Introduction
De flesta vävnader i kroppen är mjuka viskoelastiska material med en Youngs modul som sträcker sig från 0,1 kPa för hjärnan till 100 kPa för mjukt brosk, men ändå, de flesta in vitro cellforskning bedrivs på vävnadskulturpolystyren (TCP) som har en modul av ~ 1 GPa . 1 Denna stelhet obalans påverkar i hög grad hur celler reagerar på sin omgivning. En växande mängd forskning är alltså tillägnad belysa effekten av substrat styvhet på öde olika celltyper, 2,3 inklusive stamceller. 4 Som ett resultat har flera hydrogeler utvecklats för att underlätta förståelsen av styvhet beroende cell biologi inklusive polyakrylamid (PA), 5-7 polyetylenglykol (PEG), 8,9 polydimetylsiloxan (PDMS), 10 och alginat. 11 Medan bevis för att underlaget stelhet har en betydande inverkan på cell öde växer, är de flesta studierna bedrivs på liten skala med ett litet antal spel. Systematiska, flerdimensionella studier om effekten av substrat styvhet för en rad celltyper eller miljöförhållanden är sällsynta. 12
Flera lovande hög kapacitet hydrogel teknik har utvecklats, bland annat PEG-baserade microarrays, 13 mikrofluidikanordningar för produktion av agaros hydrogel mikropärlor, 14 eller mikro och nanostavar där styvhet moduleras av diametern och höjden på microrods. 15 Dock , den teknik för att förbereda sådana substrat är sofistikerade och tillgängliga för ett begränsat antal laboratorier. Mycket forskning involverar styvhet modulerad cellsvar utnyttjar polyakrylamid (PA) geler som inte bara är billig och enkel att genomföra, men uppvisar också ett fysiologiskt relevant utbud av Youngs modul, nämligen 0,3 -. 300 kPa 16-22 Men befintliga metoder för att tillverka PA geler för cellodling är arbetskrävande och därmed prepared i små satser. Några av de svårigheter som är förknippade med beredningen av PA geler som cellsubstrat härrör från kravet att gelerna måste vara beredda: 1) i frånvaro av syre för att möjliggöra fullständig polymerisation, 2) med en plan och jämn yta för att möjliggöra en enhetlig cell fastsättning och spridning, och 3) som är permanent fäst på botten av cellodlingsskål för att förhindra flytande.
Flera grupper har försökt att producera PA geler för cellodling i stora serier. Semler et al., Beredda tjocka ark av PA-geler vilka därefter "cut" med en hålstans och placerades i 96-brunnsplattor. 23 Emellertid är denna metod begränsad till styvare geler, dvs,> 1 kPa i Youngs modul, eftersom mjukare geler är "klibbiga", svårt att skära, och skadas lätt. Mih et al. Utvecklat en mer sofistikerad teknik som tillåter gelema att bli direkt polymeriseras i en glasbottnad flerkällsplatta.
Detta dokument beskriver ett enkelt och billigt sätt att montera PA geler i en flerkällsplatta som lätt kan antas av alla laboratorier. Här är en flexibel plaststöd utnyttjas, som har två sidor - en hydrofob en, som är motbjudande till PA geler, och en hydrofil en, som kovalent binder PA gel vid deponering. När PA gel ark deponeras och permanent fäst på flexibla plaststöd, möjliggör det hanterar geler av valfri tjocklek eller styvhet och skär dem i någon önskad form. Denna ca.oach inte bara producerar anpassade plast 'täck' i storlekar som inte på annat sätt är kommersiellt tillgängliga, utan även undanröjer behovet av att förbehandla glasytor, antingen glas täckglas eller brunnarna i kostsamma glasbottnade flerbrunnsplattor, med ett PA-bindande lösning, som är en mödosam och tidskrävande steg. Slutligen kan enhetliga PA geler ark framställas i stora satser och lagras de-hydrerad under flera månader.
Sammanfattningsvis analysen presenteras här är en förbättring jämfört med befintliga metoder i flera aspekter. Först, är processen för flerkällsplatta aggregatet effektiv, och den totala kostnaden för de material som behövs är låg. För det andra är de hydrogeler framställs i stora satser i en enda homogen gelfilm. Slutligen är endast material som är kommersiellt tillgängliga som krävs. Nyttan av analysen illustreras genom att utforska effekten av substrat styvhet på cellmorfologi och spridningsareal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av hydrogel-associerade Lösningar och Alikvoter
- Framställning av polyakrylamidgel prekursorlösning.
- Bered polyakrylamidgel prekursorlösning genom blandning akrylamid (A) (40% vikt / volym, M r 71,08 g / mol), tvärbindningsmedlet bisakrylamid (B) (2% vikt / volym, M r 154,17 g / mol), och de- joniserat vatten i volym procentsatser som anges i tabell 1.
