Introduction
Huden er det største organet i kroppen. Den skaper en barriere mellom det ytre miljø og de indre organer. Dessuten beskytter huden kroppen fra væsketap, miljømessige påvirkninger, skader og infeksjoner og bidrar til å regulere kroppstemperaturen en. På grunn av sin utsatte sted, huden ofte påvirket av mekaniske, termiske eller kjemiske traumer. Selv om huden er generelt i stand til selv-reparasjon, kan flere lokale faktorer som infeksjon, oksygenering, og venøs forsyning føre til nedsatt sårheling. Sårtilheling kan også bli forstyrret av systemiske faktorer som fedme, alkoholisme, røyking, medisiner, ernæring og sykdommer som diabetes. 2
Prosessen med sårheling kan deles inn i tre faser: (i) den inflammatoriske fase, (ii) den proliferative og (iii) ombygging fase. Ved skade på huden, starter et komplekst signal-kaskade, som fører til nedleggelse av såret. 3Etter skade, blir såret blødning og en blodpropp er dannet. Fibroblaster flytte inn i blodpropp og erstatte den med nytt vev som deretter ombygd i løpet av årene.
Den nåværende forståelse av biologiske prosesser underliggende kutan reparasjon er begrenset. Små dyr og gris modeller har blitt brukt til å studere sårtilheling. Disse resultater kan ikke direkte overføres til mennesker på grunn av artsspesifikke forskjeller. I tillegg til disse in vivo-modeller, kan noen aspekter av sårheling bli studert ved å simulere et sår situasjon via skrape av in vitro-monolagskulturer basert på udødeliggjorte cellelinjer eller primærceller. 4 Disse skrape modeller er standardisert, men ikke i tilstrekkelig grad reflektere kompleks in vivo fysiologi. 5 Dessuten to-dimensjonale modeller, har tredimensjonale menneskelige hud ekvivalenter blitt utviklet for dermatologisk forskning. Dermal del av disse modellene er generated ved hjelp av ulike stillas inkludert decellularized dermis, 6 kollagen hydrogeler, 7,8 glykosaminoglykaner 9 eller syntetiske materialer. 10 Ved anvendelse disse hud ekvivalenter, rollen av epitel-mesenchymale interaksjoner 11, re-epitelialisering, den cellulære krysstale mellom fibroblaster og keratinocytter og påvirkning av forskjellige vekstfaktorer kan studeres. Videre disse modellene er nyttige for å få ny kunnskap om hvordan fibroblaster vandrer inn i såret området og hvordan kjemotaktisk faktorer påvirker vev gjenfødelse. 12
Ikke bare generering av sårtilheling modellen i seg selv er vanskelig, men også for å etablere en høyt standardisert viklet i en modell, er problematisk. Vanlige teknikker for å skape sår er skrapeprøver, 13 brannsår, 14 tape slitasje, 15 termisk skade, 16 suge blemmer, 17 flytende nitrogen, 18 lasere, 19 18 meshers 6 og biopsi stempler. 20 De fleste av disse metodene har de samme fallgruvene. Skader implementert manuelt er vanskelig å standardisere og å reprodusere mellom flere tester. Størrelse, form og dybde av såret varierer mellom studier og dermed forringe kvaliteten av forskningsdata. Bruk av laser for definerte hud såret relativt lett kan standardiseres, men fører til en situasjon hermet brannsår. Varme påføres ved laser kan forårsake denaturering av proteiner, blodplater aggregering eller fartøy innsnevring, hvilket kan føre til nekrotisk vev.
I en alternativ tilnærming, har vi utviklet en automatisert såret enhet (AWD), som tillater oss å generere definerte og presise kutane sår under sterile forhold. Såret parametere, slik som dybden og hastigheten av gjennomtrengning samt omdreininger av borehodet kan reguleres. I denne studien har vi kombinert AWD med i egenutviklede Fullhudstap ekvivalenter (ftSE) som er sammenlignbare med en protokoll som er publisert av Gangatirkar et al. 8 Den dermale laget av huden tilsvar er sammensatt av humane dermale fibroblaster (HDF), som er innleiret i en kollagen-hydrogel. På dermal lag, human epidermal keratinocytter (HEK) er seeded. Innen to uker på luft-væske-grensesnittet den Hek bygge opp en epidermis består av flere vitale cellelag og en stratum corneum. I tillegg til genereringen av denne modellen, viser denne studien ved bruk av AWD for å lage definerte og presise sår i FTSE-.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Protokollen er designet for produksjon av 24 Fullhudstap ekvivalenter. Menneskelig dermale fibroblaster og epidermal keratinocytter ble isolert fra hud biopsier i henhold til en tidligere utgitt protokoll. 21,22 Informert samtykke ble innhentet på forhånd, og studien ble godkjent av den institusjonelle etisk komité på menneskelig forskning av Julius-Maximilians-Universitetet Würzburg (stemme 182 / 10).
