Abstract
Le tacrolimus inhibiteur de la calcineurine est la pierre angulaire de la plupart des protocoles de traitement immunosuppresseur après une transplantation d'organe solide aux États-Unis. Tacrolimus est un médicament étroite indice thérapeutique et en tant que telle exige suivi thérapeutique et ajustement de la dose en fonction de l'ensemble de son concentrations résiduelles dans le sang. Pour faciliter la maison médicament thérapeutique et le suivi de l'adhésion, la collecte des taches de sang séché est un concept attrayant. Après un bâton de doigt, le patient perçoit une goutte de sang sur un papier filtre à la maison. Après que le sang est séché, il est envoyé au laboratoire d'analyse où le tacrolimus est quantifiée par liquide à haute performance chromatographie-spectrométrie de masse tandem (HPLC-MS / MS) en combinaison avec une étape protéines de précipitation manuel simple et l'extraction de la colonne en ligne.
Pour l'analyse de tacrolimus, un disque de 6 mm est poinçonnée du centre saturée de la tache de sang. La tache de sang est homogénéisé à l'aide d'une balle d'un mélangeure puis protéines sont précipitées avec du méthanol / 0,2 M ZnSO 4 contenant le standard interne D 2, 13 C-tacrolimus. Après agitation au vortex et centrifugation, 100 ul de surnageant sont injectés dans une colonne d'extraction en ligne et on les lave avec 5 ml / min de 0,1 acide formique / acétonitrile (7: 3, v: v) pendant 1 min. Ci-après, la soupape de commutation est activé et les analytes sont contre-rinçage sur la colonne analytique (et séparé en utilisant un gradient d'acide formique / acétonitrile 0,1%). Le tacrolimus est quantifiée en mode positif de réaction multiples (MRM) en utilisant un spectromètre de masse en tandem.
Le dosage est linéaire de 1 à 50 ng / ml. La variabilité inter-essai (3,6% -6,1%) et la précision (91,7% -101,6%) selon l'évaluation de plus de 20 jours répondent aux critères d'acceptation. Récupération d'extraction moyenne est de 95,5%. Il n'y a pas de report, les interférences de matrice et les effets de matrice pertinente. Tacrolimus est stable dans des taches de sang séchées à température ambiante et à 4 ° C pendant 1 semaine. Les échantillons extraits dans leéchantillonneur automatique sont stables à 4 ° C pendant au moins 72 heures.
Introduction
Le tacrolimus est un puissant immonosuppressant 1-7 qui a une structure de macrolide 8 (figure 1). En raison de cis - isomérie trans des liaisons CN il forme deux rotamères en solution 9 qui peuvent être séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (HPLC) Tacrolimus est lipophile et soluble dans les alcools (methanol: 653 g / L, de l'éthanol: 355 g / L), des hydrocarbures halogènes (chloroforme: 573 g / L) et de l'éther. Il est peu soluble dans les hydrocarbures aliphatiques (hexane: 0,1 g / L et de l'eau (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 La molécule ne contient pas de chromophore et son maximum d'absorption UV est de 192 nm tacrolimus agit par l'intermédiaire inhibition de la calcineurine. . Son mécanisme d'action a été examiné dans les références 10,11. Il est actuellement utilisé dans plus de 80% des patients transplantés organes solides aux Etats-Unis 12.
L'indice thérapeutique du tacrolimus est considered soit 13 étroite. En outre, la corrélation entre les doses de tacrolimus et les concentrations sanguines est pauvre et la pharmacocinétique est variable 14,15. Suivi des concentrations thérapeutiques pour guider tacrolimus dosage chez les patients transplantés est donc pratique clinique générale 16-20. L'objectif est de maintenir les concentrations sanguines de tacrolimus dans une plage thérapeutique pré-défini. Les concentrations sanguines de tacrolimus en dessous de la gamme thérapeutique peut entraîner une augmentation de l'activité des réactions d'allo-immunes chroniques ou aiguës, tandis que des concentrations supérieures à la fenêtre thérapeutique augmentent le risque de sur-immunosuppression, le cancer et la toxicité, tels que la néphrotoxicité, la neurotoxicité, l'hypertension et le diabète. Haute pharmacocinétique variabilité intra-individuelle de tacrolimus peut être préjudiciable à la fois organe de greffe et de la survie des patients 21,22. Bien variabilité inter-individuelle de la pharmacocinétique du tacrolimus est principalement causée par des polymorphismes de CYP3A5, pour des raisons intra-individuellela variabilité comprennent, mais ne sont pas limités à des interactions médicament-médicament, la maladie-médicaments et de la nourriture-médicaments 14,15. Aussi le manque d'adhésion à la thérapeutique régime de médicament immunosuppresseur est un facteur et une raison majeure de perte du greffon 23,24.
Ces considérations suggèrent que la maison fréquente médicament thérapeutique et le suivi de l'observance des concentrations de tacrolimus sur sang total peut être bénéfique pour assurer que les patients ont une exposition de tacrolimus dans la fenêtre thérapeutique souhaité en tout temps. Cependant, la logistique et le coût de la surveillance plus fréquente de drogue thérapeutique comme il est de pratique clinique actuelle 15 est prohibitif. Une des raisons est que le patient doit voir un préleveur d'avoir l'échantillon de sang veineux nécessaire dessinée. Taches de sang séché ont récemment émergé comme un concept attrayant 25-28. Après un doigt simple coller le patient recueille une goutte de sang sur une carte de papier filtre spécial et la tache de sang a DRied, il peut être envoyé à un laboratoire central pour l'analyse de tacrolimus et de tout autre immunosuppresseur que le patient peut actuellement être pris. Ceci est devenu possible grâce à la mise au point de dosages LC-MS / MS hautement sensibles et spécifiques pour la quantification de tacrolimus et d'autres immunosuppresseurs dans de très petits volumes de sang tels que des taches de sang séché (typiquement 20 ul de sang) 25,29-43. Un autre avantage est que, les stratégies de collecte minimalement invasives faibles volumes d'échantillon tels que des taches de sang séché facilitent grandement suivi thérapeutique et des études pharmacocinétiques chez les petits enfants 28.
Tacrolimus est généralement mesurée en toute EDTA sang veineux 15. Les raisons sont que le tacrolimus distribue principalement dans les cellules de sang et que des études cliniques ont signalé des meilleure corrélation entre les concentrations résiduelles de tacrolimus dans le sang que dans le plasma à des événements cliniques 15,18. En comparaison, l'analyse de tacrolimus en taches de sang séché est basée sur sang capillaire qui est mélangée avec la matrice de papier-filtre. Cela pose des défis en termes de solubilisation de tacrolimus et les interférences potentielles avec l'analyse LC-MS / MS. Ici, nous présentons un test établi et validé sur la base de l'homogénéisation de la tache de sang séché en utilisant un mélangeur de balle en combinaison avec un débit élevé échantillon de colonne ligne nettoyer procédure et l'analyse LC-MS / MS. En date d'aujourd'hui, ce test a été utilisé avec succès pour la quantification de plus de cinq mille tacrolimus séchée échantillons de taches de sang pour le suivi de l'observance dans les essais cliniques.
