Introduction
皮肤是身体的最大器官。它创建的外部环境和内部器官之间的屏障。此外，在皮肤保护身体免受流体损失，环境影响，伤害和感染和有助于调节体温1。由于其暴露的位置，皮肤往往受机械，热或化学损伤。虽然皮肤通常能够自我修复，多个本地因素如感染，氧合，和静脉充分可导致受损的伤口愈合。伤口愈合也可以通过全身性因素，如肥胖，酒精中毒，吸烟，药物，营养和疾病，如糖 尿病干扰。2
伤口愈合的过程中，可分为3个阶段：（i）该炎性阶段，（ii）所述增殖性和（ⅲ）重塑期。时伤害皮肤，复信号级联开始，从而导致伤口的闭合。3伤后，伤口出血并形成血块。成纤维细胞进入血液凝块并将其与随后被改造多年来新组织取代。
的生物学过程底层皮肤修复的当前理解是有限的。小动物及猪的模型已被用于研究伤口愈合。然而，这些结果不能被直接转移到由于物种特异性差异人类。除了 这些体内模型中 ，伤口愈合的某些方面可以通过经由在体外单层培养的基础上永生化细胞系或原代细胞刮擦模拟伤口的情况进行研究。4这些刮擦模型高度标准化，但不充分反映复合体内生理学5除了二维模型，三维人体皮肤等同物已经开发了用于皮肤病学研究。这些车型的真皮部分是GEnerated使用各种支架包括脱细胞真皮，6胶原水凝胶，7,8-糖胺9或合成材料10采用这些皮肤当量的上皮-间充质相互作用11的作用下，再上皮，成纤维细胞和角化细胞并且所述的蜂窝串扰的不同生长因子的影响进行研究。此外，这些模型是有用的，以获得有关如何成纤维细胞迁移到受伤区域，以及如何趋化因子影响的组织再生的新知识。12
不仅产生的伤口愈合模型本身的是具有挑战性的，而且还建立了高度标准化伤口模型中是有问题的。常见的技巧，营造出伤口划痕试验，13烫伤，14纸带耐磨，15热损伤，吸16水泡，17液氮，18激光器，19 ，18 meshers 6和活检拳。20这些方法大多有同样的缺陷。手动实施伤害是难以标准化和多次测试的重现。大小，形状和伤口的深入研究之间变化，从而削弱研究的数据的质量。利用激光对皮肤定义伤人可以比较容易地标准化，但导致一种情况模仿烧伤创面。由激光所施加的热可引起蛋白质变性，血小板聚集或血管收缩，这可导致坏死组织。
在另一种方法，我们开发了一个自动装置伤人（AWD），这使我们能够产生无菌条件下定义和精确的皮肤伤口。伤人的参数，如穿透深度和速度以及钻头的转速可以调节。在这项研究中，我们结合在内部开发的全层皮肤替代物的AWD（英尺SE），其是相当于由Gangatirkar 等人发表的协议。8皮肤等效的真皮层由人真皮成纤维细胞（HDF），它被嵌入在一个I型胶原凝胶。在真皮层，人表皮角化细胞（HEK）是种子。两周内，在空气-液体界面的HEK建立几个重要的细胞层和角质层组成的表皮。除了这种模式的产生，这项研究显示使用AWD的在富时创建定义和精确的伤口。
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Protocol
注：该协议被设计为生产24全层皮肤等同物。人皮肤成纤维细胞和表皮角质形成细胞从皮肤活检根据此前公布的协议隔离。21,22知情同意书事先获得的研究是通过对人体的朱利叶斯-马克西米利-维尔茨堡大学的研究机构伦理委员会（投182 / 10）。
1.生产真皮组件的
- 溶解的胶原蛋白与0.1％乙酸至6毫克/毫升的最终浓度。用于凝胶和溶液，混合232.5毫升的2×DMEM，7.5毫升胎牛血清，7.5毫升的3M HEPES 2.5毫升硫酸软骨素（5毫克/毫升）。保持凝胶中和溶液和胶原溶液在冰上。计算500微升每个刀片/皮肤替代物凝胶。
注：由于凝胶和溶液将与胶原溶液编写，J两部分混合重新胶原蛋白双倍金额。 - 将24插入到24孔板。
- 在10毫升的DMEM，离心5分钟，在270×g离心悬浮的人真皮成纤维细胞（HDF），并计数细胞。在270中提取5分钟HDF的所需量（每500微升胶原凝胶5×10 4个细胞），并离心将细胞×g下。