1. Produksjon av Dermal Component
- Oppløs kollagen med 0,1% eddiksyre til en sluttkonsentrasjon på 6 mg / ml. For gelen nøytralisering oppløsning, blande 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml føtalt kalveserum, 7,5 ml 3 M HEPES, 2,5 ml kondroitinsulfat (5 mg / ml). Hold gel nøytralisering løsning og kollagenløsning på is. Beregn 500 mL av gel per insert / hud tilsvarende.
MERK: Fordi gelen nøytralisering løsningen vil bli blandet med to deler av kollagen løsning behandling anleggre dobbel mengde kollagen. - Plasser 24 innstikk i en 24-brønners plate.
- Resuspender humane dermale fibroblaster (HDF) i 10 ml DMEM, sentrifuger i 5 minutter ved 270 xg og telle cellene. Trekke ut den nødvendige mengde av HDF (5 x 10 4 celler pr 500 ul kollagen-gel) og sentrifuger cellene i 5 min ved 270 x g.
- Fjern supernatanten og forsiktig resuspender HDF i 4 ml avkjølt gel nøytralisering løsning uten å produsere luftbobler. Fra dette trinnet sørg for å jobbe så fort som mulig for å unngå for tidlig fryser til kollagen gels.
- Resuspender løsning med 8 ml av kollagenløsning.
- Ta kollagen-celle-blandingen med en flertrinns-pipette og fylles raskt 500 ul av blandingen i hver pakning. Inkuber gelene i 20 minutter i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) for å jell gelene.
- Senk gelene i 2 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) + 10% føtalt kalveserum (FCS) per brønnog inkuberes det i 24 timer i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
2. Tilsetting av human epidermal Keratinocytter (HEK)
- Fjern medium etter 24 timer. Oppløs fibronektin humant protein med ultrarent vann til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml. Dekke hver dermal tilsvarende med 25 ul av fibronektin løsning. Inkuber gelene i 30 minutter i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- I mellomtiden, resuspender HEK i 10 ml KGM-2 og sett cellekonsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml med KGM-2 klar + 5% FCS. Seed 1 x 10 5 Hek på hver gel. Inkuber geler i 45 minutter i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) for å la cellene få feste seg.
- Submerse gelene med KGM-2 klar + 5% FCS og kultur dem i inkubator (37 ° C, 5% CO2).
3. Culture of Fullhudstap ekvivalenter (FTSE)
- Kultur FTSE for 6-7 dageri synkende FCS-konsentrasjon (5%, 2% og 0% FCS). Endre medium hver 2-3 dager med neste lavere FCS konsentrasjon. For dette må du fjerne helt medium og tilsett 1,6 ml friskt medium.
- På dag 7, fjerne medium helt.
MERK: Ikke ta på FTSE overflaten med tuppen av pipetten mens de gjør det. - Plasser hver sette inn i en brønn i en 6-brønners plate med steril pinsett. Tilsett 1,5 ml lufttransport medium per brønn, sikrer ikke å fukte FTSE overflaten. Endre medium hver 2-3 dag i ytterligere 14 dager.
MERK: fyllingsgrad av mediet er opp til menisken av FTSE.
4. Histologisk analyse
- Fikse og parafin-embedding av FTSE
- Fjerne dyrkningsmediet, overføre innsatser i friske 24-brønners plater og løse vev ved å tilsette 1,6 ml av 4% paraformaldehyd til hver brønn og inkuberes vevene i 2 timer ved RT. Forsiktig! Paraformaldehyd er giftig, manipulere henhold avtrekkshette. OverføringFTSE til en vev-embedding kassett. Fjern gjenværende fiksativ ved å vaske med vann og tørke vev ved hjelp av stigende etanolkonsentrasjoner.
- Fordel huden ekvivalent av et vertikalt snitt i midten. Plasser to stykker i en parafin fylt metall base formen med snittflatene nedover. Legg vevet kassetten på toppen av formen som et underlag.
