Transfektion, Urval och Koloni-plockning av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller Talen riktade med en GFP Gene i AAVS1 Safe Harbor

Introduction

Förmågan att omprogrammera mänskliga somatiska celler in embryonala stamcellsliknande inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) upptäcktes först av Takahashi et al. 2007 ^1. Humana dermala fibroblaster omvandlade med retrovirus som uttrycker fyra transkriptionsfaktorer (Den så dubbad Yamanaka Faktorer Oct3 / 4, Sox2, c-Myc och Klf4) visade sig vara mycket lik mänskliga embryonala stamceller (hESCs) baserat på morfologi, spridning, genuttryck, och epigenetiska status; avgörande, iPSCs är också förmåga att differentiera till celler av alla tre germinallager ^1. Den proliferativa potentialen och differentiering kapacitet iPSCs gör dem väldigt attraktiva verktyg; genom omprogrammering celler från patienter som lider av vissa sjukdomar, kan iPSCs användas både som in vitro sjukdomsmodellsystem och som potentiella terapeutiska medel.

För det senare ändamålet, måste flera frågor lösas innan den fulla potentialen av iPSCsi en klinisk miljö kan förverkligas; den tumörframkallande potential in vitro odlade hESCs och iPSCs, användningen av xenogena derivat under omprogrammering och cell underhåll, och behovet av att spåra transplanterade celler in vivo är alla viktiga hinder för den kliniska tillämpningen av pluripotenta stamceller (Betygsatt av Hentze et på. ^2). En idealisk lösning på behovet av att spåra differentierade celler efter transplantation skulle innebära en visuellt detekterbar markör som motstår tysta och färgskiftning oavsett ansökan. Robust och ihållande uttryck av integrerade transgener är lättast uppnås när exogena DNA införs i safe-harbour loci; det vill säga genomiska platser som möjliggör tillräcklig transkription av en integrerad vektor medan samtidigt mildra störningar av expression i angränsande gener ^3. En sådan plats som har blivit mycket väl karakteriseras sedan dess upptäckt är adenoassocierat virus integration site 1 (AAVS1), i det första intronet av proteinfosfatas en reglerande subenhet 12C (PPP1R12C) genen. Denna locus har visat inte bara att tillåta fortsatt och robust uttryck av integrerade transgener genom förlängt tiden i kultur och in vitro differentiering ^3, men också för att skydda omgivande gener från transkriptions störning ^4; båda funktionerna tros vara på grund av närvaron av endogena kromatin isolatorelement flankerar AAVS1 site ^5.

Framsteg inom genomet ingenjörsverktyg över bara det senaste decenniet har väsentligt underlättat den lätthet och effektivitet med vilken kan uppnås genetiska manipulationer i någon celltyp. Medan tidiga lyckade experiment åberopats ytterst låga nivåer av endogen homolog rekombination (HR) med en introducerad donator för att uppnå riktad genmodifiering i ESC ^6,7, användningen av platsspecifika nukleaser, såsom zinkfinger nukleaser (ZFNs), att signiligt framkalla homolog rekombination genom generering av ett dubbelsträngat DNA break har kraftigt ökat effektiviteten i sådana experiment ^8,9. Den återanvända både transkriptions aktivator liknande effektorer (Tales) av vegetabiliskt patogena Xanthomonas släkten och de prokaryota klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) / Cas9-systemet till effektiva platsspecifika designer nukleaser har gjort riktad genmodifiering i pluripotenta stamceller en tillgänglig och praktiskt metod ^10-13.

En nyligen papper beskrev ett effektivt förfarande för stabil integration av en grön fluorescerande reporterkassetten i AAVS1 safe-harbour lokus i humana iPSCs använder tale nukleaser (Talens) ^14. Dessa riktade iPSCs bibehöll sin fluorescens även efter riktad differentiering till hjärtmuskelceller och transplantation i en musmodell av hjärtinfarkt (MI), vilket ger starka belägg för nyttan av en sådanstabilt fluorescerande pluripotenta stamceller ^14. För att erhålla målinriktade kolonier, var en gen-fälla metod användas, varvid en skarvning-acceptor (SA), placerar 2A själv klyva peptidsekvens puromycin N-acetyl-transferas (PAC) genen under kontroll av den endogena PPP1R12C promotorn; således, endast iPSCs som har inkorporerat DNA donator vid AAVS1 lokuset uttrycker PAC, som följaktligen är selekterbar baserad på puromycin-resistens; (Figur 1, ^15). Detta protokoll detaljer förfarandena för att generera AAVS1-GFP iPSCs redovisas i senaste pappers ^14, inklusive arbetet med transfekterar iPSCs med Talens och en 9,8 kb donator för att integrera ett 4,2 kb DNA-fragment i AAVS1 safe-harbor locus, välja iPSCs baserade på puromycin resistens, och plockar kolonier för klonal expansion. De tekniker som beskrivs häri kan tillämpas på många genomet tekniska experiment.

