |
| 89,7 | 97.0 | 94,8 | 106 | |
| 97,4 | 86.8 | 89,9 | Mislykkedes | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 92,3 | 90.0 | 94,0 | 99,6 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 3.8 | 5.3 | 3.3 | 6.5 |
| Dag 15 | 92,8 | 92,8 | 92,5 | 95,4 |
| 97,5 | 96,3 | 96,2 | 95.5 | |
| 95.5 | 108 | 97,3 | 99,3 | |
| 110 | 109 | 115 | 113 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 99,0 | 101,5 | 100,3 | 100,8 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 7.7 | 8.1 | 10,0 | 8.3 |
| Dag 16 | 93,7 | 97,8 | 90,7 | 112 |
| 90,3 | 87.1 | Mislykkedes | 101 | |
| 97,9 | 88,3 | 95.5 | 107 | |
| 91.4 | 85,7 | 89.3 | 96,7 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 93,3 | 89,7 | 91.8 | 104,2 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 3.6 | 6.1 | 3,5 | 6.4 |
| Dag 17 | 88,0 | 86,0 | 93,7 | 103 |
| 89,8 | 90,8 | 94,8 | 93,2 | |
| 85,9 | 91.1 | 99,7 | 94,8 | |
| 86.7 | 88,1 | 95,6 | 91,7 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 87,6 | 89,0 | 96,0 | 95,7 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 1.9 | 2.7 | 2.7 | 5.3 |
| Dag 18 | 89,6 | 85,8 | 91.0 | 98,3 |
| 89,6 | 86.2 | 88,3 | 93,6 | |
| Mislykkedes | 86.7 | 96,8 | 104 | |
| 88,1 | 85,8 | 95,2 | 111 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 89.1 | 86.1 | 92,8 | 101,7 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 1,0 | 0,5 | 4.2 | 7.4 |
| Dag 19 | 98,0 </ td> | 89,7 | 94,2 | 102 |
| 88,3 | 86,0 | 97.6 | 102 | |
| 91,6 | 88,1 | 95,8 | 97,5 | |
| 90,7 | 90.1 | 92,8 | 88,3 | |
| Intra-dag Nøjagtighed [%] | 92,2 | 88,5 | 95,1 | 97,5 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 4,5 | 2.1 | 2.2 | 6.6 |
| Dag 20 | 93.0 | 87,0 | 99,4 | 101 |
| 97,3 | 87,6 | 95.5 | 91,9 | |
| 89,0 | 88.4 | 91,2 | 93,5 | |
| 104 | 90,7 | 97,7 | 115 | |
| Intra-dag Nøjagtighed[%] | 95,8 | 88.4 | 96,0 | 100,4 |
| Intra-Day Unøjagtighed [CV%] | 6.7 | 1.8 | 3.7 | 10.5 |
Inter-Day Nøjagtighed og Unøjagtighed | ||||
| Inter-dages Nøjagtighed | 95,2 | 91,7 | 97,2 | 101.6 |
| Inter-dag unøjagtighed | 6.1 | 4,5 | 3.6 | 4.2 |
Tabel 3. Resultater af Quality kontrolprøver over 20 dage. Data præsenteret som% af den nominelle. Prøver, der er anført som "ikke bestået" er prøver, der blev tabt til laboratoriet / instrument fejl. I de fleste cases, blev der ikke påvist toppe overhovedet eller den interne standard manglede.
| Fortynding | 01:10 |
| Nominel målkoncentration efter fortynding | 50 ng / ml |
| 98,6 | |
| 94,5 | |
| 91.4 | |
| Nøjagtighed [%] | 94,8 |
| Unøjagtighed [CV%] | 3.6 |
| Fortynding | 01:10 |
| Nominel målkoncentration efter fortynding | 10 ng / ml |
| 103 | |
| 99,5 | |
| 101 | |
| Nøjagtighed [%] | 101,2 |
| Unøjagtighed [CV%] | 1.8 |
| Fortynding | 01:10 |
| Nominel målkoncentration efter fortynding | 25 ng / ml |
| 91,7 | |
| 98,2 | |
| 103 | |
| Nøjagtighed [%] | 97.6 |
| Unøjagtighed [CV%] | 5.7 |
Tabel 4. Resultater af Fortynding Integritet Testing. Data præsenteret som% af den nominelle.