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Protocol
Des échantillons de sang de-identifiés de personnes en bonne santé ont été de l'Université de Colorado Hospital (Aurora, Colorado). L'utilisation d'échantillons sanguins bancaires dépersonnalisées pour les études de validation ainsi que pour la préparation des étalons et d'échantillons de contrôle de qualité a été considéré comme «exonéré» par le Conseil Colorado multi-institutionnel de révision (COMIRB, Aurora, Colorado).
1. Préparation de références et Solutions
- Achat tacrolimus et l'étalon interne D 2, 13 C-tacrolimus auprès des vendeurs figurant dans la liste des matériaux.
- Préparation des solutions mères dans du methanol pur à une concentration de 1 mg / ml pour le tacrolimus et une concentration de 10 ug / ml pour 13 D 2, C-tacrolimus. Assurez solutions de stockage de matériaux de référence basé sur trois pondérations indépendants. Aliquote solutions mères et conserver à -70 ° C ou moins.
- Préparer la solution pour précipiter les protéineset extraire le tacrolimus en utilisant du méthanol / 0,2 M ZnSO 4 dans l'eau (7: 3, v: v). Cette solution contient également de l'étalon interne D 2, C-13 tacrolimus à une concentration de 2,5 ng / ml et est utilisé pour l'extraction de tous les échantillons à l'exception de l'extraction des échantillons à blanc (s'il vous plaît voir 1.3.3).
- Préparer cette solution de protéines de précipitation fraîchement chaque jour d'extraction et définir l'expiration de la solution à 12 h.
- Préparation de la courbe d'étalonnage et de contrôle de qualité (QC) échantillons
- Préparer des solutions mères de tacrolimus en effectuant des dilutions appropriées de la solution mère en utilisant du méthanol pur.
- Pour préparer les étalons et les échantillons de contrôle de la qualité, spike 20 pi de solution stock diluée de manière appropriée dans le sang total EDTA, incuber à 37 ° C sous agitation dans un bain d'eau douce pour permettre une distribution homogène de tacrolimus dans les composants cellulaires du sang pour 20 min et aliquote dans 1,5 ml polyperopylene tubes à fond conique et enfichable sur les couvercles. Assurez-vous que le volume relatif de solvant organique ne dépasse pas 5%.
- Point 50 pi du sang total à pointes dans le milieu de chaque cercle sur les cartes de filtre à l'aide d'une pipette.
- Sécher les taches de sang sur les cartes de filtre à la température ambiante pendant 3 heures.
- Préparer des normes d'étalonnage de tacrolimus dans le sang total humain de l'EDTA à des concentrations de tacrolimus de 1, 2,5, 5, 10, 25, et 50 ng / ml. Préparer un échantillon à blanc pour l'extraction comme les normes d'étalonnage avec la solution de protéines de précipitation contenant le standard interne D 2, 13 C-tacrolimus («échantillon zéro").
- Préparer les échantillons de CQ en tout EDTA sang humain à des concentrations de 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Préparer un échantillon témoin. A la différence des échantillons QC qui sont extraits par précipitation contenant le standard interne D 2, C-13 tacrolimus, extraire cette solution échantillon à blanc avec la protéine de précipitations qui faitpas contenir de l'étalon interne D 2, 13 C-tacrolimus ("échantillon blanc").
- Collection d'échantillons cliniques
- Recueillir taches de sang séché comme décrit dans 43,44.
2. Extraction de Tacrolimus sang séché des échantillons ponctuels
- Visuellement inspecter la tache de sang séché pour assurer une qualité acceptable et le volume 45 échantillon.
- Frappe du centre tache de sang sur la carte du filtre avec une perforation de 6 mm.
Remarque: La qualité des poinçons peut être contrôlée par pesée. Un disque de filtre saturé de poing pèse en moyenne 5,02 mg ± 0,09 mg (gamme: 4.83- 5.14 mg, n = 12). - La place des disques dans 1,5 ml tubes en polypropylène à fond conique et couvercles encliquetables.
- Ajouter 20-30 balles à chaque tube.
- Ajouter 500 ul de la solution de précipitation de protéines (methanol: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, v: v à 2,5 ng / ml d'étalon interne) dans chaque tube. Pour l'extraction des échantillons blancs, utiliser la solution de précipitation des protéines sans l'étalon interne.
- Homogénéiser les disques dans le mélangeur de balle pendant 1 min (vitesse maximale, le réglage "10").
- Agiter les échantillons à température ambiante sur la multi-tubes vortex (vitesse maximale, le réglage "10") pendant 10 min.
- Centrifuger les échantillons à 16 000 x g et 4 ° C pendant 10 min.
- Transférer le surnageant dans des flacons de HPLC en verre équipé d'un insert de 300 ul. Utilisez pré-fente joints en téflon.
Remarque: Extrait échantillons peuvent être conservés à -20 ° C ou moins jusqu'à l'analyse LC-MS / MS.
3. LC-MS / MS Analysis
- Charge: 100 pi de surnageant de l'extrait de l'échantillon sur la colonne d'extraction de la cartouche d'C8 et laver avec un 7: 3 de l'acide formique à 0,1% dans l'eau: acétonitrile à un débit de 5 ml / min pendant 1 min. Les connexions de la soupape de commutation sont représentés sur la figure 2 et le gradient gérées par la pompe d'extraction dans le tableau 1
- Ci-après, activer la soupape de commutation résultant à l'arrière-ras des analytes de la pré-colonne sur la colonne analytique.
- Réglez la colonne thermostat à 65 ° C.
- Éluer les analytes de la colonne analytique à l'aide des débits et gradient indiquées dans le tableau 1.
- Branchez la colonne analytique à un spectromètre de masse en tandem via la source d'ionisation électrospray turbo. Régler les paramètres clés du spectromètre de masse selon le tableau 2.
- Détecter les ions positifs ([M + Na] +) de dans le mode de réaction multiple (MRM). Utilisez les transitions d'ions suivants pour la quantification: tacrolimus: m / z (masse / charge) = 826,6 → 616,2 et D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2.
Remarque: La durée totale est de 4,6 min.
4. Quantification
- Pour chaque terme, générer une courbe d'étalonnage sur la base des calibrateurs préparés et 1.3.5inclure dans chaque série d'analyses.
- Générer une courbe d'étalonnage en portant les concentrations nominales par rapport facteur d'analyte de réponse (Peak [Analyte] / Peak [étalon interne]) en utilisant le logiciel du spectromètre de masse.
- Monter les calibrateurs en utilisant un ajustement quadratique en combinaison avec 1 / X pondération.
- Pour la quantité de tacrolimus dans les taches de sang séché intégrer le tacrolimus et de l'étalon interne dans les chromatogrammes MRM extraites. Calculer le facteur de réponse pour le tacrolimus (Peak [Analyte] / Peak [étalon interne]) et comparer avec la courbe d'étalonnage en utilisant le logiciel de spectrométrie de masse.
5. Les procédures de validation
- Limite inférieure de détection (LLOD) et la limite inférieure de quantification (LIQ).