Protocol

1. Beredning av Basement Membrane Matrix och Beläggning av plasten

1. Placera den frysta basalmembranmatrisen lager från -20 ° C på is och tina över natten vid 4 ° C.
2. Efter upptining, pipett 2 mg portioner av basalmembranet matris i förväg kylda eppendorfrör. Förvara dessa vid -20 ° C tills de behövdes.
3. För att förbereda källaren membranmatrisbelagda plattor, tina en alikvot på is till sista bit av is i Eppendorf-rör försvinner (oftast inom ~ 2 tim).
4. Efter tining tillbasalmembranmatris till 12 ml kall (4 ° C) DMEM / F12 för att göra basalmembranmatris beläggningslösning.
5. Lägg basalmembranet matrislösning till lämplig odlingskärl. För en 6-brunnars platta och dispensera en ml per brunn. Snurra plattan att se basalmembranet matrislösning helt täcker varje brunn.
6. Parafilm försegla basalmembranmatrisen-belagd platta / skål, och inkubera vid room temperatur under en timme före användning. Alternativt, lagra källaren membranmatrisbelagda plattor / rätter på 4 ° C och använd inom 2 veckor beläggning.
   OBS: Lägg extra DMEM / F12 till källaren membranmatrisen belagd plåt / skål för att förhindra uttorkning. Innan du använder 4 ° C lagrades basalmembranet matris belagd plåt / skål, placera den i ett biologiskt säkerhetsskåp och låt den komma till rumstemperatur i minst 30 minuter.
7. Aspirera basalmembranmatris helt innan tillsatsen av medium och celler.

2. Beredning av E8-medium

1. Förbered E8 odlingsmedium genom upptining E8 tillägg över natten vid 4 ° C.
2. Ta 10 ml av E8 bassubstratets från 500 ml lager och kasta.
3. Pipet hela 10 ml flaska med E8 tillägg direkt i 490 ml E8 bassubstratets. Inte varmt komplett E8 medium i ett 37 ° C vattenbad, som upprepade temperatursvängningar kan försämra bFGF i komplette E8-medium.
4. Använd komplett E8-medium inom 2 veckor tillsats av tillägget.

3. Upptining av iPSCs

1. Ta en flaska med frusna iPSCs från flytande kväve och placera på torris.
2. Snabbt tina flaskan i en 37 ° C vattenbad; snurra flaskan i vattenbad tills bara en liten fragment av is kvarlevor.
3. Spraya flaskan med 70% etanol och överföring till ett biologiskt säkerhetsskåp.
4. Tillsätt 1 ml rumstemperatur E8 medel droppvis direkt till flaskan.
5. Med hjälp av en 2 ml pipett cellsuspensionen droppvis i 9 ml E8 medium i en 15 ml koniska rör. Snurra röret ofta för att säkerställa att cellerna och medel blanda väl snabbt.
6. Centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 minuter.
7. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i en lämplig volym av E8 kompletterat med 10 iM Y-27.632.
8. Lägg cellerna till ett lämpligt antal källaren membrane matris brunnarna, och lägg i en 37 ° C, 5% _CO2 inkubator över natten. Det rekommenderas att plattan minst 0,2 x 10 ⁶ iPSC per brunn i en 6-brunnar för att möjliggöra snabb återhämtning efter upptining.

