Introduction
העור הוא האיבר הגדול ביותר בגוף. זה יוצר חיץ בין הסביבה החיצונית והאיברים הפנימיים. יתר על כן, העור מגן על הגוף מפני אובדן נוזלים, השפעות סביבתיות, פציעות ודלקות ומסייע בויסות טמפרטורת גוף 1. בשל מיקומו החשוף, העור מושפע לעתים קרובות על ידי טראומה מכאנית, תרמית או כימית. למרות העור הוא בדרך כלל מסוגל תיקון עצמי, גורמים רבים מקומיים כגון זיהום, חמצון, והסתפקות ורידים יכולים להוביל לריפוי פצעים לקוי. ריפוי פצע יכול להיות גם הפריע ידי גורמים מערכתיים כמו השמנת יתר, אלכוהוליזם, עישון, תרופות, תזונה ומחלות כמו סוכרת. 2
התהליך של ריפוי פצע יכול להיות מחולק לשלבים 3: (i) השלב הדלקתי, (ii) השגשוג ו( iii) שלב שיפוץ. על פגיעה בעור, אות-מפל מורכב מתחיל, שהוביל לסגירת הפצע. 3לאחר פציעה, הפצע מדמם וקריש דם נוצר. Fibroblasts לעבור לקריש הדם ולהחליף אותו עם רקמה חדשה ששופצה לאחר מכן במשך שנים.
ההבנה הנוכחית של תיקון עורית תהליכים ביולוגיים הבסיסי היא מוגבלת. מודלים של בעלי חיים וחזיר קטנים ששמשו ללמוד ריפוי פצע. עם זאת, תוצאות אלה לא יכולים להיות מועברות ישירות לבני אדם בשל הבדלי מינים ספציפיים. בנוסף לדגמים אלה in vivo, כמה היבטים של ריפוי פצע ניתן ללמוד על ידי הדמיה של מצב פצע באמצעות גירוד של תרבויות monolayer במבחנה המבוסס על שורות תאים הונצחו או תאים ראשוניים. 4 דגמים מגרדים אלה טופל מאוד אבל לא מספיק משקפים את פיזיולוגיה מורכבת in vivo. 5 מלבד דגמים דו-ממדיים, שווה עור אנושי תלת ממדים פותחו עבור מחקר דרמטולוגיים. חלק עורי של מודלים אלה הם generated באמצעות פיגומים שונים, כולל הדרמיס decellularized, 6 הידרוג קולגן, 7,8 glycosaminoglycans 9 או חומרים סינטטיים. 10 העסקת שווה עור אלה, התפקיד של אינטראקציות אפיתל-mesenchymal 11, epithelialization מחדש, crosstalk הסלולרי בין fibroblasts וקרטינוציטים ו השפעה של גורמי גדילה שונים ניתן ללמוד. יתר על כן, מודלים אלה הם שימושיים כדי לצבור ידע חדש על איך fibroblasts להעביר לאזור הפצוע ואיך chemotactic גורמים משפיעים התחדשות רקמות. 12
לא רק הדור של מודל ריפוי הפצע עצמו הוא מאתגר, אלא גם להקים פצע סטנדרטי מאוד במודל הוא בעייתי. טכניקות נפוצות ליצירת פצעי בדיקות מאפס, 13 כוויות, שחיקה קלטת 14, 15 פגיעת תרמית, 16 שלפוחיות יניקה, חנקן נוזלי 17, 18 לייזרים, 19 18 meshers 6 ואגרופי ביופסיה. 20 רוב השיטות אלה יש את אותו חסרונות. פציעות מיושמות באופן ידני קשות כדי לתקנן ולהתרבות בין בדיקות מרובות. גודל, צורה ועומק של הפצע משתנים בין מחקרים ובכך לפגוע באיכות של נתוני מחקר. השימוש בליזר לפציעת עור מוגדר יכול להיות סטנדרטי בקלות יחסית, אך מוביל למצב מחקה פצעי כוויות. חום מיושם על ידי לייזר יכול לגרום denaturation החלבון, צבירת טסיות דם או כלי התכווצות, מה שעלול להוביל לרקמות נמקית.
