Introduction
היכולת לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לתאים כמו תאי גזע עוברי הנגרמים גזע pluripotent (iPSCs) התגלה לראשונה על ידי et al טקהאשי. בשנת 2007 1. Fibroblasts עורי אדם transduced עם רטרווירוסים להביע ארבעה גורמי שעתוק (יאמאנאקה מה שזכה לכינוי גורמי Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, וKlf4) הוצג להיות דומה מאוד לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) המבוססים על מורפולוגיה, הפצה, ביטוי גנים, ומעמד אפיגנטיים; באופן מכריע, iPSCs גם מסוגל להבדיל לתאים של כל שלוש השכבות הנבט 1. הקיבולת הפוטנציאלית ובידול השגשוג של iPSCs גורמת להם כלים מאוד אטרקטיביים; על ידי תכנות מחדש של תאים מחולים הסובלים ממחלות מסוימות, יכול לשמש גם כiPSCs מערכות במבחנה מודל מחלה וכמו הרפוי פוטנציאלי.
לצורך האחרון, כמה בעיות יש לטפל לפני את מלוא הפוטנציאל של iPSCsבסביבה קלינית יכול להתממש; הפוטנציאל הסרטני במבחנה של hESCs התרבותי וiPSCs, השימוש בנגזרי xenogenic במהלך תכנות מחדש ותחזוקת תא, והצורך לעקוב אחר תאים מושתלים in vivo כל המכשולים הקריטיים ליישום הקליני בתאי גזע pluripotent (נבדק על ידי et Hentze ב. 2). פתרון אידיאלי לצורך מעקב אחר תאים מובחנים לאחר ההשתלה יהיה כרוך סמן חזותי לגילוי שמתנגד השתקה ואת הגיוונים ללא תלות ביישום. ביטוי חזק ומתמשך של transgenes המשולב הוא הכי בקלות להשגה כאשר DNA אקסוגני מוחדר לוקוסים בטוח נמל; כלומר, אתרים הגנומי המאפשרים שעתוק מספק של וקטור משולב ובו בזמן מיתון הפרעות ביטוי בגנים 3 שכנים. אתר אחד כזה שהתאפיין גם מאוד מאז גילויו הוא integr וירוס adeno הקשוריםאתר ation 1 (AAVS1), באינטרון הראשון של 1 12C מקטע הרגולציה גן phosphatase החלבון (PPP1R12C). מוקד זה הוכח לא רק כדי לאפשר ספג וביטוי חזק של transgenes המשולב בזמן הוארך בתרבות ובבידול המבחנה 3, אלא גם כדי להגן מקיפים גנים מהפרעות תעתיק 4; שני התכונות נחשבות בשל נוכחותם של אלמנטים המבודדים הכרומטין אנדוגני איגוף אתר AAVS1 5.
התקדמות בכלים הנדסי הגנום מעל רק בעשור האחרון הקלה באופן משמעותי את קלות ויעילות שבה ניתן להשיג מניפולציות גנטיות בכל סוג תא. בעוד ניסויים מוצלחים מוקדמים הסתמכו על רמות נמוכות ביותר של רקומבינציה אנדוגני ההומולוגית (HR) עם תורם הציג להשיג גן המיקוד בESCs 6,7, השימוש בnucleases אתר ספציפי, כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs), שsignificantly לגרום רקומבינציה ההומולוגית באמצעות הדור של הפסקת פעמיים תקועים DNA גדל היעילות של ניסויים כאלה 8,9 מאוד. Repurposing של שתי effectors כמו activator-השעתוק (הסיפורים) של סוגי Xanthomonas פתוגניים צמח וחוזר פרוקריוטים התקבץ interspaced באופן קבוע הקצר palindromic / מערכת Cas9 לnucleases מעצב אתר ספציפי יעיל (CRISPR) הפך גן מיקוד בתאי גזע pluripotent ונגיש מתודולוגיה מעשית 10-13.
מאמר האחרון שתואר שיטה יעילה לשילוב היציב של קלטת כתב ניאון ירוקה למוקד בטוח נמל AAVS1 בiPSCs האנושי באמצעות nucleases TALE (TALENs) 14. iPSCs הממוקד אלו שומרים על הקרינה שלהם גם לאחר התמיינות מכוונת לשריר לב והשתלה לתוך מודל עכבר של אוטם שריר לב (MI), מתן ראיות חזקות לשירות כזהיציבות בתאי גזע pluripotent ניאון 14. כדי להשיג מושבות ממוקדות, שיטת גן-מלכודת שימשה בי שחבור-acceptor (SA), רצף הפפטיד ביקוע עצמי 2A מציב את puromycin N-אצטיל-transferase הגן (PAC) תחת השליטה של אמרגן PPP1R12C אנדוגני; כך, רק iPSCs ששלב תורם DNA במוקד AAVS1 להביע PAC, טיוח אותם לבחירה המבוסס על puromycin התנגדות; (איור 1, 15). פרוטוקול זה מפרט את הנהלים של יצירת AAVS1-GFP iPSCs דיווח בעיתון האחרון 14, כולל התהליך של transfecting iPSCs עם TALENs ותורם 9.8 kb לשלב קטע DNA 4.2kb למוקד AAVS1 בטוח-הנמל, בחירת iPSCs המבוססים על puromycin-התנגדות, ומושבות קטיף להרחבה משובט. הטכניקות המתוארות במסמך זה יכול להיות מיושם על ניסויי הנדסה גנטית רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ממברנה מטריקס מרתף וציפוי של Plasticware
- הנח את מניית מטריקס קרום במרתף הקפואה מ-20 ° C על קרח ולהפשיר לילה בשעה 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר הפשרה, aliquots פיפטה 2 מ"ג של מטריצת קרום במרתף לתוך צינורות eppendorf טרום צוננים. אחסן אלה ב -20 ° C עד צורך.
