Protocol
आचार बयान: परियोजना से पहले मरीज को भर्ती करने के लिए IUCPQ के रिसर्च आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। इस लेख / वीडियो के प्रयोजन के लिए, हम दो रोगियों से ऊतकों प्राप्त: 1) 57 किलो का बीएमआई के साथ 50.7 किग्रा / एम 2 और 2) एक 35 वर्षीय महिला मरीज का बीएमआई के साथ एक 62 वर्षीय पुरुष रोगी / 2 मी। प्रयोगों दोनों वसा डिब्बों के साथ किया जा सकता है, लेकिन इस वीडियो के प्रयोजन के लिए एक वसा डिब्बे तक ही सीमित कर दिया गया है। वीडियो के तकनीकी पहलुओं के मरीज एक साथ प्रदर्शन किया गया और FABP4 इम्यूनोफ्लोरेसेंस मरीज दो से dedifferentiated कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया था।
1. नमूना प्रसंस्करण
- लेप्रोस्कोपिक बेरिएट्रिक सर्जरी के समय omental और वसा डिब्बों से वसा ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए सर्जन से पूछो।
- जल्दी आरटी पर प्रयोगशाला के लिए वसा के नमूने लाने के लिए और तुरंत प्रक्रिया।
- एक गैर बाँझ वातावरण में, प्रयोगशाला में पाचन प्रदर्शन करते हैं।कोशिकाओं अंततः संस्कृति कक्ष को हस्तांतरित और बाँझ शर्तों के तहत खेती की जाएगी। संक्रमण से बचने के लिए, पाचन के लिए पहले आसुत और filtrated पानी के साथ KRH बफर तैयार करने और एक निस्पंदन (0.22μM फिल्टर) द्वारा पालन करें। फ्लास्क और प्लेट तैयार करने के लिए सेल संस्कृति हुड में इथेनॉल से पहले हस्तांतरण के साथ अच्छी तरह से साफ ट्यूबों।
- एक पूर्व भारित पकवान और रिकार्ड वजन पर वसा ऊतकों रखें। आयल एम्बेडिंग से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए आरटी पर 10% formalin बफर में प्रत्येक ऊतक का नमूना (कम से कम 1 सेमी 2) का एक छोटा सा टुकड़ा को ठीक करें। Immunohistochemistry के प्रयोगों के लिए इस एम्बेडेड नमूना (नहीं दिखाया तकनीक) का प्रयोग करें।
- (- तकनीक नहीं दिखाया गया है जैसे, जीन अभिव्यक्ति) पूरे वसा ऊतकों पर आगे के अध्ययन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले तरल नाइट्रोजन में एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और फ्लैश फ्रीज में एक और टुकड़ा रखें।
2. Collagenase पाचन
- एक 50 मिलीलीटर टू में शेष वसा ऊतकों टुकड़ा रखेंपाचन के लिए किया जाना है।
- पाचन नली में नमूने के ग्राम प्रति collagenase (350 यू / एमएल) के साथ पूरक KRH-पश्चिम बंगाल के चार मिलीलीटर जोड़ें।
- कैंची से वसा ऊतकों कीमा।
- 45 मिनट ऊष्मायन (अधिकतम 1 घंटा) के लिए, एक प्रकार के बरतन में 37 डिग्री सेल्सियस, 90 आरपीएम अधिकतम, कीमा बनाया हुआ वसा ऊतकों निलंबन रखें।
Adipocytes और Preadipocytes 3. शुद्धीकरण
- एक प्लास्टिक बीकर में जाल एक 400 माइक्रोन नायलॉन के माध्यम से वसा की कुछ मात्रा के साथ पारदर्शी समाधान डालो।
- चिमटी के साथ, नायलॉन जाल पर सेल तैयारी घिसना और KRH-पश्चिम बंगाल के 5 मिलीलीटर से धो लें।
- नाजुक इसमें प्लास्टिक टयूबिंग और ट्यूबिंग छोर पर जुड़ी एक 60cc सिरिंज के साथ एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में filtrated सेल निलंबन हस्तांतरण।
- परिपक्व adipocytes साथ निलंबन कोशिकाओं प्रवर्तन द्वारा बफर के शीर्ष तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है, लगभग 10 मिनट के लिए खड़े हैं।
- धीरे धीरे 60cc syrin का उपयोग कर ट्यूब के नीचे बफर महाप्राणजीई सक्शन।
- KRH-पश्चिम बंगाल के 20 मिलीलीटर धोने के लिए जोड़ें। दो अतिरिक्त washes के लिए 3.4 कदम से दोहराएँ।
- सेल मात्रा पर निर्भर करता है, 5 या 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा adipocyte निलंबन लाने के लिए बफर लीजिए। खंड 5 में कदम के साथ आगे बढ़ाना है।
- अगर वांछित आगे प्राथमिक सेल संस्कृति के लिए centrifugation द्वारा 60cc सिरिंज (3000 आरपीएम, आरटी, 5 मिनट) के साथ एकत्र बफर से स्ट्रोमल-संवहनी अंश को पुनः प्राप्त करें (तकनीक) नहीं दिखाया।
4. परिपक्व adipocyte सेल गिनती
- लोड एक गिनती चैम्बर (रुधिरकोशिकामापी) में धीरे हिल adipocyte निलंबन के 10 μl। चार प्रतियों में कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं।