בגישה חלופית, שפיתחנו מכשיר אוטומטי פציעה (AWD), אשר מאפשר לנו ליצור פצעי cutaneous מוגדרים ומדויקים בתנאים סטריליים. פרמטרים פצעו, כמו עומק ומהירות של חדירה, כמו גם מהפכות של ראש המקדח יכולים להיות מוסדרים. במחקר זה, אנחנו בשילוב עם AWD שווה עור בעובי מלא בבית פיתח (ftSE) שניתן להשוואה לפרוטוקול שפורסם על ידי et al Gangatirkar. 8 שכבת הדרמיס של העור שווה הערך מורכב מfibroblasts האנושי עורי (HDF), ששובצו בקולגן אני הידרוג'ל. בשכבת הדרמיס, קרטינוציטים אדם אפידרמיס (HEK) הם זורעים. בתוך שבועיים בממשק האוויר הנוזלי HEK לבנות את האפידרמיס מורכב מכמה שכבות תאים חיוניות ושכבה קרנית. חוץ מזה הדור של מודל זה, מחקר זה מציג את השימוש של AWD כדי ליצור פצעים מוגדרים ומדויקים בFTSE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול מיועד לייצור של 24 שווי עור בעובי מלא. אדם fibroblasts עורי וקרטינוציטים אפידרמיס בודדו מביופסיות עור על פי פרוטוקול שפורסם בעבר. 21,22 הסכמה מדעת הושגה מראש והמחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של המוסד במחקר אנושי של יוליוס-מקסימיליאן-האוניברסיטה וורצבורג (182 להצביע / 10).
1. הפקה של Dermal רכיב
- לפזר קולגן עם 0.1% חומצה אצטית לריכוז סופי של 6 מ"ג / מיליליטר. לפתרון נטרול ג'ל, לערבב 232.5 מיליליטר 2x DMEM, 7.5 מיליליטר סרום עגל עוברי, 7.5 מיליליטר 3 M HEPES, 2.5 מיליליטר כונדרואיטין סולפט (5 מ"ג / מיליליטר). שמור על פתרון ג'ל נטרול ופתרון קולגן על קרח. לחשב 500 μl של ג'ל למקבילה להוסיף / עור.
הערה: כפתרון נטרול ג'ל יהיה מעורב עם שני חלקים של prepa פתרון קולגןמחדש כמות כפולה של קולגן. - מניחים 24 מוסיף לצלחת גם 24.
- Resuspend fibroblasts עורי האנושי (HDF) ב 10 מיליליטר DMEM, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 270 XG ולספור את התאים. לחלץ את הסכום הדרוש של HDF (5 x 10 4 תאים לכל 500 ג'ל קולגן μl) ו צנטריפוגות התאים למשך 5 דקות ב 270 x g.
- הסר את supernatant וזהירות resuspend HDF ב 4 מיליליטר מקורר פתרון נטרול ג'ל מבלי לייצר בועות אוויר. משלב זה לוודא לעבוד מהר ככל האפשר, כדי למנוע הַקשָׁאָה המוקדמת של ג'ל קולגן.
- Resuspend הפתרון עם 8 מיליליטר של תמיסת קולגן.
- קח קולגן תאים-התערובת עם פיפטה ורבה שלבים-למלא במהירות 500 μl של תערובת בכל הוספה. דגירה ג 'לים 20 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2) להתממש ג'לי.
- להטביע את ג'לי 2 מיליליטר הנשר בינוני השתנה Dulbecco 10% בסרום (DMEM) + עגל עוברי (FCS) בכל טובדגירה זה למשך 24 שעות באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
2. תוספת של אדם עוריות קרטינוציטים (HEK)
- הסר בינוני לאחר 24 שעות. לפזר חלבון אנושי פיברונקטין עם מים ultrapure לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מיליליטר. כיסוי כל עורי שווה ערך עם 25 μl של פתרון פיברונקטין. דגירה ג'לי למשך 30 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2).
- בינתיים, resuspend HEK ב 10 מיליליטר קג"מ-2 ולהגדיר ריכוז תא 1 x 10 6 תאים / מיליליטר עם קג"מ-2 FCS% מוכנים 5 +. הזרעים 1 x 10 5 HEK על כל ג'ל. דגירה ג 'לים 45 דקות בחממה (37 ° C, 5% CO 2) כדי לאפשר לתאים לדבוק.
- Submerse ג'לי עם קג"מ-2 FCS מוכן + 5% ותרבותם בחממה (37 ° C, 5% CO 2).