- כדי להכין צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף, להפשיר aliquot אחד על קרח עד החתיכה האחרונה של קרח בנעלם צינור Eppendorf (בדרך כלל תוך ~ 2 שעות).
- לאחר הפשרה, להוסיף מטריצת קרום במרתף 12 מיליליטר של DMEM / F12 הקר (4 מעלות צלזיוס) כדי להפוך את פתרון ציפוי מטריצת קרום במרתף.
- הוסף פתרון מטריצת קרום במרתף לכלי התרבות המתאימים. לצלחת 6-היטב, לוותר 1 מ"ל לכל טוב. לערבל את הצלחת לוודא פתרון מטריצת הקרום במרתף מכסה לחלוטין כל טוב.
- Parafilm לאטום את הצלחת / המנה מצופה מטריצת קרום במרתף, ולדגור על רוטמפרטורה מ 'במשך שעה 1 לפני השימוש. לחלופין, צלחות מצופים מטריצת קרום במרתף חנות / מנות ב 4 ° C ולהשתמש בתוך 2 שבועות של ציפוי.
הערה: הוספת DMEM / F12 נוסף לצלחת / המנה מצופה מטריצת קרום במרתף כדי למנוע התייבשות. לפני שימוש 4 ° C צלחת / מנה מצופה מטריצת קרום במרתף מאוחסן, למקם אותו בארון בטיחות ביולוגי ולאפשר להם להגיע לטמפרטורת חדר למשך לפחות 30 דקות. - מטריצת קרום במרתף לשאוב לפני התוספת של מדיום ותאים לחלוטין.
2. הכנת בינונית E8
- להכין מדיום תרבות E8 על ידי הפשרת תוספת E8 הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר 10 מיליליטר של מדיום בסיס E8 מהמניות 500 מיליליטר וזורקים.
- פיפטה כל בקבוקון 10 מיליליטר של תוסף E8 ישירות לתוך 490 מיליליטר של מדיום בסיס E8. האם מדיום E8 מלא לא חם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, כמו תנודות טמפרטורה חוזרות ונשנות יכולות לבזות את bFGF במכלוליםבינוני te E8.
- השתמש בינוני E8 מלא בתוך 2 שבועות של תוספת של התוספת.
3. הפשרה של iPSCs
- הסר בקבוקון של iPSCs הקפוא מהחנקן נוזלי ומניחים על קרח יבש.
- במהירות להפשיר את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס; לערבל את הבקבוקון באמבט המים עד שבר זעיר בלבד של שרידי קרח.
- תרסיס הבקבוקון עם 70% אתנול והעברה לארון בטיחות ביולוגי.
- הוסף 1 מיליליטר של dropwise הבינוני טמפרטורת חדר E8 ישירות לבקבוקון.
- בעזרת פיפטה 2 מיליליטר, להעביר את dropwise ההשעיה תא לתוך 9 מיליליטר של מדיום E8 בצינור חרוטי 15 מיליליטר. לערבל את הצינור לעתים קרובות כדי להבטיח שהתאים ובינוניים מערבבים היטב במהירות.
- צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant, וresuspend התא גלולה בנפח מתאים של E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632.
- הוסף את התאים למספר מתאים של מרתף membranמצופי מטריצת דואר בארות, ומקום ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה. מומלץ צלחת לפחות 0.2 x 10 6 iPSC לכל טוב של 6-גם צלחת כדי לאפשר התאוששות מהירה לאחר הפשרה.
4. תחזוקה וPassaging השגרתי של iPSCs
- רענן בינוני E8 יומי.
- לפקח על המורפולוגיה וconfluency של תאים עם מיקרוסקופ הפוכה. iPSCs באיכות גבוהה גדל במושבות שטוחות עם גבולות ברורים; מושבות בודדות להחזיק הופעה "כמו מרוצפת-".
- מעבר תאי iPSCs כאשר הם מגיעים ~ confluency 70%.
- הכן פתרון passaging EDTA על ידי הוספת 0.9 g NaCl ו -500 EDTA μl 0.5 M 500 מיליליטר DPBS. מערבבים היטב כדי לפזר NaCl, ומסנן אבק לעקר. לחמם aliquot של פתרון passaging באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני passaging.