- 除去上清液，小心悬浮HDF 4毫升冷凝胶和溶液不会产生气泡。从该步骤中做出肯定的工作尽可能快，以避免胶原凝胶的过早凝固。
- 悬浮用8ml的胶原溶液的溶液中。
- 取胶原细胞混合物与多步移液器和在每个插入填迅速加入500μl混合物。孵育凝胶进行20分钟，在培养箱（37℃，5％的CO 2），以果冻的凝胶。
- 浸没凝胶的2ml Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）+ 10％胎牛血清每孔血清（FCS）的孵育它24小时在恒温箱（37℃，5％的CO 2）。
2.加人表皮角化（HEK）
- 24小时后取出媒介。溶解用超纯水纤连蛋白的人类蛋白质为50微克/毫升的最终浓度。每张真皮相当于25微升的纤维连接蛋白的解决方案。孵育凝胶进行30分钟，在培养箱（37℃，5％的CO 2）。
- 在此期间，悬浮HEK在10毫升KGM-2，并设置细胞浓度为1×10 6个细胞/ ml用KGM-2准备+ 5％FCS中。种子1×10 5个HEK每个凝胶。孵育凝胶在孵化45分钟（37℃，5％的CO 2），以使细胞粘附。
- 浸没凝胶与KGM-2准备+ 5％FCS和培养他们在培养箱中（37℃，5％的CO 2）。
3.文化的全层皮肤当量（FTSE）
- 文化FTSE 6-7天降序FCS的浓度（5％，2％和0％FCS）中。与下一个较低的FCS浓度改变介质每2-3天。对于这一点，完全除去介质并加入1.6毫升新鲜培养基。
- 第7天，彻底清除中。
注意：不要触摸FTSE表面吸管尖，而这样做。 - 将每插入1井6孔板用无菌镊子。添加1.5毫升空运中每孔，保证不弄湿FTSE表面。改变培养基每2-3天为14天。
注意：介质的填充水平达到富时的弯液面。
4.组织学分析
- 固定和石蜡包埋的金融时报指数
- 除去培养基，在新鲜的24孔板在RT传送插入和通过加入1.6毫升％多聚甲醛的4至每个孔固定组织孵育组织2小时。注意！多聚甲醛是有毒的，操纵下通风柜。转让富时到组织包埋盒。通过水洗除去残留固定剂和使用升序的乙醇浓度进行脱水的组织。
- 划分皮肤相当于在中间垂直切割。将两片的石蜡填充金属底座模具切割面向下。添加组织盒上的模具作为背衬的顶部。
- 切3-5微米片，它们漂浮在40℃水浴矫直，安装滑动到适合显微镜载玻片。干片彻底。
- 苏木精 - 伊红（H＆E）和免疫组织化学（IHC）染色
- 地方滑进齿条和孵育1小时，在60℃。确保石蜡熔化。染色再水化H＆E片作为一个标准化的概述染色。
- 对于H＆E染色准备4倍玻璃染色用试管二甲苯，3乙醇96％，2倍与70％乙醇，1个乙醇50％，4倍去离子水，1个苏木，1个盐酸-Ethanol（13.7毫升1M的HCl广告200毫升50％乙醇），1个标签的水，1×曙红和2x 2-丙醇（100毫升去离子水1克曙红）。
- 地方滑入二甲苯I 10分钟和10分钟的二甲苯二deparaffinize和补充水分的幻灯片。浸滑动3倍的乙醇96％I，3倍于乙醇96％的二，3倍的乙醇为70％和3倍的乙醇50％。旋转在去离子水滑梯。为了区分苏木染料，在盐酸乙醇浸2倍。用去离子水冲洗。对于发蓝，地方滑5分钟，卡水。对于伊红染色，地点在滑伊红1分钟和去离子水清洗之后。进行脱水，浸幻灯片2倍的乙醇70％，2倍的乙醇96％，并放置5分钟在2-丙醇中我，5分钟在2-丙醇二，5分钟，二甲苯I和5分钟，二甲苯二。 H＆E染色后，细胞核被染成蓝色，细胞质和细胞外基质被染成红色。
- 对于抗原修复，取出石蜡与二甲苯和补充水分切片进行染色。地方片在蒸汽烹调器，煮脱蜡和再水合的切片20分钟在预先加热的10mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6）。
- 在洗涤液的地方幻灯片（PBS缓冲液+ 0.5％吐温20）和圆形切片与液体驱蚊幻灯片记号笔或钻石笔。
