Protocol
Ethische verklaring: Het project is goedgekeurd door Research Ethics Committee IUCPQ goedgekeurd voorafgaand aan de rekrutering van patiënten. Voor de toepassing van dit artikel / video, we verkregen weefsels van 2 patiënten: 1) een 62-jarige mannelijke patiënt met een BMI van 50,7 kg / m 2 en 2) een 35-jarige vrouwelijke patiënt met een BMI van 57 kg / m2. Experimenten kan met beide vetcompartimenten, maar zijn beperkt tot een vet compartiment voor de doeleinden van deze video. Technische aspecten van de video werden uitgevoerd met patiënten 1 en FABP4 immunofluorescentie werd uitgevoerd met gededifferentieerde cellen van patiënt 2.
1. monster verwerking
- Vraag chirurgen om vetweefsel te verzamelen van de omental en onderhuids vet compartimenten ten tijde van de laparoscopische bariatrische chirurgie.
- Brengen snel vet monsters naar het laboratorium bij RT en direct te verwerken.
- Voer vertering in het laboratorium, in een niet-steriele atmosfeer. Decellen zal uiteindelijk worden overgebracht naar de kweekkamer en gekweekt onder steriele omstandigheden. Om besmetting te voorkomen, te bereiden KRH buffer met gedistilleerd en gefilterd water en volgen door een filtratie (0,22 pm filter) voorafgaand aan de spijsvertering. Grondig reinigen buizen met ethanol voorafgaande overdracht in de celkweek kap voor kolf en plaat voorbereiding.
- Plaats vetweefsel op een vooraf gewogen gerecht en opnemen gewicht. Bevestig een klein stukje van elk weefselmonster (minder dan 1 cm2) in 10% formaline buffer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur voor inbedden in paraffine. Gebruik deze ingebed monster voor immunohistochemie experimenten (techniek niet getoond).
- Plaats een stuk in een 50 ml buis en kort vriezen in vloeibare stikstof voor opslag bij -80 ° C voor verdere studies in gehele vetweefsel (bv genexpressie - techniek niet getoond).
2. Collagenase Spijsvertering
- Leg de resterende vetweefsel stuk in een 50 ml tuvoor vertering.
- Voeg 4 ml KRH-WB aangevuld met collagenase (350 U / ml) per gram monster in de destructiebuis.
- Hak vetweefsel met een schaar.
- Plaats gehakt vetweefsel suspensie in een shaker, 37 ° C, rpm maximaal 90, voor een 45 minuten durende incubatie (maximaal 1 uur).
3. Zuivering van Adipocyten en preadipocyten
- Giet de doorschijnende oplossing met weinig stukjes vet door een 400 uM nylon gaas in een plastic beker.
- Met een pincet, wrijf de cel voorbereiding op het nylon gaas en was met 5 ml KRH-WB.
- Fijn overdracht van de gefiltreerde celsuspensie in een 50 ml buis met de plastic buis erin en een 60 cc spuit bevestigd aan de slang uiteinde.
- Laat de suspensie met volwassen adipocyten staan voor ongeveer 10 minuten, waardoor de cellen aan de bovenzijde van de buffer bereiken flotatie.
- Langzaam zuigen de buffer op de bodem van de buis met behulp 60cc syringe afzuiging.
- Voeg 20 ml KRH-WB te wassen. Herhaal vanaf stap 3.4 voor 2 extra wasbeurten.
- Verzamel de buffer de adipocyten suspensie tot een eindvolume van 5 of 10 ml te brengen, afhankelijk van hoeveelheid cellen. Na te streven met stappen in paragraaf 5.
- Herstel de stromale vasculaire fractie uit de verzamelde met 60 cc spuit door centrifugatie (3000 rpm, kamertemperatuur, 5 minuten) voor primaire celkweek desgewenst buffer (techniek niet getoond).
4. Volwassen Adipocyte celgetal
- Load 10 ul van zacht geschud adipocyt suspensie in een telkamer (haemocytometer). Voeren celgetal in viervoud.
- Bereken aantal geïsoleerde volwassen cellen.