3. תרבות השווה עור בעובי מלא (FTSE)
- FTSE תרבות ל6-7 ימיםיורד FCS-ריכוז (5%, 2%, ו 0% FCS). לשנות את המדיום כל 2-3 ימים עם הריכוז נמוך יותר FCS הבא. לשם כך, להסיר לחלוטין את בינונית ומוסיף 1.6 מיליליטר של מדיום חדש.
- ביום 7, להסיר בינוני לחלוטין.
הערה: אל תיגעי במשטח FTSE עם קצה פיפטה תוך כדי כך. - מניחים כל להכניס לתוך היטב 1 של צלחת 6 היטב עם מלקחיים סטרילית. להוסיף 1.5 מיליליטר בינוני רכבת אווירית לכל טוב, להבטיח שלא להרטיב את משטח FTSE. שנה בינונית כל 2-3 ימים למשך 14 יום נוסף.
הערה: רמת המילוי של המדיום היא עד המניסקוס של FTSE.
4. ניתוח היסטולוגית
- תיקון ופרפין-הטבעה של FTSE
- הסר בינוני תרבות, להעביר מוסיף ב 24 צלחות גם טריות ולתקן רקמות על ידי הוספת 1.6 מיליליטר של 4% paraformaldehyde לכל היטב דגירה הרקמות לשעה 2 ב RT. זהירות! Paraformaldehyd הוא רעיל, לתפעל מתחת למכסת מנוע קטר. העברהFTSE לקלטת הטבעת רקמות. הסר מקבע הנותר על ידי שטיפה במים ומייבשים את הרקמות באמצעות ריכוזי אתנול עולה.
- מחלקים את המקבילה העור על ידי חתך אנכי באמצע. מניחים שתי חתיכות בתבנית מתכת מלאות פרפין עם משטחי חיתוך כלפי מטה. הוסף את קלטת הרקמה על גבי העובש כגיבוי.
- לחתוך 3-5 פרוסות מיקרומטר ולצוף על אמבט מים C ° 40 להִצטָרְרוּת, הר שקופיות על גבי שקופיות מיקרוסקופ מתאימות. פרוסות יבשים ביסודיות.
- צביעת Hematoxylin וEosin (H & E) וimmunohistochemical (IHC)
- מקום מחליק לתוך מדף דגירה עבור שעה 1 ב 60 ° C. ודא שפרפין הוא נמס. כתם rehydrated פרוסות עם H & E כמכתים סקירה סטנדרטית.
- לצביעת H & E להכין cuvettes צביעת זכוכית 4x עם xylol, 3x עם אתנול 96%, 2x עם אתנול 70%, 1x עם 50% אתנול, 4x מים ללא יונים, hematoxylin 1x, 1x HCl-ethanol (13.7 מיליליטר 1 M HCl מודעה 200 מיליליטר 50% אתנול), 1x מים כרטיסייה, 1x eosin (eosin 1 גרם ל -100 מיליליטר מים deionized) ו2x 2-propanol.
- מקום שקופיות 10 דקות בי xylol ו -10 דקות בxylol השנייה לdeparaffinize ורעננותם שקופיות. טובלים שקופיות 3x באתנול 96% אני, 3x באתנול 96% השני, 3x באתנול 70% ו3x באתנול 50%. סובב שקופיות במים ללא יונים. כדי לבדל את צבע hematoxylin, 2x לטבול בHCl-אתנול. יש לשטוף במים ללא יונים. כלְּחִילָה, מקום מחליק 5 דקות במי כרטיסייה. עבור מכתים eosin, מקום שקופיות 1 דקות בeosin ולשטוף לאחר מכן במים ללא יונים. להתייבשות, מגלשות לטבול 2x באתנול 70%, 2x ב 96% אתנול ולמקם אותם במשך 5 דקות באני 2-propanol, במשך 5 דקות ב2-propanol השני, 5 דקות בxylol אני ו5 דקות בxylol השנייה. לאחר צביעת H & E, גרעיני תאים הם מוכתמים בכחול, ציטופלסמה ומטריצה תאית מוכתמים באדום.
- לאחזור אנטיגן, להסיר פרפין עם קסילן ורעננותם פרוסות לצביעה. פרוסות מקוםבסיר אדים ומבשלים פרוסות deparaffinized וrehydrated במשך 20 דקות במחוממים מראש 10 מ"מ חיץ ציטרט (pH 6).