- 将幻灯片中的水分室。阻断内源性过氧化物酶，通过添加100微升3％的过氧化氢溶液在每个切片。注意！非常危险的情况下接触皮肤和眼睛。处理与个人防护装备。洗涤滑动在洗涤缓冲液中。
- 应用第一抗体孵育1小时，在室温。洗涤滑动三次以洗涤缓冲液。从这里开始，样品应保持在黑暗中。
- 用生物素 - 链霉检测系统用于检测特异性抗原 - 抗体结合的。
- 对细胞核用苏木1分钟。脱水和安装幻灯片。
- 使用逆显微镜图像样本。
- 通过消毒用70％乙醇及紫外线的工作区域准备AWD。确保所需大小的钻探头（ 例如，1毫米）附连。
- 将皮肤替代物成为使用无菌镊子蒸压样品载板的指定区域。将样品承载板到下面的钻削头部的插座。
- 使用控制软件如下设置伤人参数：旋转速度：15000转;穿透1.5毫米;推进：100赫兹。这些参数需要为每个样品类型单独定义。转移伤人参数的AWD。
- 开始伤人的过程。从插槽中取出样品载板。转印负伤富回用于使用无菌镊子培养插入。
- 继续受伤富时在培养箱培养（37℃，5％CO 2）的用于再生的调查。阿尔替换地，可使用的模型进行组织学分析在任何时间。
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Representative Results
分离的HDF和HEK无论在形态和在典型的标记物的表达不同。高密度板呈现典型的梭形形态，而HEK形态可以由鹅卵石形态加以说明。使用它们对富时之前的细胞进行表征通过免疫组织化学染色（ 图1）。高密度板是积极的波形（ 图1A），标记为成纤维细胞。初级HEK高度表达早期分化蛋白细胞角蛋白14（ 图1B），但几乎没有迟到角质细胞分化蛋白细胞角蛋白10（ 图1C）。
以下原代培养，我们脱离细胞从细胞培养瓶中，并用它们对富时的生成。富时培养根据submers接着在空气-液体界面（ 图2B）14天的培养7天培养基条件下（ 图2A）。在此过程中，在F谢合同显著。在21天内HEK正在激增（ 图2C-E）。通过改变这样的方式，该模型的表面被暴露在空气中，并通过增加钙离子浓度的中等水平，所述HEK被刺激分化成，它由角质形成细胞在不同分化状态的几个重要的细胞层的多细胞表皮和角质层 （ 图2E）。
与天然人的皮肤比较富时（ 图2E）的苏木精-伊红染色（ 图2F），可以很明显的皮肤FTSE模仿组织架构。这可以通过免疫组化染色（ 图3）进一步显现。所述HDF中胶原蛋白I的水凝胶，可以用针对波形蛋白的初级抗体（ 图3A中的E）。角质形成细胞形成的细胞角蛋白14 positiv组成的表皮层E细胞（ 图3B，F）和晚期分化标志物细胞角蛋白10的表达在超基底层（ 图3C，G）。此外， 角质层是阳性的聚丝蛋白（ 图3D中的H）。
经过21天的培养期，AWD用于生成皮肤伤口富时。 如图4A所示 ，AWD构造为封闭箱系统，以确保在无菌条件。在图4B中 ，受伤过程的示意图是证明。富时被固定在一个样本载板。整个伤人过程，包括参数，如下降速度和钻头（ 图4D）的转速的设置以及渗透的深度被控制的计算机的协助。该伤人过程可以光学经由前窗或由高清晰度摄像机，该受伤期间记录的所有步骤进行监控流程。尺寸，形状和伤口损伤的深度可单独调节（ 图4C）。
用于全层皮肤等同物的结构单元的用于早期分化角蛋白纤维细胞角蛋白14（B）和晚期分化灯丝角蛋白如图1的表征表皮角化细胞。原代人真皮成纤维细胞的免疫组织化学染色对波形蛋白（A）和-10（C）。阳性染色显示由褐色。比例尺表示100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图的培养条件和全厚度皮肤等同物熟化2变化。的全厚度皮肤的肉眼图片当量为submers条件（A），并在气-液界面（B）的14天下培养7天。的全厚度皮肤当量在不同发育阶段的苏木精-伊红染色的比较：后7天（℃），14天（7天在空气-液体界面，D）和21天（14天的空气-液体界面， E）。苏木精-伊红染色的天然人的皮肤（F）。比例尺表示100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