4. Underhåll och rutinPassAging av iPSCs

1. Refresh E8-medium dagligen.
2. Övervaka morfologi och confluency av celler med ett inverterat mikroskop. iPSCs av hög kvalitet växer i platta kolonier med tydliga gränser; enskilda kolonier har en "kullersten liknande" utseende.
3. Passage de iPSCs cellerna när de når ~ 70% sammanflytning.
4. Förbered en EDTA aging-lösning genom att tillsätta 0,9 g NaCl och 500 pl 0,5 M EDTA till 500 ml DPBS. Blanda väl för att lösa upp NaCl, och vakuumfilter för att sterilisera. Värm en alikvot av passagemuffen lösning i en 37 ° C vattenbad före passage.
5. Till passagen, aspirera förbrukat odlingsmediet och tvätta cellerna en gång med en lika stor volym av varma PasSaging lösning. Aspirera och pipett tillräckligt EDTA aging lösning för att belägga cellerna (1 ml per brunn av en 6-brunnsplatta).
6. Placera cellerna under ett inverterat mikroskop och observera IPSC kolonierna. Utseendet på hål inom kolonier och upphöjda gränser bör bli uppenbara inom 2-5 minuter.
7. Aspirera försiktigt EDTA aging lösningen.
8. Med hjälp av en 10 ml pipett, dosera 4 ml E8 medium (om du använder en 6-brunnar) under högt tryck direkt i varje brunn som ska passe.
9. Samla IPSC klumpar, och delas upp i ett lämpligt antal brunnar beroende på delningsfaktorn från 1: 8 till 1:12. Inte över-pipett, som disaggregering av cellklumpar ger dålig lönsamhet.
10. Placera plattan i en inkubator, och rock plattan tillbaka-och-tillbaka och sida-till-sida flera gånger för att dispergera cellerna.

5. Beredning av MEF och iPSCs för Tansfection

1. 48 h före transfection, passage iPSCs på ~ 1: 6 i fyra eller fler brunnar i en basalmembranmatris belagda 6-brunnar, så att de kommer att vara 70% sammanflytande två dagar härefter.
2. Nästa dag, tina DR4 MEF in MEF medium bestående av DMEM (hög glukos) kompletterad med 10% FBS och 1 x MEM-NEAA.
3. Plate DR4 MEF i två 10-cm skålar vid ~ 2 x 10 ⁴ celler / cm ² och inkubera över natten vid 37 ° C.
4. På dagen för transfektion, ändra MEF medium till E8 kompletterat med 10 | iM Y-27632 30 min före utför transfektion på iPSCs.
5. Valfritt: Om flödescytometrisk analys av iPSCs efter transfektion önskas, avlägsna en basalmembranmatrix-belagda plattan från 4 ° C och placera vid rumstemp.
6. Valfritt: 4 h före transfektion, komplettera pre-transfektion iPSC kultur med Y-27632 vid den slutliga koncentrationen av 10 pM.

6. Gentle-cell Dissociation Reagens Treatment and Transfektion av iPSCs användning av en Elektroporation System

1. Ta P3 primära celltransfektion lösning från 4 ° C och låt den komma till rumstemperatur ~ 30 min. Lägg hela 100 ^ il tillägg till transfektion lösningen före användning.
2. Varm mild-cell dissociation reagens i ett 37 ° C vattenbad.
3. Skaffa AAVS1 Talens (pZT-AAVS1-L1 och pZT-AAVS1-R1) och AAVS1-CAG-EGFP donator från -20 ° C.
4. Ta iPSCs från inkubatorn och tvätta en gång med DPBS.
5. Tillsätt 1 ml mild-cells dissociation reagens per brunn och inkubera iPSCs vid 37 ° C under 5 minuter, eller tills mer än 50% av cellerna har dissocierat från odlingskärlet.
6. Pipet cellerna upp och ner ett par gånger med en P1000 pipett att dissociera eventuella återstående celler från odlingskärlet, och att bryta upp IPSC klumpar.
7. Tillsätt 2 ml av E8 medium till varje brunn, och pipett upp och ner flera gånger med hjälp av en 10 ml pipett till Further dela upp cellklumpar i enskilda celler
   OBS: Transfektionseffektivitet avtar betydligt om cellklumpar inte är tillräckligt uppdelad.
8. Samla iPSCs i en 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 100 xg under 3 min.
9. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i en minimal mängd av E8-medium.
10. Räkna celler med en hemocytometer efter applicering av en vital fläck som 0,4% Trypanblått. Se till att cellerna är tillräckligt dissocierade samtidigt räkna (1-3 celler per "klump").
11. Dispensera 3 x 10 ⁶ celler i vardera av två 15 ml koniska rör och spinn ner igen vid 100 xg under 3 min.
    OBS: låghastighetscentrifugering minskar cell stress och gör det lätt att resuspension av iPSCs före elektroporering.
12. Ställ elektroporering systemet till celltypen särskilt program för mänskliga embryonala stamcellslinje H9 (Program CB-150).
13. Efter centrifugering, aspirera supernatanten från cell pellets. Till en pellet, tillsätt 10 | ig av HR donator som kontrollprov. Till den andra pellets lägga 10 mikrogram av HR-givaren, tillsammans med 5 pg av varje Talen (pZT-AAVS1-L1 och pZT-AAVS1-R1) som experimentell prov.
14. Resuspendera varje cell pelleten i 100 ^ P3 primär celltransfektion lösning, och överför till en kyvett.
15. Utför transfektion och omedelbart lägga 500 pl rumstemperatur E8 medium till varje kyvett.
16. Överför transfekterade iPSCs droppvis till en 10-cm skål innehållande DR4 MEF framställda i steg 5.4.
17. Valfritt: Tillsätt flera droppar från varje experiment i en brunn av en basalmembranmatrix-belagda 6-brunnar om flödescytometri anaylsis av transfektionseffektiviteten önskas.
18. Upprepa steg från 6,15 till 6,17 för att avsluta båda proven. Följande dag, tvätta cellerna med DPBS två gånger och byta odlingsmedium till NutriStem, som tycks stödja iPSC kultur på matare bättre än E8.
19. Transient EGFP expressions toppar vid 48-72 h efter transfektion; bedöma transfektionseffektiviteten som önskat.