OBS: Dessa lösningar kan framställas i stora satser och lagrades vid 4 ° C i upp till flera månader.- VARNING: Akrylamid är giftigt vid inandning eller förtäring, särskilt när i pulverform: alltså, helst använda 40% vikt / volym lösning för att minska riskerna toxicitet. Handtag endast iklädd skyddskläder, såsom handskar, skyddsglasögon och skyddsrock. Förvaras i ett ljusstarkt, väl tillsluten behållare i kylskåpet (<23 ° C, väl ventilerad plats).
- VARNING: Bis-akrylamid är giftigt vid inandning eller förtäring, särskilt,när i pulverform: alltså, helst använda 2% vikt / volym lösning för att minska riskerna toxicitet. Handtag endast iklädd skyddskläder, såsom handskar, skyddsglasögon och skyddsrock. Förvaras i ett ljusstarkt, väl tillsluten behållare i kylskåpet (<4 ° C, väl ventilerad plats).
- Bered polyakrylamidgel prekursorlösning genom blandning akrylamid (A) (40% vikt / volym, M r 71,08 g / mol), tvärbindningsmedlet bisakrylamid (B) (2% vikt / volym, M r 154,17 g / mol), och de- joniserat vatten i volym procentsatser som anges i tabell 1.
- Framställning och användning av N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrofenylamino) hexanoat (Sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) alikvoter. VARNING: Sulfo-SANPAH orsakar allvarlig ögonirritation; handtag med handskar och ordentlig ögon eller ansiktsskydd. Förvara vid -20 ° C vid mottagandet och innan alikvotering.
- För att lagra sulfo-SANPAH: lös Sulfo-SANPAH i dimethylsulfoxane (DMSO) vid 50 mg / ml. Alikvotera stamlösningen i 50 mikro centrifugrör av 20 fil per rör. Flash frysa på torris eller flytande kväve (ett valfritt men föredrog steg för att bevara maximal tvärbindningseffektivitet) och förvara vid -80 ° C.
OBS: De portioner can lagras i flera månader. - För att använda sulfo-SANPAH: tina kort alikvoten och späd i 480 pl avjoniserat vatten. Används omedelbart. Sulfo-SANPAH hydrolyserar snabbt i vatten: därför vidta försiktighet för att utföra alla stegen ovan snabbt.
- För att lagra sulfo-SANPAH: lös Sulfo-SANPAH i dimethylsulfoxane (DMSO) vid 50 mg / ml. Alikvotera stamlösningen i 50 mikro centrifugrör av 20 fil per rör. Flash frysa på torris eller flytande kväve (ett valfritt men föredrog steg för att bevara maximal tvärbindningseffektivitet) och förvara vid -80 ° C.
- Framställning av ammoniumpersulfat (M ^ 228,18 g / mol) alikvoter.
OBS: Ammoniumpersulfat orsakar ögon, hud och andningsirritation. Bär lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering. Handtag ammoniumpersulfatlösning pulver i dragskåp. Store pulver i en torr, väl ventilerad plats. När alikvoteras, kunde den utspädda lösningen användas på arbetsbänken.- Lös ammoniumpersulfat i avjoniserat vatten för att uppnå en slutlig ammoniumpersulfat koncentration av 10% vikt / volym. Alikvotera och förvara vid -20 ° C. Tina omedelbart före användning.
- Framställning av kollagen typ I-lösning.
- Förbered 0,2 mg / ml kollagenlösning genom utspädning av aktie sålution i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med pH 7,4. Förvara på is kort eller använd omedelbart efter utspädning.
2. Hydrogel beredning (Se Figur 1)
- Beredning av hydrofoba glasskivor.
- Placera några droppar av en hydrofob lösning på en glasplatta och använda silkespapper för att spridas över ytan. Låt lufttorka och torka med en silkespapper igen för att jämna ut den hydrofoba beläggningen.
OBS: Affär hydrofoba lösning i en brandfarlig skåp vid RT. Använd personlig skyddsutrustning vid hantering. Arbeta i ett väl ventilerat utrymme.
- Placera några droppar av en hydrofob lösning på en glasplatta och använda silkespapper för att spridas över ytan. Låt lufttorka och torka med en silkespapper igen för att jämna ut den hydrofoba beläggningen.
- Beredning av flexibel plast stöd.
- Skär den flexibla plaststöd för att matcha storleken på den hydrofoba belagda glasplatta.
- Märk den hydrofoba sidan av den flexibla plastbärare genom att lätt skrapa på ytan med ett skarpt verktyg, såsom en skalpell.
OBS: När gelen - vilket är helt transparent - torkarKommer repor hjälpa urskilja vilka flexibelt plaststöd sidan innehåller gelen.
OBS: Den flexibla plaststöd har en hydrofob och en hydrofil sida. När deponeras, följer polyakrylamid permanent till den hydrofila sidan av plaststöd som underlättar enkel efterföljande hantering hydrogel.
- Gel Preparation (t.ex. volymer ges för 5 ml gel prekursorlösningar).
OBS: 5 ml skulle vara tillräcklig för att producera ~ 40 geler när gelén initiala tjockleken är 0,5 mm. Fler geler kan produceras om gelen tjockleken reduceras.- Placera 4972,5 il polyakrylamid prekursorlösning av önskade slutliga koncentrationen (tabell 1) i en 50 ml koniska rör. Placera i en avgasningskammare under 30 min med locket öppnas.