5. Volwassen Adipocyte dedifferentiation in T-25 Kolf
- Vul een 25 cm 2 weefselkweek kolf tot ¾ van het volume met DMEM / F12-20% kalf serum.
- Volgens celgetal, giet 500.000 volwassen cellen in de kolf. Vul de kolf compleet met een 50 ml buis met medium en verwijder zo veel bubbels als mogelijk.
- Schroef de ongeventileerde dop op de fles.
- Reinig de kolf met ethanol voorafgaand aan de incubatie om besmetting te voorkomen.
- Incubeer de fles op zijn kop voor een week zonder het aan te raken om beweging in de cultuur die cellulaire hechting kunnen verstoren te voorkomen.
- Voorafgaand aan het omkeren van de kolf bij 7 dagen van omgekeerde cultuur, voorzichtig manipuleren van de kolf en verwijder alle medium in de kolf door aspiratie, het vermijden van abrupte bewegingen.
- Voeg 12 ml van DMEM-F12-20% kalfsserum en cultiveren cellen met standaard technieken. Een gefiltreerd ontluchtingsdop worden toegevoegd aan de kolf.
6. Volwassen Adipocyte dedifferentiation in een 6-wells plaat
- Plaats een dekglaasje op de bodem van elk putje van een 6-well plaat
- Voeg een ½ "plastic bus op de top van elke dekglaasje.
- Vul putjes met 8 ml 20% kalfsserum-DMEM medium.
- Zet een dekglaasje op elke plastic bus.
- Steek pipet tip tussen de glijbaan en de buis om cellen te injecteren onder de glijbaan (50.000 cellen per putje).
- Incubeer de platen in een standaard celkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende een week.
- Reverse dekglaasje met aangehechte cellen in elk putje met 2 ml medium aangevuld met 20% kalfsserum en nastreven cultuur.
- Gebruik dekglaasje met cellen die dedifferentiatie voor verschillende doeleinden zoals immunofluorescentie (techniek niet getoond).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Belangrijke morfologische wijzigingen opkomen bij adipocyten vervaldatum binnen dedifferentiatie (figuur 1). Zoals getoond in Figuur 2, werden cellen die dedifferentiatie gekleurd met een anti-FABP4 antilichaam voor fluorescentieanalyse. Cellen met een ronde morfologie sprak de FABP4 eiwit, terwijl de meerderheid van de fibroblast-achtige cellen niet. Na dedifferentiation, kan DFAT cellen worden gekweekt met standaard procedures voor de verschillende passages. We zijn in staat om meer dan 15 passages voor menselijke omental en onderhuids DFAT cellijnen te bereiken geweest (gegevens niet getoond).
Figuur 1. Morfologie van dedifferentiërende mature adipocyten tijd (A) en 4 dagen (B) na 7 dagen en (C) na 12 dagen kweek. Beelden werden genomen op verschillende tijdstippen tijdens de incubatie met een fase-contrast microscope. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Detectie van FABP4 eiwit in adipocyten ondergaan dedifferentiation. De cellen werden vastgesteld na 13 dagen van dedifferentiation en gekleurd met anti-FABP4 antilichaam voor immunofluorescentie. Kernen werden gevisualiseerd met DAPI kleuring. Links: Helderveld beeld van overeenkomstige immunofluorescentie. Rechts: De samengevoegde afbeelding wordt weergegeven (FABP4-rood, Kernen-blauw-10X). Adipocyten met ronde morfologie uitdrukkelijke FABP4, een volwassen vetcellen marker, terwijl langgerekte cellen niet meer uitdrukken. Schaal bar: 1 eenheid = 0.25mm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dedifferentiatie van rijpe adipocyten het plafond cultuur techniek is een nieuwe benadering adipose stamcellen verkregen uit een klein monster van natief vetweefsel. Gebaseerd op onze ervaring en die van anderen 2, een gram weefsel is voldoende om een 25-cm2 kolf plaat en een populatie van cellen DFAT waarvoor homogeniteit is aangetoond door Poloni en medewerkers 3 verkrijgen. Adipocyten dedifferentiation lijkt mogelijk met cellen uit een donor, onafhankelijk van hun leeftijd, geslacht en andere kenmerken. Onder de resulterende populatie van DFAT verkregen, blijft er een paar ronde of gedeeltelijk langgerekte cellen die niet volledig differentiëren. Deze cellen worden meestal weggegooid door de cultuur passage als ze zweven in de trypsine-mediamix.