7. puromycinselektion riktade iPSCs

1. Börja puromycinselektion 72 timmar efter transfektion när iPSCs når 70% konfluens.
2. För NCRM5 iPSCs, börjar puromycinselektion på 0,5 mikrogram / ml puromycin (1/2 full dos) späddes i NutriStem odlingsmedium. Den optimala puromycin koncentrationen kan variera 0,25-1 ug / MLL för vissa IPSC linjer.
3. Kultur iPSCs i NutriStem + 0,5 | ig / ml puromycin under 3 dagar, uppfriskande mediet dagligen.
4. Efter 3 dagar, öka koncentrationen av puromycin till 1 pg / ml.
5. Kultur iPSCs under 1 mikrogram / ml puromycinselektion i ytterligare 7 till 8 dagar, eller tills distinkta kolonier visas tillräckligt stora för koloni plockning.

8. Colony Plockning och expanderande av riktade iPSCs

1. Använd basalmembranetmatris för att belägga en 96-brunnsplatta genom dispense 50 pl av basalmembranmatris beläggningslösning (2 mg basalmembranmatris späddes i 12 ml DMEM / F12) i varje brunn. Förvara plattan vid 4 ° C över natten före användning.
2. Efter att basalmembranmatrisen belagda plattan för att komma till rumstemperatur, aspirera basalmembranmatrisen och dispensera 100 pl E8 kompletterat med 10 | iM Y-27632 i varje brunn.
3. Placera ett inverterat mikroskop i ett biologiskt säkerhetsskåp, och spraya lätt med 70% EtOH för att sterilisera.
4. Dra en glas pasteurpipett över en bunsenbrännare för att erhålla en idealisk koloniplockning verktyg som har en liten "krok" i spetsen. Sterilisera med 70% EtOH, och placera i huvan för att torka.
5. Ta skålen innehåller riktade IPSC kolonier från inkubatorn, och placera in i huven under mikroskop.
6. Plocka iPSCs genom att spåra en cirkel runt kolonin gränsen mot koloniplockverktyg.
7. Använd "krok" av koloni dyrkverktyg att försiktigt skrapa och avlägsna iPSC koloni från ytan på plattan. För större kolonier, teckning ett X med koloni plocka verktyg för kvartal kolonin kommer att underlätta celltillväxt efter åter plätering.
8. När cellklumpar är fristående och fritt flytande, använd en p200 pipett inställd på ~ 30 ^ att samla iPSCs. Plate celler direkt in i 96-brunnar.
9. Tillval: använd en p20 pipett inställd på ~ 5 ul att samla iPSCs in i ett Eppendorf-rör, lägg sedan till 50 l mild-cells dissociation reagens att smälta under 5 minuter vid 37 ° C. Efter digerering, tillsätt 500 | il E8 medium i eppendorfrör för att späda den milda-cell dissociation reagens och spinn ner cellerna vid 200 xg i en standard bordsmikrocentrifug under 5 minuter. Sedan aspirera mesta av mediet och lämna ~ 30 ^ att resuspendera och överföra cellerna i 96-brunnar.
   OBS: Dettatillvägagångssätt underlättar dissociationen av cellklumpen och snabb expansion av plockas koloni.
10. Fortsätt koloni plockning tills ett tillräckligt antal IPSC kolonier har samlats (ungefär 20-30 kolonier per försök rekommenderas).
11. Efter koloni plockning, placera 96-brunnar i en inkubator över natten. Uppdatera med fullständig E8 mediet följande dag, och kultur tills ~ 70% sammanflytande.
12. Passage celler från 96 brunnar i en 24-väl, sedan in i en 6-väl, som beskrivs i steg från 4,5 till 4,10.
    OBS: volymerna av EDTA-lösning och E8-medium bör proportionellt reduceras vid användande brunnar mindre än en 6-brunnsplatta.
13. Utvärdera inriktning framgång genom korsningen PCR och Southern blot-analys för att bekräfta riktad kassett integration och frånvaro av slumpmässigt införda vektorer ^16.