OBS: syre fungerar som en fri radikalfälla och när den är närvarande, inhiberar det polymerisation. - Lägg 25 pl av 10% vikt / volym ammoniumpersulfat (se punkt 1.3) för att uppnå en slutligammoniumpersulfat koncentration av 0,05%.
- Lägg 2,5 | il N, N, N ', N'-tetrametyletylendiamin (TEMED, M r 116,24 g / mol) till den avgasade gellösningen för att uppnå en slutlig TEMED koncentration av 0,5%.
OBS: Affär TEMED i en brandfarlig skåp vid RT. Handtag i en kemisk dragskåp när bär lämplig personlig skyddsutrustning. Förvara väl tillsluten under inert gas, eftersom det är mycket luft och fuktkänsliga. - Blanda lösningen försiktigt genom att pipettera upp och ned 3-5 gånger. Inte virvel för att undvika syrediffusion in i gelén prekursorlösningen.
- Pipet gellösningen på den hydrofila sidan av det flexibla plastbärare och sandwich med hydrofob-belagd glasskiva. Separera de två glider med silikon distanser av önskad tjocklek (t.ex. 0,5 mm). Lämna en liten mängd (~ 100 | al) av polymer prekursorlösning i 50 ml koniska rör som ska användas som en indikator på gelning.
NOTERA:Varje distansorgan kan användas. Exempelvis kan en enda remsa av Parafilm ger en slutlig svälld gel tjocklek av 100-120 um. - Lägg en annan glasskiva ovanpå den flexibla plaststödet / gelsandwich att fastställa en jämn hydrogel ytan vid polymerisation.
- Låt gelén polymerisera under 45 min, fastän kortare tid kan användas för geler av högre vikt-% om så önskas. Att försäkra sig om att gelen har polymeriserat, observera den återstående lösningen i 50 ml koniska rör; om den återstående lösningen har gelat, då är det troligt att gelning på glasplattan har inletts liksom. Observera dock att för tidig öppning av gjutformen förhindrar fullständig polymerisation.
- När gel bildas, dra av det flexibla plaststöd med kovalent bunden polyakrylamidgelen på topp, och ställ gel-side-up lufttorka.
OBS: Konvektion eller värmetorkning kan också användas för att accelerera detta steg. När torkat på den flexibla plaststöd, kan gelen vara butikend obestämd tid.- Markera alla kala fläckar av den flexibla plaststöd, där polyakrylamidgeler inte bildas på grund av bubblor. Mark medan gelen är fortfarande återfuktad eftersom detta kommer att smälta in i det flexibla plaststöd när gelen är torr.
- Placera 4972,5 il polyakrylamid prekursorlösning av önskade slutliga koncentrationen (tabell 1) i en 50 ml koniska rör. Placera i en avgasningskammare under 30 min med locket öppnas.
3. Multiwell Plate Assembly, Collagen Coating, och sterilisering
- Flerkällsplatta aggregat.
- När de väl torkat, skär PA-geler till önskade former.
- För en 96-brunnars platta, använd en tung hålslag med en diameter på ~ 6 mm. Använd en tung papperskniven för att klippa geler i kvadratiska eller rektangulära former. Alternativt använda sax.
- Förbered cirka 500 pl av PDMS per 96-brunnars platta i enlighet med tillverkarens instruktioner. För att limma gelerna till botten av en flerkällsplatta, placera en liten droppe (~ 5 | il) av polydimetylsiloxan (PDMS) vid centrum av den varje brunn. Använd pincett, placera en polyakrylamide gel i varje brunn, flexibelt plaststöd sidan nedåt. För att tillåta PDMS att bota, lämna den monterade plattan vid 37 ° C under ett minimum av 4 h.
- När de väl torkat, skär PA-geler till önskade former.
- Kollagen beläggning av polyakrylamidgeler.
- Med en överföringspipett, placera en liten mängd (7-8 l) av sulfo-SANPAH (se punkt 1.2.2) i varje brunn och snurra från sida till sida för att belägga gelen ytan jämnt. Arbeta snabbt eftersom sulfo-SANPAH inte är stabilt i vatten.
- Placera brunnsplatta under en hög intensitet UV-lampa (intensitet = 37 mW, λ = 302-365 nm) under 5 min. Skölj geler med PBS för att avlägsna överskott sulfo-SANPAH.
- Pipettera 50 | il av 0,2 mg / ml kollagen typ I-lösning (se punkt 1.4) i varje brunn. Låt plattan täckt vid rt under minst 2 h eller O / N vid 4 ° C.
OBS: För att påskynda processen av kollagen beläggning, kan en överföring pipett användas för att lägga kollagenlösningen. Normalt 1 - bör 2 droppar av lösningen vara tillräckligt för att slutföraly täcka gelen ytan. - Lämna brunnar vid RT i minst 2 timmar för att tillåta kollagen bindning.
- Skölj med PBS för att avlägsna överskott av kollagenlösning och sterilisera i UV (λ = 200 nm) i en vävnadsodling huva för 2 h.