- Skjær 3-5 mikrometer skiver og flyte dem på en 40 ° C vannbad for straite, montere slides på egnede objektglass. Tørre skiver grundig.
- Hematoxylin & eosin (H & E) og immunhistokjemisk (IHC) farging
- Sted glir inn i stativet og inkuberes i 1 time ved 60 ° C. Sørg for at parafin er smeltet. Stain rehydrert skiver med H & E som en standardisert oversikt farging.
- For H & E-farging forberede 4x glassfargings kyvetter med xylol, 3x med 96% etanol, 2 ganger med 70% etanol, 1 gang med 50% etanol, 4x deionisert vann, 1x hematoxylin, 1x HCl-ethanol (13,7 ml 1 M HCl ad 200 ml 50% etanol), 1x kategorien vann, 1x eosin (1 g eosin i 100 ml avionisert vann) og 2 x 2-propanol.
- Sted glir 10 min i xylol jeg og 10 min i xylol II til deparaffinize og rehydrere lysbilder. Dukkert glir 3x i etanol 96% jeg, 3x i etanol 96% II, 3x i etanol 70% og 3x i etanol 50%. Rotere lysbilder i avionisert vann. For å skille hematoxylin fargestoff, dip 2x i HCl-etanol. Skyll i avionisert vann. For blueing, glir sted 5 min i kategorien vann. For eosin farging, glir sted 1 min i eosin og vask etterpå i avionisert vann. For dehydrering, dip slides 2x i etanol 70%, 2 x i 96% etanol og plassere dem i 5 minutter i 2-propanol I, i 5 minutter i 2-propanol II, 5 min i xylol I og 5 min i xylol II. Etter H & E flekker, er cellekjerner farget i blått, cytoplasma og ekstracellulære matrise er farget i rødt.
- For antigen henting, fjerning av parafin med xylen og rehydrere skiver for farging. Plasser skiveri dampkoker og kok deparaffinized og rehydrerte skiver i 20 min i forvarmet 10 mM sitratbuffer (pH 6).
- Plasser lysbilder i vaskebuffer (PBS buffer + 0,5% polysorbat 20) og sirkel skiver med en væske frastøtende lysbilde sprittusj eller diamant pennen.
- Plasser lysbilder i fuktkammeret. Blokkere endogen peroksidase, ved tilsetning av 100 ul 3% hydrogenperoksidløsning på hver skive. Forsiktig! Svært farlig ved ved hud og øyekontakt. Håndtak med personlig verneutstyr. Vask glir i vaskebuffer.
- Anvende primære antistoff og inkuberes i 1 time ved RT. Vask glir tre ganger med vaskebuffer. Herfra på, bør prøvene holdes i mørket.
- Bruke biotin-streptavidin deteksjonssystem for påvisning av antigen-antistoff-binding.
- Counterstain kjerner med Hematoxylin i 1 min. Dehydrere og montere lysbildene.
- Bildeeksempler som bruker en invers mikroskop.
- Klargjør AWD ved desinfisering arbeidsområdet med 70% etanol og ultrafiolett lys. Sørg for at bore leder av ønsket størrelse (f.eks 1 mm) er festet.
- Plassere hud ekvivalenter i utpekte områder av autoklaveres prøvebærer plate ved hjelp av steril tang. Plasser prøven bæreplaten i sokkelen under borehodet.
- Bruk kontroll programvare for å sette såret parametere som følger: spin hastighet: 15 000 rpm; penetrasjon: 1,5 mm; fremdrift: 100 Hz. Disse parametrene må defineres for hver prøvetype individuelt. Transfer såret parametere til AWD.
- Begynn såret prosedyre. Fjern prøvebærer plate ut av stikkontakten. Transfer såret FTSE tilbake i innsatser for kultur ved hjelp av steril tang.
- Fortsett med kultur av sårede FTSE i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2) for undersøkelse av regenerering. Alternatively, bruke modeller for histologisk analyse når som helst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den isolerte HDF og Hek skiller seg både i morfologi og i uttrykk for typiske markører. HDF viste typisk spindel-formen morfologi, mens morfologi Hek kan beskrives med en brostein morfologi. Cellene ble preget av immunhistokjemisk farging (figur 1) før du bruker dem for FTSE. HDF er positive for vimentin (figur 1A), en markør for fibroblaster. Primær Hek sterkt uttrykke tidlig differensiering protein cytokeratin-14 (figur 1B), men nesten ingen sen keratinocyte differensiering protein cytokeratin-10 (figur 1C).