- למעבר, לשאוב בילה בינוני תרבות תאים לשטוף פעם אחת עם נפח שווה של pas החםsaging פתרון. לשאוב, ומספיק EDTA פיפטה פתרון passaging למעייל התאים (1 מיליליטר לכל טוב של 6-גם צלחת).
- מניחים את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה ולבחון את מושבות iPSC. המראה של חורים בתוך מושבות וגבולות מורמים יתברר בתוך 2 עד 5 דקות.
- בזהירות לשאוב פתרון passaging EDTA.
- בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, לוותר 4 מיליליטר של מדיום E8 (אם משתמש בצלחת 6-היטב) בלחץ גבוה ישירות לתוך זה גם להיות passaged.
- לאסוף את גושי iPSC, ומחולק למספר מתאים של בארות בהתאם ליחס הפיצול בין 1: 8 ל01:12. לא, כמו פירוק של גושי תאים יגרום יתר פיפטה בכדאיות עניה.
- מניחים את הצלחת בחממה, ולטלטל את הצלחת בחזרה-ושוב וכמה פעמים מצד לצד כדי לפזר את התאים.
5. הכנת MEFs וiPSCs לTansfection
- 48 שעות לפני transfection, iPSCs המעבר ב ~ 1: 6 לארבע או יותר בארות צלחת 6-גם מצופי מטריצת קרום במרתף, כך שהם יהיו מחוברים% 70 יומיים ומכאן.
- למחרת, להפשיר MEFs DR4 לתוך מדיום MEF בהיקף של DMEM (גלוקוז גבוהה) בתוספת 10% FBS ו1x MEM-NEAA.
- צלחת MEFs DR4 לשתי מנות של 10 סנטימטר ב ~ 2 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר ודגירת הלילה על 37 מעלות צלזיוס.
- ביום transfection, לשנות בינוני MEF לE8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 30 דקות לפני ביצוע transfection על iPSCs.
- אופציונאלי: אם ניתוח התזרים cytometric של לאחר transfection iPSCs הוא רצוי, להסיר את צלחת קרום במרתף מצופה מטריצה מ4 ° C ומקום בטמפ 'החדר.
- אופציונאלי: 4 שעות לפני transfection, מוסף תרבות iPSC מראש transfection עם Y-27632 בריכוז הסופי של 10 מיקרומטר.
6. עדין-תא דיסוציאציה מגיב לטיפולnd Transfection של iPSCs באמצעות מערכת Electroporation
- הסר פתרון transfection התא ראשוני P3 מ4 ° C ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ~. להוסיף את תוספת 100 μl השלם לפתרון transfection לפני השימוש.
- מגיב חם עדינים תאי ניתוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- להשיג AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 וPZT-AAVS1-R1) תורם וAAVS1-CAG-EGFP מ-20 ° C.
- הסר iPSCs מן החממה ולשטוף פעם אחת עם DPBS.
- הוסף 1 מיליליטר של מגיב ניתוק עדין תאים לכל טוב, ודגירת iPSCs על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, או עד שיותר מ -50% מהתאים ניתקו מכלי התרבות.
- פיפטה את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים בעזרת פיפטה p1000 לנתק את כל תאים שנותרו מספינת התרבות, וכדי לשבור את גושי iPSC.
- הוסף 2 מיליליטר של מדיום E8 היטב כל אחד, ופיפטה מספר פעמים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר לפיורדאאה disaggregate גושי תאים לתאים בודדים
הערה: יעילות Transfection יורדת באופן משמעותי אם גושי תא אינם מספיק מפוצלים. - לאסוף iPSCs בצינור חרוטי 15 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 3 דקות 100 XG.
- לשאוב supernatant, ותאים גלולים בסכום מינימאלי של מדיום E8.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer לאחר היישום של כתם חיוני כמו 0.4% Trypan כחול. ודא כי תאים הם ניתקו מספיק תוך ספירת (1-3 תאים לכל "גוש").
- לוותר 3 x 10 6 תאים לכל אחד משני צינורות חרוטי 15 מיליליטר, וספין למטה שוב ב 100 XG במשך 3 דקות.
הערה: צנטריפוגה במהירות נמוכה מפחיתה את מתח התא ומאפשרת מחדש השעיה קלה של iPSCs לפני electroporation. - הגדר את מערכת electroporation לתכנית הספציפית תאים מהסוג לקו העוברי האנושי בתאי גזע H9 (תכנית CB-150).
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant מcelכדורי l. לגלולה אחת, להוסיף 10 מיקרוגרם של תורם HR כמדגם שליטה. לגלולה אחרת להוסיף 10 מיקרוגרם של תורם HR, יחד עם 5 מיקרוגרם של כל Talen (PZT-AAVS1-L1 וPZT-AAVS1-R1) כמדגם ניסיוני.
- Resuspend כל תא גלולה בפתרון של transfection התא הראשוני P3 100 μl, ולהעביר לקובט.
- בצע את transfection ולהוסיף מייד 500 μl של מדיום E8 טמפרטורת חדר לכל קובט.
- העבר את dropwise iPSCs transfected לצלחת 10 סנטימטרים אחד המכילה MEFs DR4 מוכן בשלב 5.4.