- Blöt gelerna i komplett medium (Se avsnitt 4.1 för medel sammansättning) O / N för att återfukta och jämvikt. Används för cell sådd omedelbart eller förvara i kylen i upp till 2 dagar.
4. Cell Seedning på PA Stelhet Assay
Anmärkning Även typisk för vanliga däggdjurscellinjer, det protokoll som beskrivs i detta avsnitt används särskilt med bröstcancer MDA-MB-231-cellinjen (se figurerna 4 och 5).
- Samla cellerna från vävnadsodlingskolv genom exponering för 5% trypsin / EDTA under 5 minuter vid 37 ° C. Använd ~ 80 pl trypsin / EDTA per varje cm2 av odlingskolv område; till exempel använda 2 ml trypsin / EDTA fora T25 cellodlingskolv. Återsuspendera uppsamlade cellerna i komplett medium supplementerat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin vid en önskad slutlig cellkoncentration. Med beaktande av cellfördubblingstiden liksom den tid cellerna kommer att ympas på analys, välja en lämplig sub-sammanflytande cellkoncentration. Säkerställ att tillsatt mediet är tillräckligt för att fullständigt dränka hydrogelerna.
OBS: Eftersom hydrogeler har förekvilibrerats i media (se steg 3.2.6) 100 l volym bör räcka. Typiska medelstora volymer som används för flerbrunnsplattor bör räcka eftersom gelerna har förekvilibrerats i media i föregående steg.
OBS: Analysen skulle vara lämpligt för någon infästning beroende celltypen.- Räkna antalet celler i ett inverterat mikroskop med hjälp av en hemacytometer. Belastning 10 pl cellsuspension i varje hemacytometer-port och i genomsnitt cellräkning från minst åtta kvadranter. För att få denslutlig cellkoncentration, multiplicera celltalet med 10 4.
OBS: Bästa resultat celltals erhålls när antalet celler i varje hemacytometer kvadrant är 20-50.
- Räkna antalet celler i ett inverterat mikroskop med hjälp av en hemacytometer. Belastning 10 pl cellsuspension i varje hemacytometer-port och i genomsnitt cellräkning från minst åtta kvadranter. För att få denslutlig cellkoncentration, multiplicera celltalet med 10 4.
- Kultur cellerna har laddats in i PA-styvhets analysen i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Ändra media varje 2 - 3 dygn. Samla cellerna när det behövs genom exponering för 5% trypsin / EDTA vid 37 ° C under 5 min. Använd ~ 80 pl trypsin / EDTA per cm2 vävnadsodlingskolv. Under alla cellmanipuleringssteg, vara särskilt försiktig att inte störa hydrogel ytan: aspirera eller pipett medium genom något tippa flerkällsplatta sidled och röra pipettspetsen mot sidovägg varje brunn, i motsats till att röra hydrogel.
OBS: Med undantag för att ta särskild vård inte skada hydrogel ytan under standardvävnadsodling hantering, sås på styv analysen kan manipuleras på samma sätt som om de såddes på cellernatill en vanlig flerkällsplatta.
5. Imaging Celler sås på PA Stelhet Assay
- Bildceller direkt på PA styvhet analysen.
OBS: Alla mikroskop - inverterad, fluorescerande, eller confocal, kan användas för cell imaging.
OBS: Den flexibla plaststöd som används för att konstruera den styvhets analysen är helt transparent och inte autofluoresce eller stör cell imaging. Men även om det flexibla plaststödet i sig är transparent, bildhanteringsfunktioner kommer att begränsas av arbetsavståndet av målet. Den flexibla plaststöd har en tjocklek på 0,23 mm och en typisk arbetsavstånd av en 10X mål är ~ 4 mm, kraftigt minskar för större förstoring.- För levande cell imaging, läge PA stelhet analys i mikroskop hållare och image. Håll avbildning sessioner i 2 tim, eller använd ett mikroskop utrustat med en miljökammare för längre avbildningstider.
- När levande cell imaging är inte målet, fixa celler i 4% formaldehydlösning kompletterad med 0,1% diskmedel. Blöt celler i fixativ vid RT under minst 2 h. Skölj med PBS två gånger. Kasta fixativ avfall i en utsedd avfallsbehållare.
OBS: Celler kan avbildas omedelbart eller förvaras nedsänkt i PBS vid 4 ° C i upp till 2 veckor. VARNING: Formaldehyd är giftigt vid inandning och kontakt. Handtag med handskar i dragskåp.