- Considérons la plus faible concentration de tacrolimus avec un rapport de crête à bruit de 4: 1 comme limite inférieure de détection (LLOD). Définir la limite inférieure de quantification (LIQ) en tant quela plus faible concentration de la courbe d'étalonnage avec une précision égale ou supérieure à ± 20% d'écart de la concentration nominale et une précision égale ou supérieure à 20% (coefficient de variation).
- Intra- et précision inter-jour et précisions.
- Testez l'exactitude et la précision à quatre niveaux de 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) et 40 ng / ml (QC4) concentration.
- Préparer les échantillons QC de chaque jour de la validation dans le sang total EDTA humain, sèche sur les cartes de filtre, extraire et analyser comme décrit ci-dessus.
- Déterminer la précision intra-jour et la précision avec 6 échantillons par niveau de concentration de QC.
- Évaluer la précision inter-journée et une précision de plus de 20 jours. Mesurer chaque niveau QC avec 4 échantillons par jour.
- Analyser les deux courbes d'étalonnage avec des échantillons QC de chaque jour.
- Calculer la précision intra-jour que le% de la concentration nominale (six échantillons par niveau de concentration, s'il vous plaît voir 5.2.2). Calculer précision que le coefficient de variance (CV%).
- Envisager la précision intra-day acceptable si elle tombe dans l'acceptation limite de 85% à 115% de la concentration nominale. Considérez précision intra-day acceptable si elle est égale ou supérieure à un CV (coefficient de variation) de 15%.
- Calculer la précision inter-jour et de précision que la moyenne pour chaque niveau de concentration QC analysé au cours des 20 jours de validation.
- Envisager la précision moyenne inter-jour acceptable si elle tombe dans l'acceptation limite de 85% à 115% de la concentration nominale. Considérons précision inter-jour acceptable si elle est égale ou supérieure à une CV (coefficient de variation) de 15%.
- Exclusion des interférences de la matrice.
- Pour l'exclusion des interférences qui peuvent être causés par des signaux de la matrice, d'analyser taches blanches séchées de sang (8 individus différents, de préférence 4 hommes et 4 femmes).
- Inspecter visuellement chromatogrammes ioniques. Si pics dans le temps de rétentionfenêtre de tacrolimus sont détectés, d'intégrer et de comparer leurs domaines sous la courbe avec celles des pics de tacrolimus dans les échantillons blancs enrichis avec le tacrolimus à la LLOQ. La zone de pics dans les échantillons blancs ne sont pas censés dépasser 15% de ceux de tacrolimus à la LLOQ.
- Ion suppression / amélioration d'ions.
- Utiliser un protocole de perfusion post-colonne telle que décrite 45 pour évaluer l'interférence potentielle de renforcement ion suppression / d'ions provoquée par des composants de matrice de co-élution.
- Infuser le tacrolimus à une concentration de 10 pg / ml dissous dans de l'acide formique à 0,1%: methanol (30:70, v / v) post-colonne à un débit de 10 ul / min.
- Raccorder une pompe à seringue par l'intermédiaire de la pièce en T entre la colonne analytique et de la source d'électronébulisation le spectromètre de masse.
- Surveiller l'intensité du signal MS / MS des transitions MRM tacrolimus et son étalon interne (m / z = 826,6 → 616,2 et m / z = 829,6 → 619,2) après injection de extracTED échantillons blancs (n = 8 échantillons provenant d'individus différents).
Remarque: En l'absence d'amélioration ions suppression / ion du signal continu causé par perfusion des analytes ne devrait pas être affectée par l'injection de la matrice de blanc, tandis que la suppression d'ions provoque un plongeon du signal et de l'ion amélioration un pic.
- Reporter.
- Évaluer le potentiel de report en analysant extrait des échantillons blancs après les plus hauts calibrateurs (50 ng / ml, n = 6).
- Inspecter visuellement chromatogrammes ioniques. Si des pics dans la fenêtre de temps de rétention de tacrolimus sont détectés, d'intégrer et de comparer leurs domaines sous la courbe avec celles des pics de tacrolimus dans les échantillons blancs enrichis avec le tacrolimus à la LLOQ. La zone de pics dans les échantillons blancs ne sont pas censés dépasser 15% de ceux de tacrolimus à la LLOQ.
- Recouvrements d'extraction.
- Déterminer les recouvrements en comparant les signaux des analytes après extraction de QC samples à tous les quatre niveaux de concentration (n = 6) par concentration avec ceux des vierges taches de sang séché dopés avec des quantités correspondantes de tacrolimus après l'extraction.
- Préparer quatre ensembles de cercles de qualité (taux de concentration: 2, 4, 20, 40 ng / ml).
- Préparer 4 autres ensembles de «échantillons de test de récupération" correspondant en repérant 50 pi de sang total EDTA vierge sur les cartes de papier filtre et le séchage pendant 2 heures.
- Ci-après, à la fois pour le QC et «échantillons de test de récupération" vierges, découper la tache de sang entier sur la carte du filtre avec des ciseaux et placez les disques résultant dans un tube en polypropylène à fond conique et le couvercle snap-on.
- Extraire tous les échantillons.
- Transférer les surnageants (400 pi) dans des flacons de HPLC de verre.
- Ajouter la solution tacrolimus boursier pour les «échantillons de test de récupération extrait" vierges pour atteindre des concentrations de 2, 4, 20 et 40 ng / ml (4 pi de 200, 400, 2000, 4000 ng ml tacrolimus Stock sol /utions à 400 ul de surnageant).
- Après analyse LC-MS / MS, comparer les signaux dans les deux échantillons QC et échantillons d'essai "de récupération" de la concentration correspondante (récupération =% des échantillons de signaux avant que les échantillons dopés extraction / signaux dopés après extraction x 100).
- L'intégrité de dilution.
- Établir l'intégrité de la dilution en utilisant des échantillons enrichis avec des analytes à 500, 250 et 100 ng / ml.
- Après extraction, diluer les échantillons en utilisant une solution de protéine de précipitation (1:10, n = 3 par niveau de concentration).
- Calculer écarts par rapport aux concentrations nominales. Examiner les résultats qui relèvent de 85% -115% de la valeur nominale acceptable.
- Stabilités.
- Enquêter stabilités en utilisant les échantillons QC à tous les quatre niveaux de concentration (n = 4 par concentration) ont analysé à différents points dans le temps et dans les différentes conditions d'entreposage.
- Comparer les résultats après stockage avec les valeurs nominales. Considérez résultats qui relèvent de 85% -115% de la valeur nominale acceptable.
- Établir la stabilité de l'échantillon pendant 1 semaine à la température ambiante, 1 semaine à 4 ° C, 1 mois à -20 ° C et 1 mois à -80 ° C.
- Test de stabilité gel-dégel sur trois cycles (-20 ° C). Essai échantillon extrait et la stabilité de l'échantillonneur automatique en plaçant des échantillons dans l'échantillonneur automatique thermostaté réglé à 4 ° C. Injecter échantillons après 72 h.
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Representative Results
Chromatogrammes d'ions représentatifs d'un échantillon témoin, un échantillon enrichi à la limite inférieure de quantification et un échantillon de patient sont présentés dans la figure 3.