- אופציונאלי: להוסיף כמה טיפות מכל ניסוי ולאחת מצלחת 6-היטב מצופה מטריצת קרום במרתף אם זרימת cytometry anaylsis של יעילות transfection היא רצויה.
- חזור על שלבים 6.15-6.17 לסיים שתי הדגימות. למחרת, לשטוף תאים עם DPBS פעמיים ולעבור מדיום התרבות NutriStem, המופיע לתמוך תרבות iPSC על מתקני האכלה טובות יותר מאשר E8.
- Trפסגות ביטוי EGFP ansient ב48 עד 72 שעות לאחר transfection; להעריך את יעילות transfection כרצוי.
7. puromycin בחירה של iPSCs הממוקד
- בגין בחירת puromycin 72 שעות לאחר transfection כאשר iPSCs להגיע 70% confluency.
- לNCRM5 iPSCs, יתחיל בחירת puromycin ברמה של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin (1/2 מנה המלאה) המדולל למדיום תרבות NutriStem. ריכוז puromycin האופטימלי עשוי להשתנות מ0.25 ל1 מיקרוגרם / MLL לכמה קווי iPSC.
- iPSCs תרבות ב0.5 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin NutriStem + במשך 3 ימים, מרענן הבינוני יומי.
- אחרי 3 ימים, להגדיל את הריכוז של puromycin ל1 מיקרוגרם / מיליליטר.
- iPSCs תרבות תחת 1 מיקרוגרם / בחירת puromycin מיליליטר במשך 7 עד 8 ימים נוספים, או עד מושבות שונות מופיעים גדולה מספיק למסיק מושבה.
8. מושבה קטיף והרחבה של iPSCs הממוקד
- קרום במרתף שימושמטריצה למעייל צלחת 96-היטב על ידי מחלק 50 μl של פתרון ציפוי מטריצת קרום במרתף (מטריצת קרום במרתף 2 מ"ג המדולל ל -12 מיליליטר DMEM / F12) לתוך כל טוב. אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה לפני השימוש.
- לאחר שאפשר את הצלחת מצופה מטריצת הקרום במרתף כדי להגיע לטמפרטורת חדר, לשאוב את מטריצת הקרום במרתף ולוותר 100 μl E8 בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 לכל אחד.
- הנח מיקרוסקופ הפוכה לארון בטיחות ביולוגי, ולרסס קל עם 70% EtOH לעקר.
- משוך זכוכית פיפטה פסטר מעל מבער בונזן להשיג כלי המושבה קטיף אידיאלי שיש לו "וו" זעיר בקצה. לעקר עם 70% EtOH, ואת המקום במכסת המנוע לייבוש.
- הסר את הצלחת המכילה מושבות iPSC ממוקדות מהחממה, ואת המקום לתוך מכסה המנוע מתחת למיקרוסקופ.
- בחר iPSCs על ידי התחקות מעגל סביב גבול המושבה עם כלי קטיף המושבה.
- השתמש ב" הוו "של כלי המושבה הקטיף כדי לגרד בעדינות ולהסיר את המושבה iPSC מפני שטח של הצלחת. למושבות גדולות יותר, ציור X עם כלי קטיף המושבה לרבעון המושבה תקל תא צמיחה לאחר מחדש ציפוי.
- ברגע שגושי תאים מנותקים וצפים בחופשיות, להשתמש פיפטה p200 מוגדרת ~ 30 μl לאסוף iPSCs. פלייט תאים ישירות לתוך צלחת 96-היטב.
- אופציונאלי: להשתמש פיפטה P20 מוגדרת ~ 5 μl לאסוף iPSCs לתוך צינור eppendorf, ולאחר מכן להוסיף 50 μl מגיב ניתוק עדין תאים לעכל במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לאחר עיכול, להוסיף בינוני E8 500 μl לתוך צינור eppendorf לדלל מגיב ניתוק העדין-תא ולסובב את התאים ב XG 200 בmicrocentrifuge טבלה העליון סטנדרטי למשך 5 דקות. אז לשאוב ביותר של המדיום ולהשאיר ~ 30 μl לresuspend ולהעביר את התאים לתוך הצלחת 96-היטב.
הערה: זוגישה תקל על הניתוק של גוש התא והתרחבות מהירה של מושבה הרימה. - המשך קטיף מושבה עד מספר מספיק של מושבות iPSC נאספו (בערך 20-30 מושבות לכל ניסוי מומלץ).
- לאחר קטיף מושבה, למקם את צלחת 96-היטב באינקובטור במשך לילה. רענן עם מדיום מלא E8 למחרת, ותרבות ומחוברות עד ~ 70%.
- תאי מעבר מ96-היטב לתוך 24 גם, אז ל6-גם, כפי שמתוארים בשלבי 4.5-4.10.