OBS: Cell fixering protokollet måste väljas utifrån de efterföljande cellfärgnings och hanteringsprotokoll, eftersom vissa fixativ skada vissa cellproteiner. - För fluorescerande avbildning, fläck fasta celler med önskad cell fläcken direkt i flerkällsplatta. Bild omedelbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polyakrylamid (PA) hydrogeler används allmänt för att testa styvhetsberoende cellsvar. 17,24 Genom att blanda olika koncentrationer av akrylamid (A) och bis-akrylamid (B) en kan göra PA-geler som spänner styvhetsintervall för de flesta mjuka vävnader i kroppen - 0,3 -.. 300 kPa Youngs modul 1 är emellertid omständlig framställning av polyakrylamidgeler och tidskrävande, ofta begränsar deras användbarhet i "high-throughput" tillämpningar såsom exempelvis drogscreening 12 Här, en enkel och snabb metod för montering PA geler i flerbrunnsplattor eller någon annan önskvärd vävnadsodlingskärl presenteras (figur 1). Figur 2A visar elasticitetsmodulen som en funktion av flera A- och B-koncentrationer (även sammanfattade i tabell 1). Den modulerna för ytterligare A- och B-kombinationer rapporteras i litteraturen. 17,25,26 Gelén styvhet helt swollen geler mättes genom reologi (AR 2000ex rheometer, TA Instruments) med en 20 mm övre parallella geometri, oscillerande frekvenssvep testet 1 - 10 Hz, och 2% konstant töjning. Som väntat, visades det att både lagringsmodul, G ', och förlustmodul, G ", är oberoende av frekvens (Figur 2B). Det bekräftades även att torkning och sedan re-hydratisera gelema, påverkade inte deras Youngs modul (figur 2C). Youngs modul var relaterad till lagringsmodulen genom följande ekvation: 
där E är elasticitetsmodulen och v är Poissons tal som approximeras till 0,5 för PA geler. 27 Observera att de redovisade värdena är för hydrogeler framställda med TEMED. PA hydrogeler kan också framställas genom UV tvärbindning när exponeringstid och UV-intensitet är optimerade (
Vidare visades att celler seedade på hydrogeler av olika stiffness uppvisade annorlunda morfologi. För detta experiment var bröstcancer MDA-MB-231-celler ympades ovanpå de PA-geler för 24 - 72 timmar. Celler odlades i RPMI-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Celler såddes vid 1 x 10 5 celler / ml eller 1 x 10 4 celler / brunn under en 96-brunnars platta. Detta är en typisk cellsåddtäthet - 4-faldigt lägre än den sammanflytcelldensitet, där konfluens för en däggdjurscellinje nås vid ~ 1 x 10 5 celler / cm 2. Bilder togs på inverterat fluorescerande mikroskop och analyseras på ImageJ via Shape Descriptor och Area programvara plug-ins. Det observerades att när seedade på PA geler under 24 h, förblev bröstcancer MDA-MB-231-celler runda på de mjuka 0.5 och 1 kPa geler, men kunde sprida sig och förlänga den styva 100 kPa gel (Figur 4). Figur 4 showcas ocksåes att hydrogeler gjord ovanpå den flexibla plaststöd är öppet och möjliggör enkel visualisering och mikroskopi. Vidare har det flexibla plaststöd inte autofluoresce och därför inte stör avbildning av fluorescerande celler. Cell morfologi ytterligare kvantifieras i termer av totala cellspridningsområde och cellformfaktor - cirkel (Figur 5). Cellspridnings område mättes genom att skapa en mask för att spåra omkretsen hos varje cell. Cellform (cirkelform) beräknades sedan med följande förhållande: 
Cirkel mäts på en skala från 0 - 1, där 0,6-1 togs att utse rundade celler och 0-0,5 togs att utse långsträckta celler. Ungefär tre hundra celler från åtminstone tre oberoende experiment analyserades för varje data poin t. Statistiska skillnader beräknades baserat på enkelfaktoranalys av varians (ANOVA) där dataset ansågs signifikant olika när p <0,05.
Figur 1. Schematisk bild av polyakrylamidgel preparatet på flexibelt plaststöd. Figuren visar de olika steg som ingår i beredningen av PA geler på flexibel plaststöd. Efter gelén torkar helt, kan den skäras eller stansas i varje önskad form. En hel stans (~ 6 mm diameter) är mest praktiskt när du förbereder geler för en 96-brunnar, medan en tung pappersskäraren kan användas för fyrkantiga eller rektangulära former. Figuren belyser även kanterna på brunnarna, både med och utan en gel, för att visa att fullständig väl bottentäckning kan uppnås med denna metod. oad / 52.643 / 52643fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Stelhet i PA hydrogeler mätt med reologi. (A) Representativa Youngs modul för fem olika A- och B-koncentrationer (se Tabell 1 för förkortningar), (B) lagring och förlustmodulen som en funktion av frekvens, mätt med reologi; (C) geler uppvisar samma elasticitetsmodul initialt (Ursprunglig) och efter att de har torkat och åter hydrerad (Re-hydratiserad) oberoende av polymerprekursor koncentration. Alla geler för mätningarna reologi framställdes som plattor av 20 mm diameter och 1-1,5 mm höjd (vid fullständig svullnad).