Courbes d'étalonnage
La limite inférieure de détection était de 0,5 ng / ml et la limite inférieure de quantification était de 1,0 ng / ml. Cinquante ng / ml a été choisi comme étalon le plus élevé que des concentrations plus élevées sont peu susceptibles d'être atteint à la clinique dans des circonstances normales.
Des courbes d'étalonnage ont été fraîchement préparés chaque jour de la validation en totalité EDTA sang humain, on les sèche sur les cartes de filtrage et extraite avec un mélange méthanol / 0,2 M de ZnSO 4 (70:30 v / v) + étalon interne (concentration finale de l'étalon interne: 2,5 ng / ml ). Pour la validation jour 1 (n = 6 pour les étalons et n = 6 pour le niveau de QC) et pour les jours 2 - 20 (n = 2 pour les calibrateurs et n = 4 pour chaque niveau de QC) ont été analysés avec des concentrations 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 ng / ml pour calibrateurs. Une courbe d'étalonnage typique est représenté sur la Figure 4. Mean précision de 85% à 115% de la valeur nominale, à l'intérieur de la plage de travail pour 2/3 des calibrateurs (avec un minimum de 6 étalons non nuls) ont été considérées comme acceptables. Le coefficient moyen de corrélation est (r) = 0,999 (n = 40 courbes d'étalonnage).
Les précisions et les précisions
Les résultats sont présentés en détail dans le tableau 3.
Extraction de récupération
Récupérations d'extraction moyennes étaient de 98,2% (2 ng / ml), 92,2 (4 ng / ml), 95,5 (20 ng / ml), 96,2 (40 ng / ml).
Matrice Interférences, Ion répression / Essais Enhancement Ion Utilisation Perfusion continue post-colonne et les reports
L'analyse des échantillons à blanc à partir de huit individus différents (n = 4 et n = femelle mâle 4) a montré des signaux moins de 15% de la LIDQ (1 ng / ml) à la durée de rétention correspondant à latacrolimus pic qui indique que le pic de tacrolimus détecté peut être considéré comme spécifique. Un exemple représentatif est présenté à la figure 3. Interférences potentielles par suppression / amélioration d'ions d'ions ont été testées en utilisant des échantillons de sang séché vierges provenant de huit individus sains différents. Une expérience représentative est illustré à la figure 5. Aucune indication de l'amélioration de suppression / d'ions d'ions significative n'a été observée. Pas de report pertinente résultant des pics supérieurs à 15% du signal à LLOQ ont été détectés.
Intégrité de dilution
Intégrité de dilution a été étudiée par analyse d'échantillons préparés à des concentrations supérieures à la plus haute calibreur (100, 250 et 500 ng / ml) et dilué à 1:10 dans la solution de précipitation de protéine après extraction pour atteindre les concentrations cibles suivantes: 10, 25, et 50 ng / ml. Précisions moyennes devaient tomber dans les critères d'acceptation de 85% à 115% des concentrations nominales. Toutes les dilutions TESTed a rencontré les critères d'acceptation (tableau 4).
Stabilités
Stabilité du tacrolimus dans taches de sang séché a été étudiée par l'analyse des échantillons de CQ à tous les quatre niveaux (n = 4 / niveau de concentration), qui ont été stockés dans des conditions variables.
Précisions moyennes devaient tomber dans les critères d'acceptation de 85% à 115% des concentrations nominales. Les résultats sont présentés en détail dans le tableau 5. Aucune perte après 1 semaine de stockage à température ambiante, après 1 semaine de stockage à 4 ° C, après 1 mois de stockage à -20 ° C, après 1 mois de stockage à -80 ° C, après 3 cycles de gel et de dégel, et après 72 h d'échantillons extraits dans l'échantillonneur automatique à 4 ° C étaient apparente.
| Pompe d'extraction | Analytique (élution) Pompe | ||||||
| Eau + acide formique à 0,1% | Acétonitrile | Débit [pl / min] | Durée [min] | Eau + acide formique à 0,1% | Acétonitrile | Débit [pl / min] | |
| 0 | 70 | 30 | 5000 | 0 | 13 | 87 | 1000 |
| 1 | 70 | 30 | 5000 | 2 | 2 | 98 | 1200 |
| 1.1 | 2 | 98 | 100 | 3.5 | 2 | 98 | 1200 |
| 3 | 2 | 98 | 100 | 3.6 | 13 | 87 | 1000 |
| 3.1 | 20 | 80 | 2000 | 4.6 | 13 | 87 | 1000 |
| 4 | 70 | 30 | 5000 | ||||
| 4.6 | 70 | 30 | 5000 | ||||
Tableau 1. Programme Dégradé pour l'extraction et HPLC analytique pompes.
| Paramètre | Réglage |
| Gaz de collision (CAD) | 10 |
| Gaz de rideau (CUR) (psi) | 30 |
| Ion Source gaz 1 (GS1) (psi) | 50 |
| Source d'ions de gaz 2 (GS2) (psi) | 30 |
| Nébuliseur courant (NC) (V) | 1 |
| Température (TEM) (° C) 600 | |
| Ionspray Tension (IS) (V) | 5500 |
| Chauffe-interface (IHE) | Sur |
| Declustering potentiel (DP) (V) | 136 |
| Potentiel d'entrée (EP) (V) | 10 |
| Énergie de collision (CE) (V) | 47 |
| Collision potentiel de sortie de la cellule (CXP) (V) | 16 |
Tableau 2. Turbo Electrospray Interface et spectromètre de masse Paramètres. La nomenclature correspond à celle utilisée dans le logiciel de spectrométrie de masse (pour plus de détails du fabricant, s'il vous plaît voir la liste des matériaux).
