このプロトコルの目標は、マウスモデルにおける背側蝸牛核への直接アクセスを提供する外科的アプローチを概説することです。
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方法論記事
聴覚路の光遺伝学的刺激のためのマウス背側蝸牛神経核の直接可視化
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
逮捕または難聴逆転するウイルス媒介遺伝子導入の使用の調査は、主に末梢聴覚系に追いやられています。いくつかの研究は、中枢聴覚系への遺伝子導入を検討した。聴覚路の二次ニューロンが含まれている脳幹の背側蝸牛神経核（DCN）は、遺伝子導入のための潜在的部位である。このプロトコルでは、後頭蓋窩アプローチを経由してネズミDCNの直接的かつ最大の露出のための技術が実証されている。このアプローチは、急性または生存のどちらかの手術が可能になります。 DCNの直接可視化に続いて、実験のホストは、青色光レーザに結合された光ファイバによる蝸牛神経核およびその後の刺激へのオプシンの注射を含む、可能である。そのような電気刺激と神経インジェクタトレーシングのような他の神経生理学実験は、また可能である。visualizaのレベルると、刺激の持続時間は、達成可能な実験の広範囲にこのアプローチを適用する。
概要
ウイルスを介した逆難聴への遺伝子導入は、主に末梢聴覚系に焦点を当ててきました。1 蝸牛を標的として、研究者は、浸透圧ミニポンプ注入2、ベクター導入遺伝子複合体に浸した Gelfoam®2 またはゼラチンスポンジ3、直接マイクロインジェクション4;多数の遺伝子導入ベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター5,6、レンチウイルスベクター7、およびカチオン性リポソーム2;標的組織を超えた遺伝子導入ベクターの播種2。最近では、アデノ随伴ウイルス(AAV)-1が蝸牛に導入され、小胞性グルタミン酸トランスポーター-3の喪失によるマウスの難聴を治療しています。8 さらに、最近、末梢聴覚系における光遺伝学の応用が説明されています。9
>jove_content<しかし、中枢聴覚系への遺伝子導入を調べた研究はほとんどありません。脳幹の背側蝸牛核(DCN)には、聴覚経路の二次ニューロンが含まれています。蝸牛核(CN)の遺伝子導入技術は多くの研究に利用できますが、光感受性タンパク質であるオプシンのDCNへの遺伝子導入も、光遺伝学に基づく実験技術を可能にするために利用できます。ウイルスを介したカネロドプシン-2(ChR2)などのオプシンの遺伝子導入後、DCNのニューロンは光刺激に敏感になります。光遺伝学的遺....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
注：すべての実験手順は、実験動物の愛護管理と使用に関する公衆衛生サービスポリシーを含む全国の動物保護ガイドラインに従うマサチューセッツアイ、耳診療所とハーバード大学医学部の動物実験委員会、に従って行われる、 ILARガイド、および動物福祉法。左DCNの詳細暴露下に表示実験手順。生存手術を行いながら、無菌の楽器を使用してください。
1.プライマリ開頭と背側蝸牛神経核露出
- 麻酔
- キシラジンの腹腔内投与による20mg / kgのケタミンを100mg / kgの18〜24グラム体重、高齢者8-12週間、マウスを麻酔。心拍数、呼吸数、ならびに足指ピンチ引っ込め反射を監視することによって、適切な麻酔を確認する。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を置きます。一度適切に麻酔下で、髪の上に重なるTを剃る彼は、手術部位への遮るもののないアクセスを提供するために頭皮。
- 外科ポジショニング
- 鼻クランプにより所定位置に保持小動物定位ホルダー、に安全にマウスを置きます。
- 鼻クランプが十分な呼吸を可能にするのに十分な緩いが、完全にマウスの頭部を固定するのに十分タイトであることを確認してください。マウスヘッドが緩んでいる場合、動物は処置の開頭部分の間にヘッドホルダから脱落する可能性がある。
- 心拍数のモニタリングを可能にし、標準的な方法、で聴性脳幹インプラント電極を配置します。呼吸数は、視覚化することによって監視されるべき....
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結果
部分的な小脳吸引は蝸牛神経核へのアクセスをデモ
頭蓋骨を覆う皮膚と筋肉がそのような冠状及びラムダ縫合線として、頭蓋骨の表面ランドマークを、除去された後、開頭のおおよその局在を実証する。鉗子との開頭術の後、小脳が可視化される。小脳の小部分を注意深く吸引し、次に注入することができ、CN、（ 図1）の可視化を実証する。
ブルーライトレーザーを刺激するための二次蝸牛神経核露出
オプシンとDCN、遺伝子導入、及びインキュベーション期間の最初の曝露に続いて、DCNは、青色光レーザーによって刺激され得る。光刺激のためのDCNの表面を露出させる二次開頭術は、プライマリ開頭術（SUPP。動画1）に技術的アプローチに似ています。さDCN、厚さが300μm未満である表面構造。実験的なネズミの準備には、最大6時間のための実行可能なままです。
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ディスカッション
本稿では、中央聴覚系を操作するためのマウスモデルにおけるDCNの直接可視化の技術が記載されている。直接可視化の概略アプローチは、定位アプローチである主要な代替、上の大きな利点を提供する。定位のアプローチが直接可視化を与えないのに対し、主に、DCNの直接可視化は、脳幹の部位の即時確認することができます。注入は、ターゲットの場所を「ミス」した場合場合、ウイルス媒介遺伝子移入にあるように、延長インキュベーション期間を必要とする実験では、低い感染効率の可能性がある。さらに、直接可視化のアプローチは、広い範囲の動物の年齢に注入することができます。類似の外科的アプローチは、ラットおよびモルモットのような他の動物モデルと生存実験で使用することができる。
このプロトコルでいくつかの重要なステップがあります。まず、マウスは定位ホルダーに適切に配置する必要があります。頭の任意の動きが困難開頭術を作ることになります。第二に、開頭の場所は非常に重要です。開頭術が適切な位置で行われていない場合は、小脳のDCN以下吸引の可視化は、困難、不可能ではないであろう。最後に、プロトコルの最も重要なステップは、.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
資金調達：この作品は、財団Bertarelli補助金（DJL）、MED-ELの助成金（DJL）、国立衛生研究所補助金のDC01089（MCB）によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 脳定位固定装置ホルダー | Stoelting | 51500 | |
| ホメオサーミックブランケット | ハーバード507214 | ||
| メスの刃 #11 | Fine Surgical | Tools 10011-00 | |
| Iris はさみ | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
| 5 フレンチ吸引 | 対称 外科 2777914 | ||
| デンタルポイント | ヘンリーSchein | 100-8170 | |
| Bone rongeur | Fine Surgical Tools | 16020-14 | |
| 10 & マイクロ;l ハミルトン シリンジ | ハミルトン | 7633-01 | |
| 34ゲージ、針 | ハミルトン | ||
| Rongeurs | Fine Surgical Tools | 16021-14 |
参考文献
- Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
- Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
- Jero, J., et al.
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再版と許可