- पृथक परिपक्व कोशिकाओं की संख्या की गणना।
टी-25 फ्लास्क में 5. परिपक्व adipocyte Dedifferentiation
- DMEM / F12-20% बछड़ा सीरम के साथ मात्रा की ¾ करने के लिए एक 25 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क भरें।
- सेल गिनती के अनुसार, फ्लास्क में 500,000 से परिपक्व कोशिकाओं डालना। पूरी तरह से मध्यम के साथ एक 50ml ट्यूब का उपयोग कर फ्लास्क भरें और संभव के रूप में कई बुलबुले को दूर।
- कुप्पी पर unvented टोपी भाड़ में।
- संक्रमण से बचने के लिए ऊष्मायन के लिए पहले इथेनॉल के साथ कुप्पी साफ करें।
- सेलुलर पालन बाधित हो सकता है कि संस्कृति में आंदोलन से बचने के लिए इसे छू बिना उल्टा एक सप्ताह के लिए फ्लास्क सेते हैं।
- उल्टे संस्कृति के 7 दिनों में कुप्पी पीछे करने से पहले, धीरे अचानक आंदोलनों से परहेज, फ्लास्क में हेरफेर और आकांक्षा से फ्लास्क में सभी मध्यम हटा दें।
- DMEM-F12-20% बछड़ा सीरम के 12 मिलीलीटर जोड़ें और मानक तकनीक के साथ कोशिकाओं खेती। एक फ़िल्टर, निकाल टोपी कुप्पी में जोड़ा जा सकता है।
6 अच्छी तरह से थाली में 6. परिपक्व adipocyte Dedifferentiation
- 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह के तल पर एक coverslip जगह
- प्रत्येक coverslip के शीर्ष पर एक साढ़े "प्लास्टिक झाड़ी जोड़ें।
- 20% बछड़ा सीरम DMEM माध्यम के 8 मिलीलीटर के साथ कुओं भरें।
- प्रत्येक प्लास्टिक झाड़ी पर एक coverslip रखो।
- स्लाइड और स्लाइड के तहत कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए ट्यूब (अच्छी तरह से प्रति 50,000 कोशिकाओं) के बीच pipet टिप डालें।
- एक सप्ताह के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं।
- प्रत्येक अच्छी तरह से 20% बछड़ा सीरम के साथ पूरक मीडिया के 2 मिलीग्राम से युक्त और आगे बढ़ाने संस्कृति में संलग्न कोशिकाओं के साथ रिवर्स coverslip के।
- कोशिकाओं इम्यूनोफ्लोरेसेंस सहित कई उद्देश्यों के लिए dedifferentiation के दौर से गुजर के साथ coverslip का उपयोग करें (तकनीक) नहीं दिखाया।
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Representative Results
मेजर morphological परिवर्तन dedifferentiation (चित्रा 1) के दौरान adipocytes परिपक्व करने के लिए होते हैं। चित्रा 2 में दिखाया गया है, dedifferentiation के दौर से गुजर कोशिकाओं प्रतिदीप्ति विश्लेषण के लिए एक विरोधी FABP4 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। तंतुप्रसू की तरह कोशिकाओं का बहुमत नहीं था, जबकि एक गोल आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं FABP4 प्रोटीन व्यक्त किया। Dedifferentiation के बाद, DFAT कोशिकाओं कई मार्ग के लिए मानक प्रक्रियाओं के साथ खेती की जा सकती है। हम मानव omental और चमड़े के नीचे DFAT सेल लाइनों के लिए अधिक से अधिक 15 अंश तक पहुँचने के लिए सक्षम किया गया है (डेटा) नहीं दिखाया।
4 दिन (बी) के 7 दिन और संस्कृति। पिक्चर्स के 12 दिनों में (सी) में कम से समय (ए) से अधिक परिपक्व adipocytes dedifferentiating चित्रा 1. आकृति विज्ञान एक चरण विपरीत microscop का उपयोग कर ऊष्मायन के दौरान अलग-अलग समय अंक पर ले जाया गयाई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Adipocytes में FABP4 प्रोटीन चित्रा 2. जांच dedifferentiation के दौर से गुजर। प्रकोष्ठों dedifferentiation के 13 दिनों के बाद तय की और immunofluorescence के लिए विरोधी FABP4 एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। नाभिक DAPI धुंधला के साथ कल्पना कर रहे थे। वाम: इम्यूनोफ्लोरेसेंस इसी के Brightfield छवि। अधिकार: मर्ज किए गए छवि में दिखाया गया है (FABP4-लाल, नाभिक-नीले-10X)। लम्बी कोशिकाओं जबकि दौर आकृति विज्ञान एक्सप्रेस FABP4, एक परिपक्व adipocyte मार्कर, साथ adipocytes अब इसे व्यक्त करते हैं। स्केल बार: एक इकाई = 0.25mm इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