| Jour de validation | QC Level [% de la concentration nominale] | |||
| 2 | 4 | 20 | 40 | |
| Jour 1 | 93,0 | 86,3 | 88,9 | 93,4 |
| 101 | 90,4 | 95,3 | 100 | |
| 85,6 | 95,9 | 99,0 | 97,5 | |
| 88,6 | 93,6 | 105 | 103 | |
| 85,0 | 97,4 | 97,2 | 109 | |
| 89,1 | 96,7 | 100 | 101 | |
| Précision intra-day [%] | 90,4 | 93,4 | 97,6 | 100,7 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 6.6 | 4.6 | 5.5 | 5.2 |
| Jour 2 | 92,8 | 86,0 | 103 | |
| 91,1 | 88,8 | 94,7 | 87,0 | |
| 88,6 | 90,9 | 92,8 | 94,2 | |
| 97,2 | 93,7 | 94,2 | 115 | |
| Précision intra-day [%] | 92,4 | 89,9 | 96,2 | 97,9 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 3.9 | 3.6 | 4.8 | 12.2 |
| Jour 3 | 97,6 | 101 | 98,4 | 112 |
| 104 | 85,6 | 102 | 110 | |
| 99,2 | 88,4 | 99,4 | 105 | |
| 96,3 | 87,2 | 108 | 117 | |
| Précision intra-day [%] | 99,3 | 90,6 102,0 | 111,0 | |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 3.4 | 7.8 | 4.2 | 4.5 |
| Jour 4 | 95,2 | 88,6 | 112 | 94,5 |
| 105 | 87,3 | 93,2 | 116 | |
| 99,8 | 96,2 | 103 | 103 | |
| 100 | 104 | 97,2 | 99,4 | |
| Précision intra-day [%] | 100,0 | 94,0 | 101,4 | 103,2 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 4.0 | 8.2 | 8.1 | 8.9 |
| Jour 5 | 106 | 90,4 | 101 | 106 |
| 108 | 89,0 | <td> 106100 | ||
| 102 | 101 | 96,6 | 128 | |
| 105 | 88,8 | 105 | 107 | |
| Précision intra-day [%] | 105,3 | 92,3 | 102,2 | 110,3 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 2.4 | 6.3 | 4.2 | 11.1 |
| Jour 6 | 90,9 | 93,7 | 119 | 106 |
| 98,8 | 88,1 | 96,4 | 110 | |
| 94,6 | 96,3 | 99,1 | 108 | |
| 108 | 100 | 102 | 102 | |
| Précision intra-day [%] | 98,1 | 94,5 | 104,1 | 106,5 |
| 7.5 | 5.3 | 9.8 | 3.2 | |
| Jour 7 | 85,1 | 87,5 | 99,5 | 95,4 |
| 86,4 | 85,4 | 94,7 | 101 | |
| 94,5 | 87,3 | 98,9 | 94,6 | |
| 85,5 | 97,0 | 101 | 99,6 | |
| Précision intra-day [%] | 87,9 | 89,3 | 98,5 | 97,7 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 5.1 | 5.8 | 2.7 | 3.2 |
| Jour 8 | 86,1 | 92,5 | 91,9 | 102 |
| 87,5 | 91,5 | 95,2 | 88,5 | |
| 115 | 85,6 | 92,1 | 102 | |
| 85,8 | 85,9 | 95,4 | 108 | |
| Précision intra-day [%] | 93,6 | 88,9 | 93,7 | 100,1 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 15,3 | 4.1 | 2.0 | 8.2 |
| Jour 9 | 88,9 | 91,4 | 96,9 | 100 |
| 90,0 | 89,8 | 95,0 | 100 | |
| 69,7 | 85,9 | 95,8 | 109 | |
| 91,9 | 87,0 | 105 | 101 | |
| Précision intra-day [%] | 85,1 | 88,5 | 98,2 | 102,5 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 12.2 | 2.9 | 4.7 | 4.3 |
| Jour 10 | 90,9 | 91,3 | 96,2 | 100 |
| 97,7 | 89,5 | 94,4 | 100 | |
| 99,9 | 109 | 98,7 | 96,8 | |
| 99,1 | 90,0 | 95,7 | 96,1 | |
| Précision intra-day [%] | 96,9 | 95,0 | 96,3 | 98,2 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 4.2 | 9.9 | 1.9 | 2.1 |
| Jour 11 | 92,7 | 91,9 | 88,2 | 104 |
| 96,6 | 91,2 | 97,0 | 110 | |
| 109,0 | 92,8 | 97.6 | 102 | |
| 98,3 | 107 | 93,7 | 111 | |
| Précision intra-day [%] | 99,2 | 95,7 | 94,1 | 106,8 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 7.0 | 7.9 | 4.6 | 4.1 |
| Jour 12 | 87,7 | 85,5 | 105 | 95,3 |
| 112 | 88,1 | 101 | 96,1 | |
| 102 | 89,1 | 89,7 | 97,5 | |
| 106 | 92,5 | 102 | 104 | |
| Précision intra-day [%] | 101,9 | 88,8 | 99,4 | 98,2 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 10.1 | 3.3 | 6.7 | 4.0 |
| Jour 13 | Échoué | 85,7 | 93,3 | 102 |
| 101 | 105 | 88,0 | 93,9 | |
| 112 | 98,0 | 91,4 | 102 | |
| 104 | 113 | 104 | 101 | |
| Précision intra-day [%] | 105,7 | 100,4 | 94,2 | 99,7 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 5.4 | 11,5 | 7.3 | 3.9 |
| Jour 14 | 91,5 | 89,1 | 97,4 | 93,1 |
| 90,4 | 87,1 | 93,9 | 99,8 | |
| 89,7 | 97,0 | 94,8 | 106 | |
| 97,4 | 86,8 | 89,9 | Échoué | |
| Précision intra-day [%] | 92,3 | 90,0 | 94,0 | 99,6 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 3.8 | 5.3 | 3.3 | 6.5 |
| Jour 15 | 92,8 | 92,8 | 92,5 | 95,4 |
| 97,5 | 96,3 | 96,2 | 95,5 | |
| 95,5 | 108 | 97,3 | 99,3 | |
| 110 | 109 | 115 | 113 | |
| Précision intra-day [%] | 99,0 | 101,5 | 100,3 | 100,8 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 7.7 | 8.1 | 10,0 | 8.3 |
| Jour 16 | 93,7 | 97,8 | 90,7 | 112 |
| 90,3 | 87,1 | Échoué | 101 | |
| 97,9 | 88,3 | 95,5 | 107 | |
| 91,4 | 85,7 | 89,3 | 96,7 | |
| Précision intra-day [%] | 93,3 | 89,7 | 91,8 | 104,2 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 3.6 | 6.1 | 3.5 | 6.4 |
| Jour 17 | 88,0 | 86,0 | 93,7 | 103 |
| 89,8 | 90,8 | 94,8 | 93,2 | |
| 85,9 | 91,1 | 99,7 | 94,8 | |
| 86,7 | 88,1 | 95,6 | 91,7 | |
| Précision intra-day [%] | 87,6 | 89,0 | 96,0 | 95,7 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 1.9 | 2.7 | 2.7 | 5.3 |
| Jour 18 | 89,6 | 85,8 | 91,0 | 98,3 |
| 89,6 | 86,2 | 88,3 | 93,6 | |
| Échoué | 86,7 | 96,8 | 104 | |
| 88,1 | 85,8 | 95,2 | 111 | |
| Précision intra-day [%] | 89,1 | 86,1 | 92,8 | 101,7 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 10 | 0,5 | 4.2 | 7.4 |
| Jour 19 | 98,0 </ td> | 89,7 | 94,2 | 102 |
| 88,3 | 86,0 | 97,6 | 102 | |
| 91,6 | 88,1 | 95,8 | 97,5 | |
| 90,7 | 90,1 | 92,8 | 88,3 | |
| Précision intra-day [%] | 92,2 | 88,5 | 95,1 | 97,5 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 4.5 | 2.1 | 2.2 | 6.6 |
| Jour 20 | 93,0 | 87,0 | 99,4 | 101 |
| 97,3 | 87,6 | 95,5 | 91,9 | |
| 89,0 | 88,4 | 91,2 | 93,5 | |
| 104 | 90,7 | 97,7 | 115 | |
| Précision intra-day[%] | 95,8 | 88,4 | 96,0 | 100,4 |
| Intra-Day Imprécision [CV%] | 6.7 | 1.8 | 3.7 | 10,5 |
Précision Inter-Day et l'imprécision | ||||
| Précision Inter-jour | 95,2 | 91,7 | 97,2 | 101,6 |
| Inter-Jour Imprécision | 6.1 | 4.5 | 3.6 | 4.2 |
Tableau 3. Résultats des échantillons de contrôle de qualité de plus de 20 jours. Les données sont présentées en% du nominal. Les échantillons répertoriés comme «échoué» sont des échantillons qui ont été perdus à des erreurs de laboratoire / instrument. Dans la plupart des CAes, pas de pics ont été détectés à tout ou pic de l'étalon interne manquait.