- מגלשות מקום בחיץ כביסה (חיץ + Polysorbat 0.5% PBS 20) ופרוסות המעגל עם עט נוזל דוחה שקופית סמן או עט יהלומים.
- הנח שקופיות בתא לחות. לחסום peroxidase אנדוגני, על ידי הוספת 3% מי חמצן פתרון 100 μl על כל פרוסה. זהירות! מאוד מסוכן במקרה של מגע עם עור ועיניים. ידית עם ציוד מגן אישי. לשטוף שקופיות בכביסת חיץ.
- החל נוגדן ראשוני דגירה במשך השעה 1 בRT. לשטוף שקופיות שלוש פעמים עם חיץ כביסה. מכאן והלאה, יש לשמור דגימות בחושך.
- השתמש במערכת איתור יוטין-streptavidin לצורך זיהוי של אנטיגן-נוגדן ספציפי מחייב.
- Counterstain גרעינים עם Hematoxylin דקות 1. מייבשים והר שקופיות.
- דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
- הכן את AWD על ידי חיטוי אזור העבודה עם אתנול 70% ואור אולטרה סגול. ודא שראש הקידוח בגודל הרצוי (למשל, 1 מ"מ) מצורף.
- הנח שווי עור לאזורים מיועדים של מדגם צלחת מוביל autoclaved באמצעות מלקחיים סטרילית. מניחים את מדגם צלחת ספק לשקע מתחת לראש הקידוח.
- השתמש בתוכנת הבקרה כדי להגדיר פרמטרים פצעו כדלקמן: מהירות ספין: 15,000 סל"ד; חדירה: 1.5 מ"מ; הנעה: 100 הרץ. פרמטרים אלו צריכים להיות מוגדרים לכל סוג מדגם בנפרד. העברה פצעה פרמטרים לAWD.
- התחל פצע הליך. הסר מדגם צלחת מוביל מהשקע. העברת פצועים FTSE בחזרה למוסיף משמש לתרבות באמצעות מלקחיים סטרילית.
- להמשיך עם התרבות של FTSE נפצע בחממה (37 ° C, 5% CO 2) לחקירה של התחדשות. אלternatively, להשתמש במודלים לניתוח היסטולוגית בכל עת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HDF המבודד וHEK שונה הן במורפולוגיה ובביטוי של סמנים אופייניים. HDF הראה מורפולוגיה ציר בצורה אופיינית, ואילו מורפולוגיה של HEK יכולה להיות מתוארת על ידי מורפולוגיה מרוצפת. התאים התאפיינו במכתים immunohistochemical (איור 1) לפני השימוש בהם לFTSE. HDF הם חיובי עבור vimentin (איור 1 א), סמן לfibroblasts. העיקרי HEK להביע מאוד cytokeratin-14 מוקדם חלבון בידול (איור 1), אך כמעט לא חלבון בידול keratinocyte מאוחר cytokeratin-10 (איור 1 ג).
בעקבות התרבות העיקרית, אנחנו מנותקים מתאי צלוחיות תרבית תאים והשתמשנו בהם לייצור FTSE. FTSE היה בתרבית למשך 7 ימים תחת תנאי submers בינוניים (איור 2 א) ואחריו תרבות 14 ימים בממשק האוויר הנוזלי (איור 2). במהלך תהליך זה, וחוזה TSE באופן משמעותי. בתוך 21 ימים HEK הם מתרבים (איור 2 ג-E). על ידי שינוי ברמה בינונית באופן כזה שעל פני השטח של הדגמים חשופים לאוויר ועל ידי ריכוז סידן גובר, HEK מומרץ להתמיין לאפידרמיס רב-תאי שמורכב מכמה שכבות תאים חיוניות של קרטינוציטים במדינות בידול שונים ושכבה קרנית (איור 2E).
השוואת צביעת Haematoxylin & Eosin של FTSE (איור 2E) עם עור אנושי ילידים (איור 2F) הוא הופך להיות ברור שאדריכלות היסטולוגית מחקה FTSE של העור. זה יכול להיות ביטוי נוסף בstainings immunohistochemical (איור 3). HDF בי הידרוג'ל קולגן יכול להיות מוכתם עם נוגדנים עיקריים נגד vimentin (איור 3 א, ה). קרטינוציטים יוצרים שכבת אפידרמיס המורכבת מcytokeratin-14 כיוון חיוביתאי דואר (איור 3 ב, ו) וסמן הבידול מאוחר cytokeratin-10 באו לידי ביטוי בשכבות על-בסיס (איור 3 ג, ז). יתר על כן, השכבה הקרנית הוא חיובי לפילגרין (איור 3D, H).