Følgende primær kultur, vi frittliggende cellene fra cellekulturflasker og brukte dem for generering av FTSE. FTSE ble dyrket i 7 dager under submers mellomforhold (Figur 2A) etterfulgt av en 14 dagers kultur på luft-væske-grensesnittet (figur 2B). I løpet av denne prosessen, fTSE kontrakt betydelig. Innen 21 dager Hek formerer (Figur 2C-E). Ved å endre mellomnivået på en slik måte at overflaten av modellene blir utsatt for luft, og ved å øke kalsiumkonsentrasjon, er den HEK stimulert til å differensiere til en multi-cellulære epidermis som er sammensatt av flere vitale cellelag av keratinocytter i forskjellige differensieringstilstander og en stratum corneum (2E).
Sammenligning av haematoxylin & eosin farging av FTSE (2E) med naturlig humant hud (figur 2F) det blir klart at FTSE ligner histologisk arkitektur av huden. Dette kan bli ytterligere demonstrert ved immunhistokjemiske stainings (figur 3). HDF i kollagen jeg hydrogel kan farges med primære antistoffer mot vimentin (figur 3A, E). Keratinocytter danner en epidermal lag bestående av cytokeratin-14 positive-celler (figur 3B, F) og sen differensierings markør cytokeratin-10 er uttrykt i de suprabasallagene (figur 3C, G). Videre er stratum corneum positive for filaggrin (figur 3D, H).
Etter 21 dagers kultur perioden ble AWD brukes til å generere kutane sår i FTSE. Som vist i figur 4A, er AWD konstruert som en lukket boks-system for å sikre sterile forhold. I figur 4B er en skjematisk tegning av sårene prosessen vist. FTSE er festet på en prøvebærer plate. Hele såret prosessen, inkludert innstilling av parametere slik som senkehastighet og omdreininger av borehodet (figur 4D), så vel som inntrengningsdybden styres dataassistert. Den såret prosedyre kan overvåkes optisk via en foran vinduet eller ved et høyoppløselig kamera som registrerer alle trinnene i løpet av såret prosedyren. Størrelse, form og dybde av såret skade kan justeres individuelt (figur 4C).
Figur 1. Karakterisering av celler som anvendes for bygging av full tykkelse hud ekvivalenter. Immunhistokjemisk farging av primære humane dermale fibroblaster for vimentin (A) og av epidermale keratinocytter for tidlig differensierings keratin filament cytokeratin-14 (B) og sen differensieringsfilament cytokeratin -10 (C). Positiv farging er vist med brun farge. Skala barer indikerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6 / 52576fig2.jpg "/>
Figur 2. Endringer av kulturforhold og modning av Fullhudstap ekvivalenter. Makroskopiske bilder av full tykkelse hud ekvivalenter dyrket i 7 dager under submers forhold (A) og 14 dager på luft-væske-grensesnittet (B). Sammenligning av hematoksylin og eosin-farging av full tykkelse hud ekvivalenter i forskjellige utviklingsstadier: Etter 7 dager (C), 14 dager (7 dager ved luft-væske-grensesnittet, D) og 21 dager (14 dager ved luft-væske-grensesnittet, E). Hematoksylin-eosin-farging av naturlig human hud (F). Skala barer indikerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
pg "/>
Figur 3. Karakterisering av full tykkelse hud ekvivalenter Sammenligning av immunhistokjemisk farging av full tykkelse hud ekvivalenter. (A - D) og native human hud (E - H) for vimentin (A, E), cytokeratin-14 (B, F), cytokeratin-10 (C, G) og filaggrin (D, H). Skala barer indikerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Automatisk såret Enhet for kontrollert såret på full tykkelse hud ekvivalenter. Den automatiserte såret enhet (AWD) gir sterile conditions under kontrollerte såret prosedyre (A). En vedlagt datamaskin (CPU) styrer AWD. Den fulle tykkelse hud ekvivalenter (ftSEs) blir plassert på prøven bæreplaten (SCP), blir avvik i prøven morfologi utlignet av en fotocelle (LB), som utløser såret prosedyre. Såret formen avhenger av den brukte borehodet (DH). Diameteren varierer fra 1 mm (C, øvre bilde) til 2 mm (C, lavere bilde). Sårene prosedyre overvåkes og kan registreres for dokumentasjon og kvalitetsstyring (D). Hematoxylin & eosin farget tverrsnitt av en full tykkelse hudekvivalent såret med den automatiserte såret enheten ved hjelp av en 1 mm borehodet (E). Alle skala barer indikere 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro-celler blir vanligvis utvidet i todimensjonale cellekulturer, hvori cellene fester seg til plastoverflater. Men disse dyrkningsbetingelser ikke nødvendigvis de fysiologiske tredimensjonale betingelser hvor cellene vokser in vivo. Under tredimensjonale forhold, kan cellene danner naturlige celle-celle og celle-matriks-vedlegg og migrere i tre dimensjoner. Spesielt i kutan sårheling likheten av in vivo situasjonen er avgjørende for å skape meningsfulle data, som cellemigrasjon og matrise generasjon er sentrale elementer i sårheling.