| En | ||||
| Stabilitet ved stuetemperatur, Dag 1 | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 91,9 | 85,8 | 86,0 | 102 | |
| 86.7 | 85,7 | 88,5 | 102 | |
| 86,0 | 85,9 | 90.1 | 103 | |
| 89,2 | 98,0 | 90,8 | 112 | |
| % Af den nominelle koncentration | 88,5 | 88,9 | 88,9 | 104,8 |
| Unøjagtighed [% CV] | 2.7 | 6.1 | 2.1 | 4.9 |
| Stabilitet ved stuetemperatur, Dag 3 | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 88,6 | 105 | 101 | 113 | |
| 94,1 | 100 | 98,5 | 103 | |
| 100 | 101 | 106 | 109 | |
| 99,5 | 102 | 102 | 108 | |
| % Af den nominelle koncentration | 95,6 | 102,0 | 101,9 | 108,3 |
| Unøjagtighed [% CV] | 5.3 | 2.2 | 3.1 | 4.1 |
| Stabilitet ved stuetemperatur, Dag 7 | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 105 | 103 | 91,7 | 109 | |
| 101 | 107 | 100 | 110 | |
| 102 | 108 | 107 | 105 | |
| 93,8 105 | 109 | 111 | ||
| % Af den nominelle koncentration | 100,5 | 105,8 | 101,9 | 108,8 |
| Unøjagtighed [% CV] | 4.7 | 2.2 | 7.8 | 2.6 |
| B | ||||
| Stabilitet ved +4 ° C, Dag 1 | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 101 | 89,9 | 95,8 | 100 | |
| 88,9 | 91.0 | 94,1 | 99,0 | |
| 96,2 | 100 | 102 | 96,7 | |
| 89,5 | 87.8 | 95,4 | 88,6 | |
| % Af den nominelle koncentration | 93,9 | 92,2 | 96,8 | 96.1 |
| Unøjagtighed [% CV] | 5.8 | 5.4 | 3,5 | 5.2 |
| Stabilitet ved +4 ° C, Dag 3 | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 85,2 | 105 | 95,3 | |
| Mislykkedes | 87.8 | 101 | 96 | |
| 101 | 88.8 | 89,6 | 97,5 | |
| 106 | 92,2 | 102 | 104 | |
| % Af den nominelle koncentration | 98,1 | 88,5 | 99,4 | 98,2 |
| Unøjagtighed [% CV] | 9.7 | 2.9 | 6.8 | 4.0 |
| Stabilitet ved +4 ° C, Dag 7 | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 94,0 | 98,5 | 96.1 | 110 | |
| 92,9 | 96.4 | 109 | 109 | |
| 91,7 | 96,3 | 97,9 | 115 | |
| 94,7 | 96.9 | 99,8 | 113 | |
| % Af den nominelle koncentration | 93,3 | 97.0 | 100,7 | 111,8 |
| Unøjagtighed[%CV] | 1.3 | 1,0 | 5.7 | 2.8 |
| C | ||||
| Stabilitet ved -20 ° C, Dag 3 | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 98,7 | 111 | 111 | |
| 93,5 | 89,6 | 108 | 105 | |
| 89,5 | 91,5 | 107 | 112 | |
| 88.2 | 99,1 | 108 | 92,4 | |
| % Af den nominelle koncentration | 89,6 | 94,7 | 108,5 | 105,1 |
| Unøjagtighed [% CV] | 2.7 | 4.9 | 1.7 | 9,0 |
| Stabilitet ved -20 ° C, Dag 7 | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 98,7 | 102 | 109 | |
| 94,8 | 94.6 | 114 | 106 | |
| 95.5 | 102 | 98,1 | 108 | |
| 107 | 99,5 | 115 | 105 | |
| % Af den nominelle koncentration | 98,5 | 98,7 | 107,3 | 107 |
| Unøjagtighed [% CV] | 5.7 | 3.1 | 8.5 | 1.8 |
| </ td> | ||||
| Stabilitet ved -20 ° C, Dag 30 | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 82,3 | 83,1 | 90,4 | 93,2 | |
| 87,9 | 85,8 | 85.3 | 97,9 | |
| 85,7 | 88,6 | 98,3 | 98,0 | |
| 92.0 | 95,6 | 110 | 103 | |
| % Af den nominelle koncentration | 87,0 | 88,3 | 96,0 | 98,0 |
| Unøjagtighed [% CV] | 4.1 | 5.4 | 10.8 | 4.0 |
| D </ td> | |||||||||
| Stabilitet ved -80 ° C, Dag 3 | |||||||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | |||||
| 87,5 | 96,5 | 96,7 | Mislykkedes | ||||||
| Mislykkedes | 97.6 | 98,7 | 110 | ||||||
| 88.8 | 96.4 | 106 | 109 | ||||||
| 87,3 | 101 | 96,5 | 109 | ||||||
| % Af den nominelle koncentration | 87,9 | 97,9 | 99,5 | 109,3 | |||||
| Unøjagtighed [% CV] | 0,8 | 2.2 | 4,5 | 0.6 | |||||