| Dilution | 01h10 |
| Concentration nominale cible après dilution | 50 ng / ml |
| 98,6 | |
| 94,5 | |
| 91,4 | |
| Précision [%] | 94,8 |
| Imprécision [CV%] | 3.6 |
| Dilution | 01h10 |
| Concentration nominale cible après dilution | 10 ng / ml |
| 103 | |
| 99,5 | |
| 101 | |
| Précision [%] | 101,2 |
| Imprécision [CV%] | 1.8 |
| Dilution | 01h10 |
| Concentration nominale cible après dilution | 25 ng / ml |
| 91,7 | |
| 98,2 | |
| 103 | |
| Précision [%] | 97,6 |
| Imprécision [CV%] | 5.7 |
Tableau 4. Résultats de la dilution des tests d'intégrité. Les données sont présentées sous forme de% du nominal.
| UN | ||||
| Stabilité à la température ambiante, Jour 1 | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 91,9 | 85,8 | 86,0 | 102 | |
| 86,7 | 85,7 | 88,5 | 102 | |
| 86,0 | 85,9 | 90,1 | 103 | |
| 89,2 | 98,0 | 90,8 | 112 | |
| % De la concentration nominale | 88,5 | 88,9 | 88,9 | 104,8 |
| Imprécision [% CV] | 2.7 | 6.1 | 2.1 | 4.9 |
| Stabilité à la température ambiante, Jour 3 | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 88,6 | 105 | 101 | 113 | |
| 94,1 | 100 | 98,5 | 103 | |
| 100 | 101 | 106 | 109 | |
| 99,5 | 102 | 102 | 108 | |
| % De la concentration nominale | 95,6 | 102,0 | 101,9 | 108,3 |
| Imprécision [% CV] | 5.3 | 2.2 | 3.1 | 4.1 |
| Stabilité à la température ambiante, la Journée 7 | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 105 | 103 | 91,7 | 109 | |
| 101 | 107 | 100 | 110 | |
| 102 | 108 | 107 | 105 | |
| 93,8 105 | 109 | 111 | ||
| % De la concentration nominale | 100,5 | 105,8 | 101,9 | 108,8 |
| Imprécision [% CV] | 4.7 | 2.2 | 7.8 | 2.6 |
| B | ||||
| Stabilité à +4 ° C, Jour 1 | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 101 | 89,9 | 95,8 | 100 | |
| 88,9 | 91,0 | 94,1 | 99,0 | |
| 96,2 | 100 | 102 | 96,7 | |
| 89,5 | 87,8 | 95,4 | 88,6 | |
| % De la concentration nominale | 93,9 | 92,2 | 96,8 | 96,1 |
| Imprécision [% CV] | 5.8 | 5.4 | 3.5 | 5.2 |
| Stabilité à +4 ° C, Jour 3 | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 85,2 | 105 | 95,3 | |
| Échoué | 87,8 | 101 | 96 | |
| 101 | 88,8 | 89,6 | 97,5 | |
| 106 | 92,2 | 102 | 104 | |
| % De la concentration nominale | 98,1 | 88,5 | 99,4 | 98,2 |
| Imprécision [% CV] | 9.7 | 2.9 | 6.8 | 4.0 |
| Stabilité à +4 ° C, Jour 7 | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 94,0 | 98,5 | 96,1 | 110 | |
| 92,9 | 96,4 | 109 | 109 | |
| 91,7 | 96,3 | 97,9 | 115 | |
| 94,7 | 96,9 | 99,8 | 113 | |
| % De la concentration nominale | 93,3 | 97,0 | 100,7 | 111,8 |
| Imprécision[%CV] | 1.3 | 10 | 5.7 | 2.8 |
| C | ||||
| Stabilité à -20 ° C, Jour 3 | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87,3 | 98,7 | 111 | 111 | |
| 93,5 | 89,6 | 108 | 105 | |
| 89,5 | 91,5 | 107 | 112 | |
| 88,2 | 99,1 | 108 | 92,4 | |
| % De la concentration nominale | 89,6 | 94,7 | 108,5 | 105,1 |
| Imprécision [% CV] | 2.7 | 4.9 | 1.7 | 9.0 |
| Stabilité à -20 ° C, Jour 7 | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 98,7 | 102 | 109 | |
| 94,8 | 94,6 | 114 | 106 | |
| 95,5 | 102 | 98,1 | 108 | |
| 107 | 99,5 | 115 | 105 | |
| % De la concentration nominale | 98,5 | 98,7 | 107,3 | 107 |
| Imprécision [% CV] | 5.7 | 3.1 | 8.5 | 1.8 |
| </ td> | ||||
| Stabilité à -20 ° C, la Journée 30 | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 82,3 | 83,1 | 90,4 | 93,2 | |
| 87,9 | 85,8 | 85,3 | 97,9 | |
| 85,7 | 88,6 | 98,3 | 98,0 | |
| 92,0 | 95,6 | 110 | 103 | |
| % De la concentration nominale | 87,0 | 88,3 | 96,0 | 98,0 |
| Imprécision [% CV] | 4.1 | 5.4 | 10,8 | 4.0 |
| D </ td> | |||||||||
| Stabilité à -80 ° C, Jour 3 | |||||||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | |||||
| 87,5 | 96,5 | 96,7 | Échoué | ||||||
| Échoué | 97,6 | 98,7 | 110 | ||||||
| 88,8 | 96,4 | 106 | 109 | ||||||
| 87,3 | 101 | 96,5 | 109 | ||||||
| % De la concentration nominale | 87,9 | 97,9 | 99,5 | 109,3 | |||||
| Imprécision [% CV] | 0,8 | 2.2 | 4.5 | 0,6 | |||||
| Stabilité à -80 ° C, Jour 7 | Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | ||||
| Échoué | 98,0 | 105 | 99,8 | ||||||
| 97,1 | 106 | 104 | 105 | ||||||
| 99,7 | 102 | 99,3 | 102 | ||||||
| 101 | 99,9 | 109 | 106 | ||||||
| % De la concentration nominale | 99,3 | 101,5 | 104,3 | 103,2 | |||||
| Imprécision [% CV] | 2.0 | 3.4 | 4.0 | 2.8 | |||||
| Stabilité à -80 ° C, la Journée 30 | |||||||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | | 20 | 40 | | |||||
| 88,2 | 85,3 | 89,6 | 96,7 | ||||||
| 96,2 | 92,6 | 85,8 | 94,1 | ||||||
| 83,9 | 93,7 | 91,0 | 105 | ||||||
| 95,6 | 94,0 | 98,9 | 102 | ||||||
| % De la concentration nominale | 91,0 | 91,4 | 91,3 | 99,5 | |||||
| Imprécision [% CV] | 6.0 | 4.1 | 5.5 | 4.9 | |||||
| E | ||||
| La stabilité de gel-dégel, -20 ° C, 1 cycle | ||||
| QC niveau [ng / ml] </ td> | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 92,5 | 86,2 | 90,2 | 94,3 | |
| 89,8 | 90,5 | 85,4 | 104 | |
| 94,7 | 88,6 | 93,4 | 104 | |
| 101 | 89,2 | 93,7 | 96,3 | |
| % De la concentration nominale | 94,5 | 88,6 | 90,7 | 99,7 |
| Imprécision [% CV] | 4.8 | 1.8 | 3.9 | 5.1 |
| Congélation-décongélation stabilité, -20 ° C, 2 cycles | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 99,1 | 97,6 | Échoué | 85,3 | |
| 93,1 | 88,1 | 93,4 | 92,0 | |
| 94,9 | 91,5 | 85,8 | 93,9 | |
| Échoué | 90,5 | 86,8 | 85,4 | |
| % De la concentration nominale | 95,7 | 91,9 | 88,7 | 89,2 |
| Imprécision [% CV] | 3.1 | 4.0 | 4.1 | 4.5 |
| Congélation-décongélation stabilité, -20 ° C, 3 cycles | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 95,7 | Échoué | 86,0 | 93,3 | |