Multipotentie van deze cellen wordt opgericht en ondersteunt het gebruik ervan voor celtherapie 2,3. Hun hoge proliferatieve capaciteit is ook gemeld, dat isa waardevolle aspect van celkweek voor stamceltransplantatie toepassingen 2. Studies met menselijke cellen DFAT aangegeven dat zij efficiënter dan ASC uit dezelfde donor kan zijn, op basis van hun replicatie en differentiatie capaciteit 18. Een recente studie ondersteunt dat DFAT cellen efficiënter te differentiëren tot adipocyten en osteoblasten en hadden hogere telomerase niveaus dan ASC van hetzelfde individu, een donor met obesitas en diabetes 18. Aldus kan het gebruik van maximum cultuur efficiëntere adipose stamcellen dan reeds ASC verschaffen. Echter aanvullende experimenten nodig om dit punt duidelijk te beoordelen.
De 6-well plaat plafond cultuur techniek maakt voor de studie van de dedifferentiatie zelf. Een minimaal aantal cellen worden uitgeplaat en maakt het bestuderen van specifieke tijdstippen. Zo hebben we verzameld de microscoop dia van een 6-wells plaat te immunofluorescentie voeren vanaf adipocyten undergoing dedifferentiatie (figuur 2). Presterende miscroscopy, met of zonder fluorescentie, is zeer relevant voor de verschillende aspecten van dedifferentiation beoordelen.
Naast mobiele toepassingen voortkomen, kan DFAT cellen een interessant model voor de fysiologische studies vertegenwoordigen. Slechts enkele studies onderzocht genexpressie en functies van beide celtypen. In het kort, ASC en DFAT uit dezelfde vet compartiment toonde gelijkenissen in genexpressie en secretie 4. Meer vergelijkingen tussen ascorbaat en DFAT van dezelfde donor nodig.
Concluderend tonen we in dit technisch verslag hoe DFAT cellen te verkrijgen uit menselijk vetweefsel met de gevestigde techniek van vetweefsel collagenase digestie en het plafond kweektechniek. Onze oorspronkelijke 6-well plaat formaat kan helpen om kennis over de dedifferentiatie proces dat het meer gebruikelijke kolf werkwijze maakt de productie van grotere populatieschriften van DFAT cellen. De belangrijkste beperking van dit protocol is de toegang tot het menselijk vetweefsel dat berust op samenwerking met een operatie team en ethiek management om de patiënt schriftelijke en geïnformeerde toestemming te verkrijgen. Rijpe cellen zijn zeer gevoelig die voorzorgsmaatregelen manipulatie vereist. We geoptimaliseerd protocol, met name het aantal adipocyten worden uitgeplaat in de T-25flask en de 6-well plaat formaat, voor optimale resultaten en zonder grote extra modificaties of het oplossen kan worden verwacht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| Adenosine | Sigma | A4036 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Any brand can be used | ||
| KCl | Any brand can be used | ||
| CaCl2 | Any brand can be used | ||
| MgCl2 | Any brand can be used | ||
| KH2PO4 | Any brand can be used | ||
| HEPES | Any brand can be used | ||
| Glucose | Any brand can be used | ||
| Type I collagenase | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml) |
| Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In plastic bushing | Iberville | 2704-CP | SKU:1000120918 (Home Depot) |
| Liquid nitrogen | Linde | ||
| Formalin soluton, neutral buffered, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile tweezers | |||
| Sterile scissors | |||
| 60 cc syringes | BD Syringe | ||
| Plastic tubing | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH) | Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid | ||
| KRH-WB supplemented with Type I collagenase | Add 350 U/ml of Type I collagenase | ||
| T25 unvented cap tissue culture flask | Sarsted or other brand | ||
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon or other brand | ||
| Microscope cover glass 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile beakers |
References
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
- Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
- Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892 (2013).
- Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
- Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
- Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
- Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
- Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
- Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
- Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
- Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
- Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
- Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
- Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
- Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
- Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).