皮克“/>
（ - D A）和本机人体皮肤的全层皮肤替代物比较全层皮肤替代物免疫组化染色图3.表征。（E - 高）的波形（A，E），细胞角蛋白14（B，F），细胞角蛋白10（C，G）和聚角蛋白微丝（D，H）。比例尺表示100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.自动伤人的设备上的全层皮肤替代物伤人控制的自动化设备伤人（AWD）提供无菌conditio被控伤人步骤（A）期间纳秒。相连的计算机（CPU）控制全轮驱动。全厚度皮肤当量（ftSEs）放置在样品载体板（SCP），在样品形貌的偏差通过一个光屏障（LB），从而触发伤人过程相等。伤口形状取决于所用的钻头（DH）。直径范围从1毫米（C，上部图像）到2mm（C，较低的图像）。受伤的过程进行监控，并可以被记录为文件和质量管理（D）中 。苏木精-伊红染色的全层皮肤相当于使用1毫米钻头（E）的自动化设备伤人伤横截面。所有比例尺显示为2 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
体外细胞通常扩展在二维的细胞培养物，其中细胞粘附到塑料表面。然而，这些培养条件没有反映在其中细胞在体内生长的生理立体条件。根据三维的条件下，细胞可以形成天然的细胞 - 细胞和细胞 - 基质的附件和迁移在三维空间。特别是在皮肤伤口愈合的体内状况的相似性枢转以生成有意义数据，细 胞迁移和基质产生的伤口愈合的关键要素。
为了模仿这些条件，我们开发富时所组成的人原代细胞和反映了真皮和皮肤的表皮层。在培养两周在空气-液体界面，所述HEK形成在不同分化阶段和一个角质层的角质形成细胞的若干层构成的表皮。 ˚Furthermore，所述真皮层由HDF，它们嵌入在I型胶原凝胶。在培养过程中的时间，所述HDF重塑真皮成分，这导致在模型中（ 图2B）的一个显著收缩。
为了准备重复性和标准化的伤口，我们开发了一个全轮驱动。计算机控制的机器可以设置定义和精确的皮肤损伤（ 图4）。根据预期的研究，深度，损伤的形状和尺寸可适于。然而，由于该AWD和富时的形态的技术规范，它建议设置为100μm再现性最小的渗透。的AWD在无菌条件下操作在一个封闭箱系统和所有组件可以通过高压灭菌，消毒溶液或紫外线消毒。在准备过程伤人样品需要被转移到样品载体板。这有利于板块的样品的确切位置。此外样品和样品载体板之间的粘合力是足够的，以保持在样品中发生的伤人过程期间。受伤过程本身可以光学地通过前窗或由高清晰度摄像机，记录从特写位置的所有步骤进行监控。与使用激光来挖掘组织以产生伤口其它系统中，AWD采用一个旋转钻头。因此，没有热的过程，这是一个重要的油水调查机械伤口期间施加。此外，该钻削头部的特定形状确保了材料去除从伤口通道。使用过程伤人上述经验确定伤人参数可以调整，以满足任一富时或天然皮肤样本的特定的生理特性。这种方式的任何不希望的副作用等的表皮层无意脱离可以被最小化，并用成功率可再现伤人执行的90％。
这项研究表明，发达FTSE部分模仿皮肤准确的在体内的情况，因此可以作为一个典范伤口愈合的研究。虽然伤口愈合过程的重要方面，如脉管，血液凝块和免疫系统的作用缺乏在该模型中，表皮间质和细胞 - 基质相互作用被概括在一个三维高度标准化的环境。此外，我们还可以表明，AWD生成标准化伤口皮肤模型。在组合中，这两种技术可用于研究伤口愈合以及支持愈合过程的物质和药物的疗效。为了更接近地模拟体内的情况下，富时可以由其他细胞，如黑素细胞，皮肤肿瘤细胞或微血管内皮细胞进行扩展。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
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