| 95,5 | 87,4 | 85,0 | 91,3 | |
| 90,5 | 89,1 | 86,0 | 86,0 | |
| 96,9 | 85,7 | 90,2 | Échoué | |
| % De la concentration nominale | 94,7 | 87,4 | 86,8 | 90,2 |
| Imprécision [% CV] | 2.8 | 1.7 | 2.3 | 3.8 |
| F | ||||
| La stabilité de l'échantillon extrait à +4 ° C, 24 h | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 122 | 112 | 91,0 | 104 | |
| 93,5 | 106 | 91,8 | 96,1 | |
| 111 | 94,8 | 98,2 | 93,5 | |
| 98,4 | 97,6 | 91,3 | 89,8 | |
| % De la concentration nominale | 106,2 | 102,6 | 93,1 | 95,9 |
| Imprécision [% CV] | 12,8 | 7.9 | 3.4 | 6.0 |
| La stabilité de l'échantillon extrait à +4 ° C, 48 h | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 106 | 108 | 93,7 | 110 | |
| 105 | 98,1 | 94,6 | 98,9 | |
| 103 | 98,4 | 95,0 | 92,6 | |
| 108 | 93,1 | 89,7 | 85,5 | |
| % De la concentration nominale | 105,5 | 99,4 | 93,3 | 96,8 |
| Imprécision [% CV] | 2.1 | 6.2 | 2.4 | 10.4 |
| La stabilité de l'échantillon extrait à +4 ° C, 72 h | ||||
| Niveau de QC [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96,5 | 112 | 96,4 | 104 | |
| 101 | 95,3 | 103 | 95,2 | |
| 94,2 | 105 | 93,5 | 99,5 | |
| 100 | 96,9 | 92,6 | 89,3 | |
| % De la concentration nominale | 97,9 | 102,3 | 96,4 | 97,0 |
| Imprécision [% CV] | 3.1 | 7.7 | 4.7 | 6.3 |
Tableau 5. Résultats des essais de stabilité. A: Stabilité du tacrolimus sur taches de sang séché à la température ambiante pendant 7 jours, B: Stabilité du tacrolimus sur taches séchées de sang dans le réfrigérateur (4 ° C) plus de 7 jours, C: Stabilité du tacrolimus sur taches de sang séché à -20 ° C sur un mois, D: Stabilité du tacrolimus sur taches de sang séché à -80 ° C sur un mois, E: Stabilité du tacrolimus sur des taches de sang séché sur trois cycles de gel-dégel (-20 ° C), F : Extrait stabilité des échantillons / échantillonneur automatique à 4 ° C sur 72 heures. Les données sont présentées en tant que% de la concentration nominale. Les échantillons répertoriés comme «échoué» sont des échantillons qui ont été perdus à des erreurs de laboratoire / instrument. Dans la plupart des cas, pas de pics ont été détectés à tout ou pic de l'étalon interne manquait.
Figure 1. Structure du tacrolimus. Numérotation Atom suit l'Union internationale de la nomenclature chimie pure et appliquée (UICPA). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Raccordement de la vanne de commutation.424fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Chromatogrammes représentatifs ions. (Liste A) représentant __gVirt_NP_NN_NNPS<__ chromatogramme d'ions d'une ébauche des échantillons de sang repéré sur un papier filtre (pour plus de détails du fabricant, s'il vous plaît voir la liste des matériaux) et séché. La flèche indique le temps de rétention du pic de tacrolimus, (B) représentant de chromatogramme d'ions d'un sang vierge échantillons enrichis à la limite inférieure de quantification (1 ng / ml) repéré sur le papier filtre et séché, et (C) chromatogramme d'ions Représentant d'un échantillon prélevé d'un patient transplanté sur un papier filtre. Ceci est un exemple de l'auge et la concentration de tacrolimus mesurée était de 2,1 ng / ml. Cet échantillon a été collecté par le patient à la maison et provient d'un essai clinique qui a été approuvé par l'Université de l'Institutional Review Board Cincinnati (Cincinnati, OH). Tous les patients ont donné leur consentement écrit approprié. Chromatogrammes ioniques sont imprimés originaux généré par le logiciel de spectrométrie de masse (pour plus de détails du fabricant, s'il vous plaît voir la liste des matériaux). Les lignes bleues et rouges dans chromatogrammes ioniques représentent l'étalon interne D 2, 13 C-tacrolimus et le tacrolimus, respectivement. Le pic d'élution en face de la principale tacrolimus et les pics standards internes sont les rotamères. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Courbe d'étalonnage représentative. Un imprimé original généré par le logiciel de spectrométrie de masse est disponible.424 / 52424fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Représentant Ion Chromatogram mesurée pendant post-colonne Infusion de tacrolimus et l'injection d'un échantillon de sang Blank Extrait pour évaluer un effet potentiel Matrix (Ion répression / Ion Enhancement). La flèche indique le temps de rétention du pic de tacrolimus. Matrice de test de l'effet a été basée sur le procédé décrit dans 46. Aucune matrice pertinente effet a été détecté. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Bien que, comme mentionné ci-dessus, la notion de médicament thérapeutique et le suivi de l'observance du tacrolimus sur la base de taches de sang séché est attrayant, il ya des défis analytiques qui vont au-delà de ceux qui sont habituellement associés à l'analyse LC-MS / MS du tacrolimus dans EDTA veineuse échantillons de sang total. Ceux-ci comprennent, mais sans y être limités, le fait que la matrice est du sang total capillaire trempé dans la matière des linters de coton de la matière de carte de filtre utilisé ici et le faible volume de sang (20 ul). Néanmoins, l'analyse à haut débit dans un laboratoire central nécessite une méthode d'extraction rapide et fiable qui se traduit par des échantillons qui ne disposent pas d'interférences de la matrice et les effets de matrice en combinaison avec une analyse LC-MS / MS solide, spécifique et hautement sensible. Fiabilité du dosage est essentielle, car il n'y a généralement pas assez de matériel sur la carte du filtre déjà poinçonné gauche pour ré-analyse dans le cas de l'extraction / analyse LC-MS / MS échoue.