/52643fig3.jpg "/>
Figur 3. Kollagen beläggning på PA geler. Kollagenbeläggning (grön) är effektivt distribueras och behöll på PA gel (röd) yta oberoende av hydrogel styvhet Youngs modul). Kollagen märkt med Cy5 användes för dessa data. Röd-fluorescerande pärlor var inbäddade i PA hydrogel till stöd visualisering. Tvärsnittsbilder togs på en konfokalmikroskop (skala bar = 100 nm). Bild anpassat från Zustiak et. al. 5 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Fas kontrakt (övre raden) och fluorescerande (nedersta raden) bilder av MDA-MB-231-celler seedade på PA geler under 24 h. MDA-MB-231-celler kvar runt på mjuka geler (Young 7; s modul av 0,5 och 1 kPa) men långsträckt på stela PA geler (Youngs modul av 100 kPa). Cellerna såddes på gelerna under 24 h, fixerades i etanol och färgades med akridinorange (AO - grön) för att visualisera cellcytoplasman och DAPI (blå) för att visualisera cellkärna; skala bar = 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Cellspridningsområdet och cirkularitet påverkas av styvheten hos det underliggande substratet. (A) MDA-MB-231 cellspridning området ökar signifikant på 100 kPa i motsats till de 0.5 kPa geler. (B) Cell cirkel minskar med ökad PA gel styvhet. Asterisker betecknar signifikanta skillnader; p <0,05.
Figur 6. Schematisk bild av en alternativ polyakrylamidgel preparatet på flexibelt plaststöd. Figuren visar de olika steg som ingår i beredningen av PA geler på flexibel plaststöd. Här det flexibla plaststöd initialt förklippt i plast "täck" av en önskad form och storlek. Denna teknik fungerar bäst för mjuka hydrogel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Akronym | Akrylamid% | Bis-akrylamid% | Akrylamid från 40% stamlösning (ml) | Bis-akrylamid från 2% förrådslösning (ml) | Vatten (ml) | G '± SD (kPa) | E ± SD (kPa) |
| PA1 | 5 | 0,025 | 625 | 62,5 | 4312,5 | 0,62 ± 0,19 | 1,85 ± 0,57 |
| PA2 | 5 | 0,1 | 625 | 250 | 4125 | 3,55 ± 0,12 | 10,64 ± 0,36 |
| PA3 | 8 | 0,1 | 1000 | 250 | 3750 | 9,71 ± 0,64 | 29,14 ± 1,93 |
| PA4 | 8 | 0,25 | 1000 | 625 | 3375 | 22,00 ± 2,10 | 66.01 ± 6,31 |
| PA5 | 12 | 0,25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37,42 ± 2,68 | 112,25 ± 8,03 |
Tabell 1. Koncentrationer av akrylamid (A) och tvärbindningsmedel-bis-akrylamid (B) och den resulterande PA-gelen styvhet. Styvhet, representeras här av G 'och E, mättes genom reologi. G 'är lagringsmodulen vid 1 Hz frekvens. Youngs modul, E, beräknades från Ekv. 1. Standardavvikelse (SD) beräknades utifrån tre oberoende försök med 3-5 prover mätt per experiment. De förkortningar i tabellen motsvarar de förkortningar som används i figur 2A.
| UV-intensitet = 15 mW / cm 2 | Exponeringstid = 300 sek | ||
| Tid (s) | E (kPa) ± SD | ISPÄNNING (mW / cm 2) | E (kPa) ± SD |
| 75 | 0,14 ± 0,03 | 15 | 28,05 ± 2,62 |
| 100 | 6,98 ± 2,34 | 26 | 21.13 ± 3,01 |
| 125 | 19,11 ± 2,29 | 37 | 20,01 ± 2,38 |
| 300 | 28,05 ± 2,62 | 66 | 19,35 ± 2,86 |
Tabell 2. UV polymerisation är ett alternativ och ett snabbare metod för PA gelpreparat när gelbildningstider förhållandena optimeras; PA3 (se tabell 1) gel avbildas. Tabellen sammanfattar den resulte Youngs modul när antingen exponeringstid (vänster två kolumner) eller UV-intensitet (höger två kolumner) varierar för samma lösning. Baserat på resultaten från tabellen framgår det att 300 sekunder exponeringstid och 15mW / cm 2 UV-intensitet ger högsta PA-gelen styvhet, vilket är jämförbart med styvheten hos den traditionellt polymeriserade gelén såsom rapporteras i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyakrylamidgeler, ursprungligen utvecklats för elektrofores, 28 nu rutinmässigt används som cellodling för att studera effekterna av substrat styvhet på cellmorfologi, motilitet, och kommunikation 3,24,29 bland andra egenskaper cell. Polyakrylamid möjliggör manipulering av substrat styvhet att omfatta styvhet alla mjuka vävnader i kroppen (0,3-300 kPa) 1 med en enkel ändring i polymerprekursor koncentration (Figur 2, Tabell 1, se även referenserna 17,25,26). Kopplat till det faktum att PA geler är relativt billig och enkel att förbereda, har de blivit oumbärliga plattformar i studiet av stelhet beroende cellmaterial interaktioner. Men även om enkla, är den nuvarande tekniken för att förbereda PA geler begränsade till små partier. Denna begränsningar härrör från naturen hos hydrogelen gelning, som är en fri-radikal-polymerisation katalyserad av ammoniumpersulfatoch TEMED. 