בעקבות תקופת תרבות 21 יום, AWD היה לשמש ליצירת פצעי cutaneous בFTSE. כפי שניתן לראות באיור 4 א, AWD בנוי כקופסה-מערכת סגורה, כדי להבטיח תנאים סטריליים. באיור 4, ציור סכמטי של תהליך הפציעה בא לידי הביטוי. FTSE קבוע על צלחת ספק מדגם. התהליך כולו הפציעה, לרבות קביעת פרמטרים כגון הקטנת מהירות ומהפכות של ראש המקדח (איור 4D), כמו גם את עומק החדירה מבוקר מחשב סייע. ההליך פצע ניתן לנטר אופטי דרך חלון קדמי או על ידי מצלמה ברזולוציה גבוהה שמתעדת את כל השלבים במהלך הפציעה הליך. גודל, צורה ועומק של פציעת הפצע יכולים להיות מותאם באופן אינדיבידואלי (איור 4C).
אפיון איור 1. של תאים המשמשים לבניית שווה עור בעובי מלא. מכתים immunohistochemical של fibroblasts עורי האנושי הראשוני לvimentin () ושל קרטינוציטים אפידרמיס לחוט להט הבידול המוקדם קרטין cytokeratin-14 (B) וcytokeratin נימה הבידול מאוחר -10 (C). צביעה חיובית מוצגת על ידי צבע חום. ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
6 / 52576fig2.jpg "/>
איור 2. שינויים בתנאי תרבות והתבגרות שווים עור בעובי מלא. תמונות מקרוסקופית של עור בעובי מלא ושווי תרבית למשך 7 ימים בתנאי submers () ו -14 ימים בממשק האוויר הנוזלי (B). השוואה של מכתים Haematoxylin & Eosin שווה עור בעובי מלא בשלבי התפתחות שונים: לאחר 7 ימים (C), 14 ימים (7 ימים בממשק האוויר הנוזלי, D) ו- 21 ימים (14 ימים בממשק האוויר נוזלי, E). צביעת Haematoxylin & Eosin של עור האם של אדם (F). ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
pg "/>
אפיון איור 3. שווים עור בעובי מלא השוואה של מכתים immunohistochemical שווה עור בעובי מלא. (- D) ועור אנושי ילידים (E - H) לvimentin (A, E), cytokeratin-14 (B, F), cytokeratin-10 (C, G) ופילגרין (D, H). ברים בקנה מידה מצביעים על 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. התקן אוטומטי פציעה לפציעה מבוקרת בעור שווה בעובי מלא. מכשיר הפציעה האוטומטית (AWD) מספק conditio סטריליns במהלך ההליך המבוקר פציעה (). מחשב מחובר (CPU) שולט AWD. שווה מלא עור עובי (ftSEs) מונחים על צלחת ספק מדגם (SCP), סטיות במורפולוגיה המדגם השוותה על ידי מחסום מהירות אור (LB), אשר מפעיל את הליך הפציעה. צורת הפצע תלויה בראש הקידוח משמש (DH). הקוטר נע בין 1 מ"מ (C, תמונה עליונה) עד 2 מ"מ (C, תמונה תחתונה). הליך הפציעה הוא פיקוח ויכול להיות מוקלט לתיעוד וניהול איכות (D). Hematoxylin וEosin מוכתם חתך של מקביל עור בעובי מלא פצועה עם מכשיר הפציעה האוטומטית באמצעות ראש 1 מ"מ קידוח (E). כל הברים בקנה מידה מצביעים על 2 מ"מ. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בתאים במבחנה, בדרך כלל, הרחיבו בתרביות תאים הדו-ממדי, שבו תאים לדבוק משטחי פלסטיק. עם זאת, תנאי התרבות אלה אינם משקפים את התנאים תלת ממדים הפיסיולוגיים שבו תאים לגדול in vivo. בתנאים תלת-ממדיים, תאים יכולים ליצור קבצים מצורפים תא-תא ותא-מטריצה טבעיות ולהעביר בשלושה ממדים. במיוחד בפצע עורי ריפוי הדמיון של המצב בvivo הוא ציר מרכזי להפיק נתונים משמעותיים, כמו נדידת תאים ודור מטריצה הם מרכיבים מרכזיים של ריפוי פצעים.