छत संस्कृति तकनीक के साथ परिपक्व adipocytes की Dedifferentiation देशी वसा ऊतकों का एक छोटा सा नमूना से वसा की स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक नया दृष्टिकोण है। हमारे अनुभव और 2 अन्य की उस आधार पर, ऊतक के एक ग्राम में एक 25 सेमी 2 फ्लास्क थाली करने के लिए और एकरूपता Poloni और सहयोगियों 3 द्वारा प्रदर्शन किया गया है, जिसके लिए DFAT कोशिकाओं की आबादी प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है। Adipocyte dedifferentiation स्वतंत्र रूप से अपनी उम्र, लिंग और अन्य विशेषताओं का, किसी भी दाता से कोशिकाओं के साथ संभव लगता है। DFAT प्राप्त की, जिसके परिणामस्वरूप आबादी के बीच, कुछ गोल या पूरी तरह से dedifferentiate नहीं था कि आंशिक रूप से लम्बी कोशिकाओं बनी हुई है। वे ट्रिप्सिन मीडिया मिश्रण में नाव के रूप में इन कोशिकाओं को आमतौर पर संस्कृति बीतने के माध्यम से खारिज कर रहे हैं।
इन कोशिकाओं के Multipotency की स्थापना की और सेल थेरेपी 2,3 के लिए उनके उपयोग का समर्थन करता है। उनकी उच्च proliferative क्षमता भी है, बताया गया है जो मैंस्टेम सेल अनुप्रयोगों के लिए 2 सेल संस्कृति की एक महत्वपूर्ण पहलू है। मानव DFAT कोशिकाओं के साथ अध्ययन वे अपने replicative और भेदभाव क्षमता 18 के आधार पर, एक ही दाता से ए एस सी की तुलना में अधिक कुशल हो सकता है कि संकेत दिया है। हाल ही में एक मामले का अध्ययन DFAT कोशिकाओं adipocytes और अस्थिकोरक में अंतर करने के लिए और अधिक कुशल थे, और एक ही व्यक्ति, मोटापा और मधुमेह 18 के साथ एक दाता से ए एस सी की तुलना में अधिक टेलोमिरेज स्तर पर था कि समर्थन करता है। इस प्रकार, छत संस्कृति के उपयोग के लिए पहले से ही इस्तेमाल किया एएससी की तुलना में अधिक कुशल वसा की स्टेम कोशिकाओं को उपलब्ध करा सकता है। हालांकि, अतिरिक्त प्रयोगों स्पष्ट रूप से इस बिंदु का आकलन करने की जरूरत है।
हमारे 6 अच्छी तरह से थाली छत संस्कृति तकनीक dedifferentiation प्रक्रिया ही के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। कोशिकाओं की एक न्यूनतम संख्या चढ़ाया और विशिष्ट समय अंक के अध्ययन के लिए अनुमति देता जा सकता है। उदाहरण के लिए, हम adipocytes underg से इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन करने के लिए 6 अच्छी तरह से थाली से खुर्दबीन स्लाइड एकत्रoing dedifferentiation (चित्रा 2)। के साथ या प्रतिदीप्ति बिना, miscroscopy प्रदर्शन, dedifferentiation के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए प्रासंगिक है।
आवेदन सेल स्टेम करने के लिए इसके अलावा, DFAT कोशिकाओं शारीरिक अध्ययन के लिए एक दिलचस्प मॉडल का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। केवल कुछ अध्ययनों जीन अभिव्यक्ति और दोनों प्रकार की कोशिकाओं के कार्यों की जांच की। एक ही वसा डिब्बे से संक्षिप्त, ए एस सी और DFAT में जीन की अभिव्यक्ति और स्राव 4 में समानता दिखाया। वही दाता से ए एस सी और DFAT के बीच और अधिक तुलना जरूरी हैं।
अंत में, हम वसा ऊतकों collagenase पाचन की अच्छी तरह से स्थापित तकनीक और छत संस्कृति तकनीक का उपयोग मानव वसा ऊतकों से DFAT कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इस तकनीकी रिपोर्ट में दिखाते हैं। हमारी मूल 6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप और आमतौर पर इस्तेमाल कुप्पी विधि बड़ा लोकप्रियता की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, जबकि dedifferentiation प्रक्रिया पर ज्ञान को बढ़ाने में मदद कर सकते हैंDFAT कोशिकाओं के रिश्तों। इस प्रोटोकॉल के प्रमुख सीमा रोगी लिखा है और सूचित सहमति प्राप्त करने के लिए एक सर्जरी टीम और नैतिकता के प्रबंधन के साथ सहयोग पर निर्भर करता है जो मानव वसा ऊतकों के लिए उपयोग है। परिपक्व कोशिकाओं हेरफेर में सावधानियों की आवश्यकता है जो अत्यधिक संवेदनशील हैं। हम इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल, विशेष रूप से टी 25flask में चढ़ाया जा करने के लिए adipocytes की संख्या और 6 अच्छी तरह से थाली प्रारूप अनुकूलित और कोई बड़ी अतिरिक्त संशोधनों या समस्या निवारण पूर्वानुमानित किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
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