| Stabilitet ved -80 ° C, Dag 7 | QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | ||||
| Mislykkedes | 98,0 | 105 | 99,8 | ||||||
| 97,1 | 106 | 104 | 105 | ||||||
| 99,7 | 102 | 99,3 | 102 | ||||||
| 101 | 99,9 | 109 | 106 | ||||||
| % Af den nominelle koncentration | 99,3 | 101,5 | 104,3 | 103.2 | |||||
| Unøjagtighed [% CV] | 2,0 | 3.4 | 4.0 | 2.8 | |||||
| Stabilitet ved -80 ° C, Dag 30 | |||||||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | | 20 | 40 | | |||||
| 88.2 | 85.3 | 89,6 | 96,7 | ||||||
| 96,2 | 92.6 | 85,8 | 94,1 | ||||||
| 83,9 | 93,7 | 91.0 | 105 | ||||||
| 95,6 | 94,0 | 98,9 | 102 | ||||||
| % Af den nominelle koncentration | 91.0 | 91.4 | 91,3 | 99,5 | |||||
| Unøjagtighed [% CV] | 6,0 | 4.1 | 5.5 | 4.9 | |||||
| E | ||||
| Frys optøningsstabilitet, -20 ° C, 1 cyklus | ||||
| QC-niveau [ng / ml] </ td> | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 92,5 | 86.2 | 90.2 | 94,3 | |
| 89,8 | 90.5 | 85.4 | 104 | |
| 94,7 | 88,6 | 93,4 | 104 | |
| 101 | 89,2 | 93,7 | 96,3 | |
| % Af den nominelle koncentration | 94,5 | 88,6 | 90,7 | 99,7 |
| Unøjagtighed [% CV] | 4.8 | 1.8 | 3.9 | 5.1 |
| Frys tø stabilitet, -20 ° C, 2 cykler | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 99,1 | 97.6 | Mislykkedes | 85.3 | |
| 93.1 | 88,1 | 93,4 | 92.0 | |
| 94,9 | 91,5 | 85,8 | 93,9 | |
| Mislykkedes | 90.5 | 86.8 | 85.4 | |
| % Af den nominelle koncentration | 95,7 | 91,9 | 88.7 | 89,2 |
| Unøjagtighed [% CV] | 3.1 | 4.0 | 4.1 | 4,5 |
| Frys tø stabilitet, -20 ° C, 3 cykler | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 95,7 | Mislykkedes | 86,0 | 93,3 | |
| 95.5 | 87,4 | 85.0 | 91,3 | |
| 90.5 | 89.1 | 86,0 | 86,0 | |
| 96.9 | 85,7 | 90.2 | Mislykkedes | |
| % Af den nominelle koncentration | 94,7 | 87,4 | 86.8 | 90.2 |
| Unøjagtighed [% CV] | 2.8 | 1.7 | 2.3 | 3.8 |
| F | ||||
| Ekstraherede prøve stabilitet ved +4 ° C, 24 timer | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 122 | 112 | 91.0 | 104 | |
| 93,5 | 106 | 91.8 | 96.1 | |
| 111 | 94,8 | 98,2 | 93,5 | |
| 98,4 | 97.6 | 91,3 | 89,8 | |
| % Af den nominelle koncentration | 106,2 | 102,6 | 93.1 | 95,9 |
| Unøjagtighed [% CV] | 12.8 | 7.9 | 3.4 | 6,0 |
| Ekstraherede prøve stabilitet ved +4 ° C, 48 timer | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 106 | 108 | 93,7 | 110 | |
| 105 | 98,1 | 94.6 | 98,9 | |
| 103 | 98,4 | 95.0 | 92.6 | |
| 108 | 93.1 | 89,7 | 85,5 | |
| % Af den nominelle koncentration | 105,5 | 99,4 | 93,3 | 96,8 |
| Unøjagtighed [% CV] | 2.1 | 6.2 | 2.4 | 10.4 |
| Ekstraherede prøve stabilitet ved +4 ° C, 72 timer | ||||
| QC-niveau [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 112 | 96.4 | 104 | |
| 101 | 95,3 | 103 | 95,2 | |
| 94,2 | 105 | 93,5 | 99,5 | |
| 100 | 96.9 | 92.6 | 89.3 | |
| % Af den nominelle koncentration | 97,9 | 102,3 | 96.4 | 97.0 |
| Unøjagtighed [% CV] | 3.1 | 7.7 | 4.7 | 6.3 |
Tabel 5. Resultater af Stability Test. A: Stabilitet af tacrolimus på tørrede blodpletter ved RT over 7 dage, B: Stabilitet af tacrolimus på tørrede blodpletter i køleskabet (+ 4 ° C) over 7 dage, C: Stabilitet af tacrolimus på tørrede blodpletter ved -20 ° C i løbet af 1 måned, D: Stabilitet af tacrolimus på tørrede blodpletter ved -80 ° C i løbet af 1 måned, E: Stabilitet af tacrolimus på tørrede blodpletter over tre fryse-tø cykler (-20 ° C), F : Ekstraherede prøve / autosampler stabilitet ved +4 ° C i løbet af 72 timer. Data præsenteres som% af den nominelle koncentration. Prøver, der er anført som "ikke bestået" er prøver, der blev tabt til laboratoriet / instrument fejl. I de fleste tilfælde blev påvist nogen toppe ved alle eller den interne standard manglede.