הערה: הכרכים של פתרון EDTA ובינוני E8 צריכים להיות מופחתים באופן יחסי בעת שימוש בבארות קטנות יותר מצלחת 6-היטב. - להעריך הצלחת מיקוד בצומת PCR וניתוח כתם דרום כדי לאשר שילוב ממוקד קלטת והעדר וקטורים הוכנסו באופן אקראי 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיה של הפרוטוקול מסופקת באיור 2, עם תקופות בי iPSCs בתרבית בינונית שונה מודגש על ידי שני ירוקים לE8 או הכחול לNutriStem. חשוב transfect רק iPSCs באיכות גבוהה; לבחון מנות תרבות ברחבי תחזוקה שוטפת ולוודא שתרבויות iPSC מכילות מושבות בעיקר ברורות נושאות מורפולוגיה כמו מרוצפת (איור 3 א); תאים מובחנים לא צריכים לכבוש יותר מ -10% מהתרבות. Transfectability של iPSCs מוערך ומותאם באמצעות הווקטור הקטן Pmax-GFP (איור 4 א-B), כtransfection עם Pmax-GFP בדרך כלל מייצג את היעילות המרבית בשל גודלו הקטן. לדוגמא, שהשגנו 68.6% יעילות transfection עם Pmax-GFP (איור 4). כדי למקד את הכספת-נמל AAVS1, iPSCs הוא passaged באמצעות מגיב ניתוק תא בודד עדין והם transfected עם AAVS1-TALENs וAAVS1-CAG-EGFP (פלסמידים מתוארים באיור 1 א). אז iPSCs transfected הם מצופים בצפיפות מתאימה של DR4 MEFs (איור 3). ביטוי חולף של פסגות AAVS1-CAG-EGFP 48 עד 72 שעות לאחר transfection (איור 3 ג) בשעה; אם ארצה בכך, חלק קטן מiPSCs transfected ניתן FACS נותח. NCRM5 iPSCs ניתן transfected עם היעילות של 60.9% באמצעות תורם AAVS1-CAG-EGFP (איור 4C). יעילות transfection יכולה להשתנות במידה רבה; לניסויים בי GFP + החלק אפילו נמוך כמו 10%, תמשיך בחירת puromycin. לאחר ביצוע בחירת puromycin, שיבוטים בודדים בו מוצגות הקרינה אחידה צריכים להיות גדולים מספיק למסיק מושבה (איור 3D). כדי לבחור שיבוטים, מושבה מתאימה ממוקמת בהגדלה נמוכה (איור 3E) ומבודד על ידי המעקב הראשון ואכסונו (איורים 3F-G). המושבות לרבעים לאחר מכן בעדינות לגרדד מכלי התרבות (איור 3H). בעזרת פיפטה p200, גושי תא מועברים לאחר מכן לאחד היטב צלחת 96-היטב מצופה מטריצת קרום במרתף. iPSCs צריך לצרף בתוך 2-4 שעות של ציפוי (איור 3I). אם קובץ מצורף לא נצפה בתוך 24 שעות, מרתף מטריצת ציפוי קרום או טיפול Y-27632 היו סביר תת-אופטימליים; קרום במרתף מטריצה-מעיל צלחת 96-היטב חדשה ולהכין E8 + 10 מיקרומטר טריים Y-27632 לפני לקטוף עוד מושבות. פעם אחת בפורמט 96-היטב, ממוקד השיבוטים iPSC מורחבים וצריכים להפגין ביטוי יציב ואחיד של GFP (איורים 4D-E).
איור 1: גן מיקוד וקטורים ומיקוד סכמטית. ייצוגים (א) לAAVS1-CAG-EGFP, ופלסמידים PZT-AAVS1-L1 / R1 TALENs שימשו במחקר זה. SA-אלמנט 2A בפלסמיד AAVS1-CAG-EGFP מייצג את הפפטיד ביקוע עצמי אחוי-acceptor ו2A משמש כדי להגביל puromycin N-אצטיל-transferase (PAC) ביטוי גנים לאירועים ממוקד-אינטגרציה. גלובין העוף β-אקטין האמרגן (CAG) משמש לנהוג ביטוי של EGFP. (ב) הבטוח-נמל AAVS1, הכלול בתוך אינטרון 1 של גן PPP1R12C, הוא ממוקד באמצעות TALENs ליצור הפסקת פעמיים תקועים DNA. זה מפעיל את מכונות תיקון רקומבינציה ההומולוגית (HR), אשר לאחר מכן משתמשת ב( זרועות ההומולוגיה נושא איגוף אתר החתך) תורם AAVS1-CAG-EGFP כמצע לתיקון. הקלטת משולבת וגן PAC הוא תחת השליטה של אמרגן PPP1R12C אנדוגני.
איור 2. ציר זמן של ניסוי מיקוד גן. IPSCs בתרבית70% confluency וpassaged ~ 1: 6 ביום -2 (ד-2). MEFs הם מצופים בd-1, וiPSCs נאספים וtransfected בD0. בD1, תקשורת עברה לNutriStem, וiPSCs בתרבית לעוד שני ימים לפני puromycin מתווסף הבינוני בd3. מושבות הן בדרך כלל מוכנות לקטיף על ידי d12. תקופות בי iPSCs בתרבית בינוני E8 מודגשות ירוקות, תוך תקופות של תרבות NutriStem הן בכחול.