30 Eftersom reaktionen är en fri radikal kedjepolymerisation, det kan hämmas av alla element som fungerar som en fri radikal fälla, såsom syre. Eftersom syrediffusion i polymerlösningen måste undvikas under polymerisering - vilket kan ta upp till 45 minuter för de mjukaste geler - helt enkelt pipettering PA geler i en öppen flerkällsplatta inte är genomförbar. Dessutom, för att användas som en tvådimensionell (2D) cellsubstrat bör ytan av PA-gelen vara platt. Båda de ovanstående krav diktera att att producera PA geler som 2D- cellsubstrat, bör PA gelföregångaren lösning placeras mellan två plana ytor under polymerisationen - att inhibera syrediffusion och platta gelytan. Dessutom har den övre ytan för att vara sådan att den lätt kan lossna från gelén exponerat ytan för cellvidhäftning. Detta uppnås typiskt genom hydrofob beläggning av en glasyta. Slutligen när placeras i the brunnar i en flerkällsplatta bör PA geler täcka hela väl ytan och begränsas från att flyta. Komplett väl botten yttäckning är särskilt viktigt i applikationer där analyserna används för att bedöma cellerna är den typ som tar hänsyn till hela cellpopulationen i brunnen (t.ex. MTT). Om PA gelen inte tillräckligt täcker hela brunnens yta, måste försiktighet iakttas för att blockera celladhesion till den exponerade brunnens yta som celler lätt kan rulla av gel på glas eller plast. Om det behövs, BSA blockering genom att följa standardprotokoll eller med något av de hyllan BSA baserade cellvidhäftningsblockerings kit bör vara tillräcklig för att blockera cellbindning till botten av plattan väl. Till exempel, för att framställa en BSA-täckta ytan, 0,5 mg / ml lösning av BSA i PBS, pH 7,4 bör adsorberas på vävnadsodlingsskål under 20 min vid RT, sköljdes med PBS och användes omedelbart eller lagrades vid 4 ° C under upp till 2 veckor. BSA har visats blockera celladhesion of däggdjurscellkulturer på både hydrofila och hydrofoba polystyrenytor genom avsevärt minskar cellvidhäftningskrafter mätt med atomkraftsmikroskopi. 31 BSA har använts rutinmässigt för att blockera däggdjurs celladhesion samt skapa cell mönstrade ytor. 32,33
Tekniken som avbildas i den här artikeln, uppfyller alla ovanstående krav som möjliggör massproduktion av enhetliga PA geler av anpassad storlek och form. Tekniken är enklare och effektivare än den nuvarande standarden för sandwich PA gelföregångaren lösning mellan två glastäck. Dessutom behöver den inte någon sofistikerad utrustning och därför är lätt anpassningsbar av någon forskningslaboratorium. Det är också mer kostnadseffektivt, eftersom det inte nödvändiggör användning av glasplattor eller glastäckglas, som inte bara dyrt, men också komma i begränsade storlekar. Tekniken är också snabbare för flera skäl. Först den inte innebär några förbehandlingsstegtypisk för glasytor, eftersom det flexibla plaststödet är utformad med två distinkta ytor - en hydrofil sida, som permanent fäster polyakrylamid och en hydrofob sida som lätt kan skalas av efter gelbildning. För det andra, eftersom plaststödet är flexibel, är det enklare och snabbare att dra av den bildade gelen: när tunna geler bildas mellan två glasskivor, skalar av toppen hydrofoba slide är svårt och ofta resulterar i brott som också äventyrar gelen. Slutligen, på grund av den flexibla plaststöd transparens, snabbare UV polymerisation kan användas i stället för standard TEMED baserade polymerisation som kan ta så mycket som 45 minuter (tabell 2). Data i tabell 2 visar att när polymerisationstid och UV-ljusintensiteten är optimerade liknande styvhet kan uppnås både med TEMED och UV polymerisationsmetoder.