Figur 1. Opbygning af Tacrolimus. Atom nummerering følger Den Internationale Union for Ren og Anvendt Kemi (IUPAC) nomenklatur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Tilslutning af Switching Valve.424fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative Ion Chromatogrammer. (A) Repræsentant ion kromatogram af en tom blodprøver spottet på filtrerpapir (for detaljer producenten, se venligst Materialer List) og tørret. Pilen markerer retentionstiden for tacrolimus peak, (B) repræsentant ion-kromatogram af en tom blod prøver tilsat ved den nedre grænse for kvantificering (1 ng / ml) spottet på filtrerpapir og tørres, og (C) repræsentant ionkromatogram af en prøve opsamlet ved en transplantation patient på filterpapir. Dette er et trug prøve, og den målte tacrolimuskoncentrationen var 2,1 ng / ml. Denne prøve blev opsamlet ved patienten hjemme og er fra et klinisk forsøg, der var godkendt af University of Cincinnati Institutional Review Board (Cincinnati, OH). Alle patienter gav deres passende skriftlige samtykke. Ion kromatogrammer er originale udskrifter som genereret af massespektrometri software (for detaljer producenten, se venligst Materialer List). Blå og røde linjer i ion kromatogrammer repræsenterer den interne standard D 2, 13C-tacrolimus og tacrolimus, hhv. Toppen eluering foran de vigtigste tacrolimus og intern standard toppe er de rotamere. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative kalibreringskurve. En original udskrift som genereres af massespektrometri software vises.424 / 52424fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentant Ion Chromatogram Målt under post-kolonne Infusion af Tacrolimus og Injektion af en udtrukket Blank blodprøve for at vurdere en Potentielle Matrix Effect (Ion Suppression / Ion Enhancement). Pilen markerer retentionstiden for tacrolimus højdepunkt. Matrixeffekt test var baseret på fremgangsmåden beskrevet i 46. Ingen relevante matrix effekt blev opdaget. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om, som førnævnte, begrebet terapeutisk lægemiddel og overholdelse overvågning af tacrolimus baseret på tørrede blodpletter er attraktiv, er der analytiske udfordringer, som går ud over dem, der typisk er forbundet med LC-MS / MS-analyse af tacrolimus i venøst EDTA hele blodprøver. Disse indbefatter, men er ikke begrænset til, det faktum, at matrixen er kapillært fuldblod gennemvædet i bomuldslinters materiale af filteret kortmateriale anvendt her og blodvolumen lav (20 pi). , High-throughput analyse i et centralt laboratorium kræver dog en hurtig og pålidelig fremgangsmåde til ekstraktion, som resulterer i prøver, der mangler matrix interferens og matrixeffekter i kombination med en robust, specifik og meget følsomme LC-MS / MS assay. Pålideligheden af assayet er kritisk, da der som regel ikke er nok materiale på allerede stanset filterkortet tilbage til fornyet analyse i tilfælde ekstraktionen / LC-MS / MS analyse ikke.