La ficartes ltrantes utilisées dans la présente étude (pour les détails du fabricant, s'il vous plaît voir liste matériaux) ont été choisies car elles sont un dispositif de classe II approuvé par la FDA, sont en conformité avec les directives NCCLS LA4-A5 44 et portent le marquage CE en Europe. Si complètement rempli, un cercle sur la carte filtre Whatman 903 détient ≈50 ul de sang 46. Toutefois, la taille des gouttes de sang prélevés par les patients individuels varient et la formation dans la technique d'échantillonnage adéquate est essentielle 46.
La première étape importante de l'extraction d'un échantillon séché de tache de sang-poinçonné est homogénéisation. Basé sur notre expérience, l'utilisation d'un mélangeur de balle est plus efficace et mieux reproductible que d'autres méthodes utilisées pour améliorer l'efficacité d'extraction tel que sonication. L'utilisation du mélangeur de balle était essentiel de parvenir régulièrement à des recouvrements d'extraction supérieur à 90%. Pour la fiabilité de la procédure d'extraction, il était également important de veiller à ce que toutes les centrifugeuses ont été TEMPERATure contrôlée (4 ° C) et que l'étape de vortex est non inférieure à 10 min, ce qui a donné lieu à des recouvrements d'extraction plus variables et inférieure. En outre, il est important que le rapport méthanol / ZnSO 4 ne soit pas modifié en tant que recouvrement de tacrolimus est très sensible à la composition exacte de la solution de précipitation de protéines.
Le prochain défi est d'obtenir un extrait propre idéalement dépourvu de matériaux qui peuvent causer des interférences et les effets matrice. Ainsi, une étape de précipitation des protéines en une seule étape simple, le plus souvent utilisé pour l'extraction du tacrolimus à partir des échantillons de sang EDTA n'a pas été jugé une option viable. Après précipitation des protéines à l'aide de ZnSO 4 (y compris l'addition d'un standard interne marqué avec un isotope), vortex et centrifugation, les surnageants ont été injectés dans un système HPLC et 2D sur une colonne d'extraction en ligne. Extraction de la colonne en ligne en utilisant des débits élevés de 5 ml / min sur des cartouches pré-colonne classique en utilisant un simple orifice 6-soupape de commutation pour l'analyse de tacrolimus ont été décrits auparavant 47. La phase mobile a été choisie de telle sorte que le tacrolimus et son étalon interne concentrées à l'avant de la colonne d'extraction et ne migrent au-dessus de la colonne au cours de l'étape de nettoyage. L'extraction en ligne utilisé dans le présent protocole avait plusieurs avantages, notamment l'injection de volumes relativement importants de l'échantillon sans affecter négativement l'analyse HPLC. Le back-flush après enrichir les analytes sur le dessus de la colonne d'extraction («pic se concentrant") a entraîné des pics plus nettes permettant une intégration plus fiable par l'algorithme du logiciel en particulier pour les échantillons avec de faibles concentrations de tacrolimus. 48 L'étape de nettoyage en ligne n'a pas seulement supprimer interférant potentiellement composés de la matrice, mais aussi dé-salée de l'échantillon. Un problème important mais rarement discuté de haut volume, haut débit LC-MS / MS essais est la perte graduelle de la sensibilité du système LC-MS / MS raison de l'augmentationla contamination de la source d'électronébulisation pendant l'analyse de grandes séries. Aucun effet de matrice significatifs (ions d'amélioration suppression / ion) ont été observés. L'effet négatif des effets potentiels de la matrice a été réduit / évité par une combinaison des éléments suivants: précipitation des protéines efficaces utilisant du méthanol / ZnSO 4, centrifugation après la précipitation des protéines à 16.000 xg, à haut débit d'extraction en ligne, une séparation chromatographique claire de tacrolimus à des interférences potentielles d'élution début à partir de la colonne d'analyse et l'utilisation du tacrolimus marqué avec un isotope en tant qu'étalon interne à la place d'étalons internes de structure apparentée tels que l'ascomycine.
La limite inférieure de quantification était de 1 ng / ml, et donc inférieure à celle de la plupart des dosages immunologiques qui sont actuellement fréquemment utilisé pour le contrôle thérapeutique du médicament de tacrolimus dans des échantillons de sang EDTA. Cette limite inférieure de quantification est suffisante, même pour les soi-disant inhibiteurs de la calcineurine immunosuppres bas à long termeprotocoles d'entretien sifs.
En comparaison avec des essais décrits précédemment LC-MS / MS pour quantifier tacrolimus dans sangs séchées taches 29-34,36,39,41,42, les présents résultats d'analyse ou dépasse leur performance en termes de limite inférieure de quantification, la récupération de l'extraction, de la précision et la précision tout en évitant les concepts potentiellement à risque tels que les procédures protéines précipitations en une seule étape et ultra-courtes durées de chromatographie, qui donnent généralement des résultats acceptables lors de la validation basée sur des échantillons de sang d'individus sains. Cependant, les patients transplantés présentent un groupe très complexe de patients qui ont des maladies qui affectent la composition du sang et qui prennent plusieurs médicaments. Cela rend pratiquement impossible d'exclure toutes les interférences potentielles qui peuvent être présents chez les patients individuels lors de la validation et la seule stratégie viable est de mettre en place le dosage d'une manière qui minimise le risque de telles interférences potentielles. Séché spo de sangts ont des défis tels que l'effet de l'hématocrite sur viscosité du sang et donc les propriétés de diffusion du sang appliqué sur du papier filtre 49. Ce n'a pas été testé ici encore que ces effets ont déjà été décrits ne pas affecter l'analyse de tacrolimus dans taches de sang séché à hématocrite et les concentrations de tacrolimus dans des limites raisonnables cliniquement 29,32. Aussi la stabilité de tacrolimus dans les taches de sang séché à des températures élevées a déjà été étudié par d'autres et le tacrolimus dans des taches de sang séché se révèle être stable pendant 5 jours à 37 ° C et même 60 ° C 32, ce qui est important pour l'expédition de sang séché taches dans des conditions de température non contrôlées en particulier pendant l'été.
Ce test basé sur une combinaison de balle mélangeur homogénéisation, à haut débit nettoyage de la colonne en ligne et l'analyse LC-MS / MS peut fournir une stratégie de plate-forme pour le développement de tests bioanalytiques pour la quantification de l'autre immunosuppressants, seuls ou simultanées, ainsi que d'autres médicaments dans des échantillons de taches de sang séché.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 | |
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V | |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q | |
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Isopropanol 99.9%, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Methanol Optima LC/MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Water Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μl pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μl pipet tips with filter | Multimax | 2938T | |
| 200 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μl inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 | |
| Glass v ials, 4 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Glass vials, 20 ml | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Needle, 18 G 1.5 | Precision Glide | 305196 | |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 | |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 | |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| Tandem Mass Spectrometer | |||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 | |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
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