Representative Results

En visualisering av protokollet ges i figur 2, med perioder under vilka iPSCs odlas i annat medium markeras antingen grönt för E8 eller blå för NutriStem. Det är viktigt att transfektera endast högkvalitativa iPSCs; undersöka kultur rätter hela rutinunderhåll och kontrollera att IPSC kulturer innehåller huvudsakligen distinkta kolonier som bär en gatsten liknande morfologi (Figur 3A); differentierade celler bör inte uppta mer än 10% av kulturen. Transfectability av iPSCs bedöms och optimerad användning av den lilla pMax-GFP vektor (Figur 4A-B), som transfektion med pMax-GFP representerar typiskt maximala verkningsgrad på grund av sin ringa storlek. Till exempel, vi uppnådde 68,6% transfektionseffektivitet med pMax-GFP (Figur 4B). Att rikta AAVS1 safe-harbour är iPSCs passe använder en mild encelliga dissociation reagens och transfekteras med AAVS1-Talens och AAVS1-CAG-EGFP (plasmider som avbildas i Figur 1A). Transfekterade iPSCs stryks sedan på en lämplig täthet av DR4 MEFs (figur 3B). Transient expression av AAVS1-CAG-EGFP toppar vid 48 till 72 timmar efter transfektion (fig 3C); om så önskas, en liten del av transfekterade iPSCs kan FACS analyseras. NCRM5 iPSCs kan transfekteras med effektiviteten av 60,9% med användning AAVS1-CAG-EGFP donator (Figur 4C). Transfektionseffektivitet kan variera kraftigt; för experiment där GFP + fraktionen är ännu så låg som 10%, fortsätter att puromycinselektion. Efter att ha utfört puromycinselektion bör enskilda kloner visar jämn fluorescens vara tillräckligt stor för koloni plockning (Figur 3D). Att plocka kloner, är en lämplig koloni placerad under låg förstoring (Figur 3E) och isoleras genom första spårning och kvarte det (figur 3F-G). De inkvarterade kolonierna sedan försiktigt skrapad från odlingskärlet (figur 3H). Med hjälp av en p200 pipett, är cellklumpar överfördes sedan till en brunn av en basalmembranmatrix-belagda 96-brunnsplatta. iPSCs bör fästa inom 2-4 timmar bordläggningen (Figur 3I). Om kvarstad inte observeras inom 24 timmar, basalmembran matris-beläggning eller Y-27.632 behandlingen sannolikt suboptimala; Basalmembranet matrix-belägga en ny 96-brunnar och förbereda färska E8 + 10 iM Y-27.632 innan plocka några fler kolonier. En gång i en 96-brunnsformat, riktade IPSC kloner expanderas och bör uppvisa stabilt och enhetligt uttryck av GFP (fig 4D-E).

Figur 1: Gene inriktning vektorer och inriktning schema. (A) representationer AAVS1-CAG-EGFP och pZT-AAVS1-L1 / R1 Talens plasmider som används i denna studie. Den SA-2A element i AAVS1-CAG-EGFP-plasmiden representerar skarven-acceptorn och 2A själv klyva peptiden användas för att begränsa puromycin N-acetyl-transferas (PAC) genuttryck till händelser riktade-integration. Den kyckling β-aktin globin (CAG) promotor används för att driva uttryck av EGFP. (B) Den AAVS1 safe-harbour, som ingår i Intron 1 av PPP1R12C genen, är riktad användning av Talens att generera en dubbelsträngat DNA paus. Detta aktiverar homolog rekombination (HR) reparation maskiner, som sedan använder AAVS1-CAG-EGFP donator (lagerhomologiarmar flankerar snittet webbplatsen) som ett substrat för reparation. Kassetten är integrerad och PAC-genen är placerad under kontroll av den endogena PPP1R12C promotorn.