כדי לחקות את התנאים אלה פיתחנו FTSE שמורכבים מתאים ראשוניים אנושיים ומשקפים הן את עורי ושכבת אפידרמיס של העור. במהלך שבועיים של התרבות בממשק האוויר נוזלי, HEK ליצור האפידרמיס מורכב מכמה שכבות של קרטינוציטים בשלבי התמיינות שונים ושכבה קרנית. Furthermore, שכבת הדרמיס מורכבת מHDF, שמוטמעים בקולגן אני הידרוג'ל. במהלך זמן התרבות, HDF לשפץ את רכיב עורי, מה שגורם התכווצות משמעותית של הדגמים (איור 2).
כדי להכין את הפצעים לשחזור וסטנדרטיים, שפיתחנו AWD. המכונה המחשב נשלט יכולה להגדיר פציעות עורית מוגדרות ומדויקות (איור 4). בהתאם לנועדה מחקר, עומק, צורה וגודל של הפגיעה יכולה להיות מותאם. עם זאת, בשל המפרט הטכני של AWD והמורפולוגיה של FTSE, מומלץ להגדיר חדירה מינימאלית של 100 מיקרומטר שחזור. AWD פועל בתנאים סטריליים בתיבה-מערכת סגורה וניתן לעקר את כל הרכיבים על ידי מעוקר, פתרונות חיטוי או אור אולטרה סגול. כהכנה להליך פצע הדגימות צריכים להיות מועברות לצלחת ספק מדגם. צלחת זה מקלהמיקום מדויק של הדגימות. יתר על כן ההדבקה בין המדגם וצלחת ספק מדגם מספיק כדי לשמור על הדגימות במקום במהלך הליך הפציעה. הליך הפציעה עצמו יכול להיות במעקב אופטי דרך חלון קדמי או על ידי מצלמה ברזולוציה גבוהה שמתעדת את כל השלבים ממצב מקרוב. בניגוד למערכות אחרות המשתמשות בלייזרים לחפור רקמה ליצירת פצע, AWD מעסיק תרגיל מסתובב. לפיכך, אין חום מוחל במהלך ההליך, שהוא זְכוּת מְיוּחֶדֶת חיונית לחקור פצעים מכאניים. בנוסף, צורה מסוימת של ראש הקידוח מבטיחה הסרת חומר מערוץ הפצע. באמצעות פרמטרים פציעה אמפירי נקבעו שהוזכרו לעיל ההליך פצע יכול להיות מותאם כדי לענות על מאפיינים פיסיולוגיים ספציפיים של כל אחד FTSE או דגימות עור ילידים. בדרך זו ניתן למזער תופעות לוואי לא רצויות כמו ניתוק מכוון של שכבות אפידרמיס ופציעת שחזור שבוצעה עם שיעור הצלחהשל 90%.
מחקר זה מוכיח כי FTSE פיתח לחקות חלקית את המצב בvivo של עור בצורה מדויקת ולכן יכול להיות מועסק כמודל ללימודי ריפוי פצע. למרות שהיבטים חשובים של תהליך ריפוי הפצע כגון ההשפעה של המערכת החיסונית בכלי הדם, קריש הדם וחסרים במודל, האינטראקציה אפידרמיס-mesenchymal ותא-מטריצה סכמה בסביבה סטנדרטית מאוד תלת-ממדי. בנוסף, נוכל להראות שAWD יוצר פצעים סטנדרטיים בדגמי עור. בשילוב, ניתן להשתמש בשתי הטכנולוגיות לחקור ריפוי פצעים וההשפעה של חומרים ותרופות התומכים בתהליך הריפוי. כדי לחקות את המצב בvivo באופן הדוק יותר, ניתן להאריך FTSE על ידי תאים אחרים כמו מלנוציטים, תאים סרטניים בעור או תאי האנדותל מיקרו-וסקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A.
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H.
- Cory, G.
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
- Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
- Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
- Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
- Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
- El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
- Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
- Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
- Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
- Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
- Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
- Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
- Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
- El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
- Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
- Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
- Bell, E., et al.
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