איור 3: גן iPSC מיקוד תמונות נציג (א) תמונת שלב של iPSCs באיכות גבוהה.. שימו לב לגבול השלב-בהיר ומורפולוגיה כמו מרוצפת. (B) DR4 MEFs מצופה ב2 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר עשרים וארבע שעות לאחר ההפשרה. (C) שבעים ושתיים שעות שלאחר transfection, EGFP + תאים ניכרו היטב כאשר צפו תחת MICR הקרינהoscope. (ד ') לאחר בחירה מבוססת puromycin ל~ 14 ימים, מושבות בו מוצגות הקרינה GFP אחידה הן גדולות מספיק כדי להיות הרים. (EH) נציג תמונות של תהליך בחירת המושבה. מושבות נאספות בעזרת פיפטה פסטר משכה, תחילה על ידי המתווה את המושבה, ולאחר מכן על ידי אכסונו להשיג גושי תא קטנים יותר. (I) שנבחרו מושבות iPSC לצרף אל פני השטח מצופה מטריצת קרום במרתף של צלחת 96-היטב בתוך 2 ל 4 שעות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ניתוח FACS של יעילות transfection וiPSCs הממוקד המשובט. (א) הבקרה NCRM5 iPSCs ללא transfection של כל פלסמיד. (B) NCRM5iPSCs transfected עם וקטור בדיקה הקטן Pmax-GFP הם FACS נותח לביטוי של GFP. ביטוי חולף של פלסמיד AAVS1-CAG-EGFP (C) מוערך על ידי FACS. מציג שיבוט (D) NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP אחיד ביטוי EGFP חיובי כassayed ידי FACS. שים לב לאשכול ההדוק של iPSCs ניתח בהשוואה לC). (תמונת E) הקרינה של שיבוט NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP מורחב ממוקד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר עבור הדור המוצלח של נמל בטוח AAVS1 ממוקד iPSCs האנושי: (1) ביעילות מספק פלסמידים Talen ותורם לiPSCs ידי transfection; (2) אופטימיזציה של הניתוק של iPSCs לתוך תאים בודדים לפני transfection וציפוי צפיפות לאחר transfection; (3) אופטימיזציה של מינון וזמן של סמים-בחירה מבוססת על הצמיחה של קו iPSC; (4) לנתח בזהירות ולקטוף מושבות ממוקדות והעברה לצלחת חדשה / טוב. בהשוואה לשיטות דומות בשימוש בנייר של Hockemeyer 10, פרוטוקול זה משמש זוג קוד הפתוח AAVS1-TALENs, מגיב ניתוק iPSC שונה, ומכשיר transfection שונה כדי לספק וקטורי TALENs ותורם, שסייע לצמצם את מספר iPSCs משמש ב ניסוי תוך השגת גבוהה transfection ומיקוד יעילות.
כדי להשיג עריכת גן יעילות גבוהה בiPSCs אדם, זה הכרחי כדי לייעל את המשלוח הראשון של edi הגןריאגנטים טינג (DNA / RNA), תוך איזון המוות של התאים החריף שיטת המשלוח וריאגנטים לגרום לiPSCs. המטרה היא למקסם את יעילות המשלוח תוך שמירה על רמה נסבלת נמוכה של מוות של תאים. מאז שהוא קל מאוד להכנת כמויות גדולות של פלסמידים AAVS1-Talen שיכול להשיג 50% יעילות HR> בעזרת תרופת בחירה בiPSCs האנושי, אין זה הכרחי כדי להפוך את mRNAs מפלסמידים Talen. האתגר של אספקה מגיע מתורם פלסמידים גדולים, אשר במקרה זה הוא ~ 10 קילו-בייט. מומלץ להשתמש בתורם AAVS1-CAG-EGFP כדי לבדוק את יעילות משלוח בקווים מסוימים אדם iPSC ולא באמצעות pMaxGFP כלול בערכת transfection, כי pMaxGFP הוא ~ 3.5 kb פלסמיד הקטן וקל מאוד כדי לספק לכל תאים. תורם AAVS1-CAG-EGFP ניתן לשנות באמצעות אנזימי הגבלה שמוצגים באיור 1 א למקד transgenes שונה למוקד AAVS1. תורם kb 12 נוסף, המכיל קלטת 6.4 kb להחליף CAG-EGFP, יש להיותen השתמש בהצלחה כדי להשיג transfection דומה ויעילות מיקוד (מידע לא מוצג). באופן כללי, iPSCs האנושי הם בין הסוגים קשה-transfect תא ויעילות המשלוח לפלסמידים גדולים יכולה להיות נמוכה כמו 5-10%, כפי שנמדדה על ידי זרימת cytometry הניתוח של תאי GFP +. אופטימיזציה נוספת של יעילות transfection תלויה בניתוק הנכון של iPSCs האנושי לתאים בודדים, כי גושי תא יקטינו את הסיכוי להעברת חומרים כימיים עריכת גן לכל תא. פרוטוקול זה משתמש מגיב עדין וניתוק תא מהיר