Figur 2. Timeline av riktad genmodifiering experiment. IPSCs odlastill 70% konfluens och passe ~ 1: 6 på dag -2 (d-2). MEF är pläterade på d-1, och iPSCs samlas och transfekteras vid d0. Vid d1 är media bytte till NutriStem och iPSCs odlas för ytterligare två dagar innan puromycin sätts till mediet vid d3. Kolonier är vanligtvis redo för plockning av d12. Perioder under vilka iPSCs odlas i E8 medium grönmarkerad, medan perioder av NutriStem kultur är i blått.

Figur 3: iPSC genmålinriktning representativa bilder (A) Fas bild av hög kvalitet iPSCs.. Notera fas-ljusa gränsen och kullersten liknande morfologi. (B) DR4 MEF pläterade på 2 x 10 ⁴ celler / cm ² tjugofyra timmar efter upptining. (C) sjuttiotvå timmar efter transfektion, EGFP + celler är tydligt när den visas med en fluorescens MICRoscope. (D) Efter puromycin baserade val för ~ 14 dagar, kolonier visar enhetlig GFP fluorescens är stora nog att plockas. (EH) Representativa bilder av kolonin plockprocessen. Kolonier plockas med hjälp av en drog pasteurpipett, först genom att skissera kolonin, och sedan genom kvarte den för att erhålla mindre cellklumpar. (I) plockas IPSC kolonier fäster vid basalmembranmatrisen-belagda ytan av 96-brunnsplattan inom 2 till 4 tim. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: FACS-analys av transfektionseffektiviteten och klonala riktade iPSCs. (A) Kontroll NCRM5 iPSCs utan transfektion av någon plasmid. (B) NCRM5iPSCs transfekterade med den lilla testvektorn pMax-GFP är FACS analyse för GFP uttryck. (C) Transient uttryck av AAVS1-CAG-EGFP plasmid bedöms av FACS. (D) En NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP klon skärmar enhetligt positiva EGFP uttryck som analyseras med FACS. Notera den snäva klustring analyserade iPSCs jämfört med C). (E) Fluorescens bild av en utökad NCRM5-AAVS1-CAG-EGFP riktad klon.

Discussion

De mest kritiska stegen för en framgångsrik generation AAVS1 safe-harbour riktade mänskliga iPSCs är: (1) effektivt leverera Talen och givar plasmider i iPSCs genom transfektion; (2) optimera dissociation av iPSCs i enskilda celler före transfektion och plätering tätheten efter transfektion; (3) optimera dos och tid för drog urval baserat på tillväxten av iPSC linje; (4) försiktigt dissekera och plocka riktade kolonier och överföra till ny platta / brunn. Jämfört med liknande metoder som används i Hockemeyer papper ^10, använde detta protokoll ett par open-source AAVS1-Talens, olika iPSC dissociation reagens, och annorlunda transfektion enhet för att leverera Talens och donator vektorer, vilket bidragit till att minska antalet iPSCs används i experiment och samtidigt uppnå hög transfektion och inriktning effektivitet.