Den filter kort, der anvendes i nærværende undersøgelse (for detaljer producenten, se venligst Materialer List) blev valgt, da disse er en FDA godkendt klasse II-enhed, er i overensstemmelse med NCCLS retningslinjer LA4-A5 44 og er CE-mærket i Europa. Hvis helt fyldt, en cirkel på Whatman 903 filterkortet holder ≈50 pi blod 46. Men størrelsen af blod dråber indsamlet af de enkelte patienter varierer og træning i korrekt prøvetagning teknik er afgørende 46.
Det første vigtige skridt for at udvinde en udstansede tørret blod spot prøve er homogenisering. Baseret på vores erfaring, anvendelse af en blender bullet er mere effektiv og bedre reproducerbar end andre metoder anvendes til at øge ekstraktionseffektiviteten såsom lydbehandling. Anvendelsen af blender kuglen var afgørende for konsekvent at opnå udvinding tilbagebetalinger over 90%. For pålideligheden af udvinding procedure, var det også vigtigt at sikre, at alle centrifuger blev Temperature styret (4 ° C), og at vortexing trin var ikke kortere end 10 min, hvilket resulterede i mere variable og lavere udvinding tilbagebetalinger. Desuden er det vigtigt, at methanol / ZnSO4 forhold ikke ændres som tacrolimus opsving er meget følsom over for den korrekte sammensætning af proteinet nedbør løsning.
Den næste udfordring er at få en ren ekstrakt ideelt blottet for materialer, der kan forårsage matrix interferens og effekter. Således blev en simpel ettrins proteinpræcipitation trin, som ofte anvendes til udvinding af tacrolimus fra EDTA blodprøver ikke som en farbar vej. Efter proteinpræcipitation hjælp ZnSO4 (herunder tilsætning af en isotopmærket intern standard), hvirvelblanding og centrifugering blev supernatanterne injiceret i en 2D HPLC-system og på en online ekstraktionskolonne. Online kolonne ekstraktion med høje strømme af 5 ml / min på konventionelle forkolonne patroner hjælp af en simpel 6-portomskiftningsventil til analyse af tacrolimus er blevet beskrevet før 47. Den mobile fase blev valgt således, at tacrolimus og dens interne standard koncentreret i den forreste del af ekstraktionskolonnen og ikke migrerer over søjlen under oprydning trin. Den online ekstraktion anvendt i den foreliggende protokol havde flere fordele, herunder injektion af relativt store prøvevolumener uden negativ indflydelse HPLC-analyse. Den returskylning efter berigelse analytterne på toppen af ekstraktionskolonnen ("peak fokus") resulterede i skarpere toppe giver mulighed for mere pålidelig integration ved softwarealgoritmen især for prøver med lave koncentrationen af tacrolimus. 48 online oprydning trin ikke kun fjerne potentielt forstyrrende matrix-forbindelser, men også de-saltet prøven. En vigtig men sjældent diskuteret problem for høj kapacitet og høj throughput LC-MS / MS-analyser er den gradvise tab af følsomhed af LC-MS / MS-system på grund af stigendeforurening af elektrospray kilden under analyse af store partier. Ingen signifikante matrixeffekter (ion suppression / ion ekstraudstyr) blev observeret. Den negative effekt af potentielle matrix effekter blev reduceret / undgås ved en kombination af følgende: effektiv proteinudfældning anvendelse af methanol / ZnSO4, centrifugering efter proteinpræcipitation på 16.000 xg, høj flow online udvinding, klar kromatografisk separation af tacrolimus fra potentielle interferenser tidligt eluerende fra den analytiske kolonne, og brugen af isotop-mærket tacrolimus som intern standard i stedet for strukturelt beslægtede interne standarder såsom ascomycin.