עבודה, אבל טיפול iPSCs במשך יותר מ -10 דקות לא מומלץ. בדרך כלל תרבות iPSC היא מחוברות פחות מ -80% אם הצעד הבא 5.1, מה שהופך את דגירה של 5 דקות עם מגיב ניתוק עדין תאים מחוממים מראש בדרך כלל מספיק כדי לנתק את iPSCs לתוך תאים בודדים עם pipetting העדין. אם יכולים להיות מנותקים לא כל התאים לתאים בודדים לאחר 10 דקות של טיפול, כי תרבית תאים היא מעל-conרהוט או המושבות להיות מאוד קומפקטיות, פשוט לאסוף את המספר המומלץ של תאים בודדים מיותר בארות / צלחות ולהשאיר את התאים המצורפים בחוזקה מאחור. pipetting הכבד אינו מומלץ משום שגז מכאני הוא יותר מזיק לתאים מאשר ניתוק האנזימטית. כאשר עובדים עם iPSCs מוקדם מעבר (לפני המעבר # 15), תרגול ניתוק עדין חשוב מאוד להישרדות תא, כי התאים כבר יותר רגישים ללחץ transfection מ iPSCs מעבר מאוחר. אם קשה להשיג יעילות גבוהה בשתי הישרדות transfection ותא, לבחור את הפרקטיקה שנותנת יעילות transfection הגבוהה ביותר. לאחר transfection, צריכים להיות מצופים התאים בצפיפות שתגיע confluency 50-80% ביום 3 כאשר תרופת בחירה מתחילה. מאז כל קו iPSC גדל בצורה שונה, צפיפות הציפוי לאחר transfection אולי צריכה להיות מותאמת לכל שורת תא. צפיפות ציפוי גבוהה עלולה להוביל לconfluency-על, המפחית את היעילות של DRUg-בחירה, ואילו ציפוי צפיפות נמוכה קיצונית עלולה לגרום להתאוששות וצמיחה של מושבות עמידות לתרופות מושהות. בדרך כלל 3 מיליון iPSCs מתחיל הם מספיק כדי להיות מצופה ל½ 2 10 מנות סנטימטר בהתאם להישרדות והצמיחה של iPSCs הספציפי. באופן דומה, אם באמצעות קו iPSC שנוצר או שעדיין לא נבדק חדשים, יצירת עקומה להרוג puromycin להקים המינון האפקטיבי הנמוך ביותר בתאי untransfected ייתכן שיהיה צורך; קווי iPSC יכולים להשתנות במידה ניכרת ברגישותם לבחירת puromycin. MEFs שימש לבחירה, כי הם מופיעים כדי לתמוך בצמיחת iPSC טובה יותר מאשר כמה מטריצות תאי במהלך בחירת תרופה. ככלל אצבע, מינימום של 5 ימים של puromycin בימים 1 מיקרוגרם / מיליליטר או 7 על 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר יש צורך להשלים את הבחירה. לבסוף, טכניקת קטיף מושבה היא חיונית כדי לשמור על כל המושבות הממוקדות לאחר בחירת תרופה. pipetting העדין או טיפול מגיב ניתוק עוזר לשבור את המושבות לחתיכות מרובות באופן שווהמופץ לתוך הבאר החדשה, ולכן יכול להאיץ את הרחבת מושבה. אם אתם משתמשים במגיבים דיסוציאציה לdisaggregate מושבות הרימו לפני הציפוי, לוודא שהוא מדולל מספיק עם> 10x בינוני לאחר טיפול, משום שמגיב ניתוק השייר יכול להרוג את התאים הועברו אם נותר על הלילה. לא משנה באיזה טכניקה משמש, תרגול המושבה קטיף לפני הניסויים האמיתיים הוא מאוד מעודד.
כאסטרטגיה שתוארה מנצלת שיטת גן-מלכודת לנהוג ביטוי של גן PAC את של אמרגן PPP1R2C אנדוגני, לקטוף באופן משמעותי יותר מ -30 מושבות לא צריכים להוכיח צורך. SA-2A צמוד בחירת PAC תיאורטית מבטלת תאים-אינטגרציה רק אקראיים, אבל אינטגרציה נוספת אקראית (ים) יכולה להתרחש בiPSCs נושאות אינטגרציות ממוקדות מוצלחות. ברוב המקרים, כמעט 100% משיבוטים שנבחרו סמים ממוקדים אינטגרציות ו~ 10-40% מהם יש integrati האקראי נוסףתוספות. רוב השיבוטים ממוקדים נוטה להיות מיקוד חד-אלל, למרות שניסויים בי> 50% מיקוד כפול אלל מתרחש. התדירות המשתנה של אינטגרציות אקראיות נוספות, כמו גם את היחס של יחיד מול מיקוד כפול אלל, קשה לשלוט. לכן, בחירה ~ 20 מושבות מומלץ להבטיח חד או דו-אלל מיקוד יכולים להיות המושגת רק שיבוטים. לאור ניסויי מיקוד מוצלחים, הערכה מחדש של שיעורי transfectability, הישרדות, והצמיחה של תאי המטרה, היעילות של nucleases בשורת התאים הספציפי, ואת איכות הכנות תורם וnuclease מומלצת מאוד לפני מחדש מנסה את הניסוי בשלמותו.