För att uppnå högeffektiv gen redigering i mänskliga iPSCs, är det viktigt att först optimera leveransen av genen ediTing reagenser (DNA / RNA), samtidigt balansera den akuta celldöd leveransmetod och reagenser låta iPSCs. Målet är att maximera leveranseffektiviteten samtidigt upprätthålla en tämligen låg nivå av celldöd. Eftersom det är väldigt lätt att tillaga stora mängder AAVS1-talen plasmider som kan uppnå> 50% HR effektivitet med hjälp av narkotika urval i mänskliga iPSCs, är det inte nödvändigt att göra mRNA från Talen plasmider. Utmaningen för leverans kommer från stora donator plasmider, som i detta fall är ~ 10 kb. Det rekommenderas att använda AAVS1-CAG-EGFP donator att testa leveranseffektiviteten i specifika humana IPSC linjer snarare än att använda pMaxGFP ingår i transfektion kit, eftersom pMaxGFP är en ~ 3,5 kb liten plasmid och mycket lätt att leverera in i några celler. AAVS1-CAG-EGFP donator kan ändras med hjälp av restriktionsenzymer som visas i figur 1A att rikta olika transgener i AAVS1 locus. En annan 12 kb donator, som innehåller en 6,4 kb kassett att byta ut CAG-EGFP, har varasv framgångsrikt använts för att åstadkomma likartad transfektion och inriktning effektivitet (data ej visade). I allmänhet humana iPSCs är bland de celltyper som är svåra att transfektera och effektiviteten för stora plasmider kan vara så låg som 5-10% uppmätt genom flödescytometrianalys av GFP + celler. Ytterligare optimering av transfektionseffektiviteten är beroende av korrekt dissociation av mänskliga iPSCs i enskilda celler, eftersom cellklumpar kommer att minska risken för att leverera genen redigering reagenser in i varje cell. Detta protokoll använder en mild och snabbt arbetande cell dissociation reagens, men behandla iPSCs i mer än 10 minuter rekommenderas inte. Vanligtvis IPSC kulturen är mindre än 80% sammanflytande, om följande steg 5.1, vilket gör en 5 minuters inkubation med förvärmda skonsam-cells dissociation reagens normalt tillräcklig för att dissociera de iPSCs i enskilda celler med försiktig pipettering. Om inte alla cellerna kan dissocieras till enstaka celler efter 10 min av behandling eftersom cellkultur är över-conflytande eller kolonierna blivit mycket kompakt, helt enkelt samla det rekommenderade antalet enstaka celler från flera brunnar / plattor och lämna tätt bifogade cellerna bakom. Tung pipettering rekommenderas inte eftersom mekanisk skjuvning är mer skadligt för cellerna än enzymatisk dissociation. När du arbetar med tidig-passage iPSCs (före passagen # 15), är skonsam dissociation praktiken mycket viktigt för cellöverlevnad eftersom cellerna är redan mer känsliga för transfektion stress än sena passage iPSCs. Om det är svårt att uppnå hög effektivitet i både transfektion och cellöverlevnad, välj den praxis som ger högsta transfektionseffektivitet. Efter transfektion, bör cellerna pläteras vid en densitet som kommer att nå 50-80% konfluens vid dag 3 då läkemedelsinducerad val startar. Eftersom varje iPSC linje växer annorlunda, kanske post-transfektion plätering densitet måste optimeras för varje cellinje. En hög plätering täthet kan leda till över confluency som minskar effekten av drug-valet, medan en extrem låg plätering densitet kan orsaka fördröjd återhämtning och tillväxt av läkemedelsresistenta kolonier. Vanligtvis 3 miljoner startande iPSCs är tillräckligt för att vara klädd i ½ till 2 10 cm rätter beroende på överlevnad och tillväxt av specifika iPSCs. Likaså om du använder en nyligen genererade eller som ännu oprövad iPSC linje, genererar en puromycin kill kurva för att fastställa lägsta effektiva dos i otransfekterade celler kan behövas; IPSC linjer kan variera avsevärt i deras känslighet för puromycinselektion. De MEF användes för urvalet eftersom de verkar för att stödja iPSC tillväxten bättre än vissa extracellulära matriser under urvals drogen. Som en tumregel, minst fem dagar av puromycin vid 1 mikrogram / ml eller 7 dagar vid 0,5 mikrogram / ml krävs för att fullborda valet. Slutligen är koloni plocka teknik avgörande för att bevara alla de riktade kolonierna efter valet drogen. Gentle pipettering eller dissociation reagensbehandling hjälper till att bryta kolonierna i flera delar jämntfördelas i den nya brunnen, och därför kan påskynda koloni expansion. Om du använder en dissociation reagens för att dela upp de plockade kolonierna före plätering, se till att det är tillräckligt utspädd med> 10x mediet efter behandling, eftersom rest dissociation reagens kunde döda de överförda cellerna om de lämnas på över natten. Oavsett vilken teknik används, öva koloni plocka innan de verkliga experiment är mycket uppmuntras.