Den nedre grænse for kvantificering var 1 ng / ml, og dermed lavere end for de fleste immunoassays, der i øjeblikket ofte anvendes til terapeutisk lægemiddelmonitorering af tacrolimus i EDTA-blodprøver. Denne nedre grænse for kvantificering er tilstrækkelig selv for såkaldt lav calcineurinhæmmer langsigtede immunosupprestende vedligeholdelse protokoller.
I sammenligning med tidligere beskrevne LC-MS / MS-analyser til at kvantificere tacrolimus i tørrede bloods blev 29-34,36,39,41,42, de nuværende assay kampe eller overstiger deres præstationer i form af nedre grænse for kvantificering, udvinding opsving, nøjagtighed og præcision samtidig undgå potentielt risikable begreber som et-trins proteinudfældning procedurer og ultrakorte kromatografi gange, hvilket normalt giver acceptable resultater i løbet af validering baseret på blodprøver fra raske individer. Men transplanterede patienter en meget kompleks gruppe af patienter, som har sygdomme, der påvirker sammensætningen af blod, og som tager anden medicin. Dette gør det stort set umuligt at udelukke alle potentielle interferenser, der kan være til stede i de enkelte patienter under valideringen og den eneste levedygtige strategi er at etablere analysen på en måde, at det minimerer risikoen for sådanne potentielle interferenser. Tørret blod spots har udfordringer såsom virkningen af hæmatokrit på blodets viskositet og dermed diffusionsegenskaber i blodet påføres på filterpapir 49. Dette blev ikke testet her igen som sådanne virkninger allerede er blevet beskrevet ikke at påvirke tacrolimus analyse i tørrede blodpletter på hematocriter og tacrolimus koncentrationer inden klinisk rimelige grænser 29,32. Også stabiliteten af tacrolimus i tørrede blodpletter ved forhøjede temperaturer er allerede blevet undersøgt af andre og tacrolimus i tørrede blodpletter fandtes at være stabil i 5 dage ved 37 ° C og endog 60 ° C 32, hvilket er vigtigt for overførsel af tørret blod pletter under ikke temperaturkontrollerede forhold især om sommeren.
Denne analyse er baseret på en kombination af kugle blender homogenisering, kan high-flow online kolonne oprydning og LC-MS / MS-analyse skabe en platform strategi for udvikling af bioanalytiske analyser til kvantificering af andre immunosuppressants, alene eller samtidige, samt af andre stoffer i tørrede blod stikprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 | |
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V | |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q | |
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Isopropanol 99.9%, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Methanol Optima LC/MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Water Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μl pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μl pipet tips with filter | Multimax | 2938T | |
| 200 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μl inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 | |
| Glass v ials, 4 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Glass vials, 20 ml | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Needle, 18 G 1.5 | Precision Glide | 305196 | |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 | |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 | |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| Tandem Mass Spectrometer | |||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 | |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
References
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
- Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
- Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
- A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
- Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
- Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
- Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
- Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
- Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
- Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
- Annual Data Report. , Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
- Draft Guidance on Tacrolimus. , Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
- Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
- Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb , 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
- Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
- Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
- Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
- Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
- Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
- Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
- Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
- Kelly, D. A.
- Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
- Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
- Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
- Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
- Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
- Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
- Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
- Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
- Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
- Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
- Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
- Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
- Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
- Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
- Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
- Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
- Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
- Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
- Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
- Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. , Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
- Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
- Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
- Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
- Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).