יש לציין כי אסטרטגיות תורם גן-מלכודת דומות יכולות לשמש למיקוד גנים פעילים אחרים, אבל אינה מתאים למיקוד גן שקט שדורש אמרגן עצמאי לנהוג ביטוי גנים לבחירה. כמו כן, בעוד הנמל מבטח הדואר AAVS1 נחשב לבעל מבנה הכרומטין פתוח, זה לא מבטיח שכל transgene יכול לבוא לידי ביטוי בעוצמה במוקד זה. ואכן, הדו"ח האחרון שלנו הראה כי כמה יזמים חלשים היו מסוגלים לנהוג ביטוי גני כתב ניאון לזיהוי לאחר אינטגרציה ממוקדת במוקד AAVS1 14.
פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בTALENs תוקף היטב למקד לוקוס נמל מבטח למד היטב בגנום האנושי. הטכניקות הן מאוד לשחזור והתאמה בקלות ליישומים רבים מעורבים בכל transgene. בהשוואה לשיטות הנדסה גנטית באמצעות שילובים אקראיים, גן תיווך AAVS1-Talen מיקוד הוא יעיל ומאוד ספציפי, ובמקרה של iPSCs, תוצאות בתאים ביציבות ניאון כי יש פוטנציאל להרחבה ולהתמיין לכל סוג תא בגוף. בעוד פרוטוקול זה אינו מתאר את העיצוב ואימות של nucleases מעצב או ההערכה של מושבות iPSC ממוקדות עבור pשילוב קלטת רופר וניתוח מחוץ היעד, כמה פרוטוקולים מצוינים תארו אספקטים של המתודולוגיה אלה בפירוט 16-18. טכניקות התרבות וpassaging iPSC המזין ללא שימוש במדיום E8 גם מתוארות בפירוט בפרסום קודם 19. הפרוטוקול לעיל, תוך אופטימיזציה עבור בנוסף לגן בטוח-נמל AAVS1 של iPSCs אדם, יכול לשמש כתבנית כללית לניסויים הכוללים עריכה / בנוסף גן ספציפי לאתר בתיווך nuclease באמצעות תורם רקומבינציה הומולוגי בכל סוג תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml | Corning | 354230 | Store at -20 °C. |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320-033 | Store at 4 °C. |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | |
| Essential 8 Medium | Life Technologies | A1517001 | Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C. |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C. |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886-500G | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-250 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| DR4 MEF 2M IRR - Academic | GlobalStem | GSC-6204G | Store in liquid Nitrogen. |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | Store at 4 °C. |
| Defined Fetal Bovine Serum, US Origin | HyClone | SH30070.03 | Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4 °C. |
| 4D-Nucleofector Core unit | Lonza | AAF-1001B | part of the electroporation system |
| 4D-Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1001X | part of the electroporation system |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT) | Lonza | V4XP-3024 | Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C. |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A1110501 | Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use. |
| NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 01-0005 | Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C |
| AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1) | Addgene | 52637 and 52638 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor | Addgene | 22212 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O. |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz | Thermo Scientific | 75-004-521 | |
| TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003607 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Hentze, H., Graichen, R., Colman, A. Cell therapy and the safety of embryonic stem cell-derived grafts. Trends Biotechnol. 25 (1), 24-32 (2007).
- Smith, J. R., et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-targeted integration. Stem Cells. 26 (2), 496-504 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Ogata, T., Kozuka, T., Kanda, T. Identification of an insulator in AAVS1, a preferred region for integration of adeno-associated virus DNA. J Virol. 77 (16), 9000-9007 (2003).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
- Urbach, A., Schuldiner, M., Benvenisty, N. Modeling for Lesch-Nyhan disease by gene targeting in human embryonic stem cells. Stem Cells. 22 (4), 635-641 (2004).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nature biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Zou, J., et al. Gene targeting of a disease-related gene in human induced pluripotent stem and embryonic stem cells. Cell stem cell. 5 (1), 97-110 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature. 29 (8), 731-734 (2011).
- Sanjana, N. E., et al. A transcription activator-like effector toolbox for genome engineering. Nature protocols. 7 (1), 171-192 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell stem cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Luo, Y., et al. Stable Enhanced Green Fluorescent Protein Expression After Differentiation and Transplantation of Reporter Human. Induced Pluripotent Stem Cells Generated by AAVS1 Transcription Activator-Like Effector Nucleases. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 821-835 (2014).
- Zou, J., et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells: functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood. 117 (21), 5561-5572 (2011).
- Luo, Y., Rao, M., Zou, J. Generation of GFP Reporter Human Induced Pluripotent Stem Cells Using AAVS1 Safe Harbor Transcription Activator-Like Effector Nuclease. Curr Protoc Stem Cell Biol. 29, 5A.7.1-5A.7.18 (2014).
- Peters, D. T., Cowan, C. A., Musunuru, K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge, MA. Available from: http://www.stembook.org/node/1438 (2008-2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