For å kunne etterligne disse betingelsene vi utviklet FTSE- som er sammensatt av humane primære celler og reflektere både dermale og epidermale lag av huden. I løpet av to ukers kultur ved luft-væske-grensesnittet, HEK danne en epidermis sammensatt av flere lag av keratinocytter i forskjellige faser og en differensierings stratum corneum. Furthermore er dermal lag sammensatt av HDF, som er innebygd i en kollagen jeg hydrogel. I løpet av tiden kultur, HDF fornye dermal komponenten, hvilket resulterer i en betydelig krymping av modellene (figur 2B).
Å forberede reproduserbare og standardiserte sår, utviklet vi en AWD. Den datastyrte maskin kan stille definerte og presise kutane skader (figur 4). Avhengig av den tiltenkte forskning, dybden, formen og størrelsen av skaden kan tilpasses. Men på grunn av de tekniske spesifikasjonene til AWD og morfologi av FTSE, anbefales det å sette en minimal inntrengning av 100 mikrometer reproduserbarhet. AWD opererer under sterile betingelser i en lukket boks-systemet og alle komponentene kan steriliseres ved autoklavering, desinfeksjonsløsninger eller ultrafiolett lys. Som forberedelse til såret prosedyre prøvene må overføres til en prøvebærer plate. Denne platen gjør ennøyaktige plasseringen av prøvene. Videre er adhesjonen mellom prøven og prøven bæreplaten er tilstrekkelig til å holde prøvene på plass i løpet av såret prosedyren. Sårene prosedyren i seg selv kan overvåkes optisk via en foran vinduet eller ved et høyoppløselig kamera som registrerer alle trinn fra et nærbilde posisjon. I motsetning til andre systemer som bruker lasere til å grave ut vev for å generere et sår, syssels AWD en roterende drill. Således er ingen varme tilføres i løpet av prosedyren, noe som er en viktig perquisite å undersøke mekaniske sår. I tillegg er spesifikke formen av borehodet sikrer fjerning av materiale fra såret kanalen. Ved hjelp av empirisk bestemt såret parametere nevnt ovenfor såret prosedyren kan justeres for å møte spesifikke fysiologiske egenskaper enten FTSE eller innfødte hudprøver. Denne måten noen uønskede bivirkninger som utilsiktet avløsning av epidermal lag kan minimeres og reproduserbar såret utført med en suksessratepå 90%.
Denne studien viser at de utviklede FTSE- delvis etterligne in vivo situasjonen for huden nøyaktig og kan således anvendes som en modell for sårheling studier. Selv om viktige sider ved sårheling Fremgangsmåte for eksempel effekten av vaskulaturen, blodpropp og immunsystemet mangler i modellen, er den epidermale-mesenchymale og celle-matrise-interaksjons rekapitulert i en tre-dimensjonal sterkt standardisert miljø. I tillegg kunne vi vise at AWD genererer standardiserte sår i huden modeller. I kombinasjon, kan begge teknologier kan brukes til å undersøke sårheling og virkningen av stoffer og stoffer som understøtter helbredelsesprosessen. For å etterligne in vivo situasjonen nærmere, kan den FTSE- forlenges med andre celler som melanocytter, hud tumorceller eller mikro- vaskulære endotelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A.
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H.
- Cory, G.
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
- Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
- Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
- Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
- Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
- El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
- Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
- Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
- Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
- Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
- Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
- Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
- Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
- El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
- Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
- Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
- Bell, E., et al.
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