Eftersom den beskrivna strategin utnyttjar en gen-fälla metod för att driva uttryck av PAC-genen bort av endogena PPP1R2C promotorn, plocka betydligt mer än 30 kolonier inte skulle visa sig nödvändigt. SA-2A kopplade PAC val teoretiskt eliminerar slumpintegrations endast celler, men ytterligare slumpmässig integration (s) kan förekomma hos iPSCs bär framgångsrika riktade integrationer. I de flesta fall har nästan 100% av läkemedels utvalda kloner riktade integrationer och ~ 10-40% av dem har ytterligare slump Integrations. Majoriteten av riktade kloner tenderar att ha en enda allel inriktning, även om experiment där> 50% dubbel allelen inriktning inträffar. Den variabla frekvensen för ytterligare slumpmässiga integrationer, såväl som förhållandet mellan enkel- kontra dubbel-allelen inriktning, är svår att kontrollera. Därför plocka ~ 20 kolonier rekommenderas för att säkerställa enkel- eller dubbel-allel targeting-endast kloner kan erhållas. I ljuset av misslyckade inriktningsexperiment, omprövning av målet cellernas transfectability, överlevnad, och tillväxttakten har effekt av nukleaser i specifika cellinje, och kvaliteten på givar- och nukleas förberedelser rekommenderas innan du försöker experimentet i sin helhet.

Det bör noteras att liknande gen-fällan donator strategier kan användas för att rikta andra aktiva gener, men är inte lämplig för tyst genmålinriktning som kräver en oberoende promotor för att driva selekterbar genexpression. Också, medan the AAVS1 safe harbor anses ha öppet kromatinstruktur detta inte garantera att varje transgen kan uttryckas starkt på detta lokus. Faktum vår senaste rapport visade att flera svaga tagare inte kunde köra detekterbar fluorescerande reporter genuttryck efter riktad integration på AAVS1 locus ^14.

Detta protokoll är inriktat på att använda väl validerade Talens att rikta en väl studerade trygg hamn locus i det mänskliga genomet. Teknikerna är mycket reproducerbar och lätt att anpassa till många tillämpningar som involverar någon transgen. Jämfört med genom tekniska metoder med slumpmässiga integrationer är AAVS1-talen medierad genmålinriktning mycket effektiv och specifik, och i fallet med iPSCs, resulterar i stabilt fluorescerande celler som har potential att expandera och differentiera till någon mänsklig celltyp. Även om detta protokoll inte beskriver design och validering av designer nukleaser eller bedömning av riktade IPSC kolonier för proper kassett integration och off-target analys, har flera utmärkta protokoll beskrivs dessa aspekter av metodiken i detalj ^16-18. Matarfria IPSC kultur och aging tekniker använder E8-medium beskrivs också i detalj i tidigare offentliggörande ^19. Ovanstående protokoll, medan optimerad för gen tillägg till AAVS1 safe-harbour av mänskliga iPSCs, kan fungera som en generell mall för experiment med platsspecifik nukleas-medierad gen redigering / tillägg med hjälp av en homolog rekombination donator i någon celltyp.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-Free, 10 ml	Corning	354230	Store at -20 °C.
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	Store at 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3506
Essential 8 Medium	Life Technologies	A1517001	Store basal medium at 4 °C. Store supplement at -20 °C.
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Store at room temp. Once dissolved in H2O, store at -20 °C.
Sodium Chloride	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
DPBS, no calcium, no magnesium	Life Technologies	14190-250
100 mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Academic	GlobalStem	GSC-6204G	Store in liquid Nitrogen.
DMEM, high glucose, pyruvate	Life Technologies	11995-040	Store at 4 °C.
Defined Fetal Bovine Serum, US Origin	HyClone	SH30070.03	Store at -20 °C. Thaw at 4 °C overnight and aliquot. Store aliquots at -20 °C until needed.
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C.
4D-Nucleofector Core unit	Lonza	AAF-1001B	part of the electroporation system
4D-Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1001X	part of the electroporation system
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)	Lonza	V4XP-3024	Upon arrival, remove Primary Cell Solution and supplement and store at 4 °C.
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4°C and warm an aliquot in a 37 °C water bath before use.
NutriStem XF/FF Culture Medium	Stemgent	01-0005	Store at -20 °C. Thaw overnight at 4 °C
AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 and pZT-AAVS1-R1)	Addgene	52637 and 52638

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAVS1-CAG-EGFP Homologous Recombination donor	Addgene	22212
Puromycin Dihydrochloride	Life Technologies	A11138-03	Store at -20 °C. Prepare working aliquots of 1 mg/ml in ddH2O.
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Refrigerated), 120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Swinging Bucket Rotor	Thermo Scientific	75003607
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061