Hydrogelerna förbereds på flexibel plastic stöd som avbildas på figur 1. Det rekommenderas att utföra gelningen i en avgasningskammare för att undvika ofullständig polymerisation av gelén kanterna (dvs kanteffekter) på grund av syre diffusion mellan de två ytorna som sandwich polymerlösningen. Målet är att skapa en stor hydrogelfilm ovanpå den böjliga plaststöd och därmed, skulle glasplatta av vilken storlek som helst vara lämplig, men det kommer att diktera storlek polyakrylamid film som kan uppnås. Glaset kan beläggas med någon hydrofob beläggning eller alternativt kan den hydrofoba sidan av den flexibla plaststödet användas istället. När väl ett PA-gel film bildas, torkas det, skuren i önskade former, och sedan åter hydratiseras före användning. När de är torra, kan gelerna lagras på obestämd tid. Det bekräftades av reologi, att PA gelen styvhet är oförändrad vid rehydratisering även när gelerna lagras i torrt tillstånd i flera månader (Figur 2C). Men för mycket soft geler (≤ 1 kPa i Youngs modul) torkning och återhydratisering förvärra yta veckbildnings och sprickbildning. Detta beteende är vanligt för mjuka geler som genomgår de-hydrering och därefter åter hydrering samtidigt som geometriskt begränsas. 34,35 Inte alla geler veck eller spricka, vilket är det möjligt att visuellt undersöka hydrogeler före användning och endast använda proverna att visa en slät yta. För att helt undvika veck bildning och sprickbildning, en alternativ metod för att förbereda mjuka hydrogeler avbildas på figur 6. Här är det flexibla plaststöd färdigskurna i önskad form och PA gel bildas ovanpå, alltså, gelerna inte behöver vara de-hydratiserade, men kan användas som framställes. En extra fördel med denna alternativa strategi är att ~ 2,5 fler geler kan produceras från samma volym hydrogel prekursorlösning (uppskattningen bygger på att förbereda geler för en standard 96-brunnar som beskrivs i protokollet avsnitt). En försiktig närförbereda hydrogeler på detta sätt är att ta hand för att undvika syre infiltration, särskilt för geler av mindre storlek (t.ex. för att geler användas i ett 96-brunnar). Även när gelföregångaren lösningen fullständigt avgasas, dvs syrefri, syre kommer att diffundera mellan de två ytorna som sandwich PA-lösning. Således, i syfte att undvika kanteffekter eller ofullständig gelbildning längs kanterna, är det bäst att låta polymerisationen ske i frånvaro av syre. Enligt vår erfarenhet fungerar en vakuumkammare väl, även om en inert gasmiljö skulle kunna användas med samma framgång.
En sista försiktighet vid beredning PA hydrogeler som cellsubstrat för att testa styvhetsberoende cellsvar, är att tjockleken på den resulte hydrogel är viktigt: för mycket tunna geler, cellerna kan känna av underliggande substratet 36 Använda teori och experiment,. Lin et al. visade att det djup där celler kan feel det underliggande substratet är beroende av den tvärgående dimensionen av cellen. 29 Eftersom aktuell forskning är motsägelsefull, identifiera den minsta föreskrivna tjocklek för att förhindra cellerna från att avkänna "dolda" substrat att vara från flera mikrometer 36 till så mycket som 60 mikron, 37 minst gel tjocklek på 100 nm bör eftersträvas.
Vid montering PA geler till en flerkällsplatta, är en liten droppe av PDMS som används för att fästa gelén till botten av brunnen. PDMS valdes eftersom det fungerar som permanent lim på härdning, det är helt öppet och inte störa efterföljande mikroskopi experiment, det är helt icke-cytotoxiska, och det härdar på ca 4-8 timmar lämnar tillräckligt med tid för plattmontering. Säker fastsättning hydrogelerna till botten av brunnen hjälpmedel i hanteringscell: till exempel, kan kraftig tvättning rubba hydrogeler om inte ordentligt fastsatt. Om frekvent förändring i cell medier är inte ett bekymmer, då gelerna kunde temporärt fäst vid brunnens yta av en liten droppe av en icke-cytotoxisk och högviskös vätska såsom glycerin.
De sista stegen före cellsådd involverar ECM beläggning av gelén och därefter sterilisering. Här kollagen typ I beläggningen avbildas (Figur 3) trots att samma teknik kan tillämpas för andra ECM-protein. Den bi-funktionella tvärbindare sulfo-SANPAH används för att uppnå en jämn monolager päls. Tidigare forskning har visat att sådan kovalent fäst ger en mer likformig beläggning än enkel proteinadsorption och möjliggör även för en 12-faldig avstämning av mängden protein fäst genom att bara använda en proteinlösning med varierande koncentration. 6 slutligen den sammansatta flerkälls gelplattan steriliseras under UV i vävnadsodling huva för upp till 2 tim. UV sterilisering möjliggör analysen att monteras på en laboratoriebänk utanför huven, vilketgör processen logistiskt enklare och övergripande snabbare.
Figurerna 4 och 5 visar några representativa resultat från MDA-MB-231 bröstcancerceller odlade på flexibla plaststöd lösa PA geler med varierande styvhet. MDA-MB-231-celler valdes för att demonstrera metoden verktyget eftersom de har visat sig reagera på det underliggande substratet styvhet genom mätbara förändringar i deras morfologi. 5,12 Som väntat cellerna var mer långsträckt och hade en större spridningsareal på de styva 100 kPa PA geler jämfört med de mjuka 0.5 och en kPa PA geler (figur 4 och 5). Den nedersta raden på figur 4 visar också användningen av två fluorescerande färger som färgas i cellkärnan och cellens cytoplasma, visa upp det faktum att det flexibla plaststödet inte stör fluorescerande mikroskop avbildning.
Sammanfattningsvis, för att en enkel metod framställa polyakrylamid hydrogeler i enflerkällsplatta formatet presenteras. Tekniken är snabbare, effektivare och billigare än nuvarande metoder för framställning av PA geler som ska användas som cellsubstrat samt möjliggör framställning av geler av anpassade storlekar inte tillgängliga på annat sätt. Eftersom det inte kräver någon specialutrustning, kan metoden vara lätt antas av alla forskningslaboratorium och skulle vara särskilt användbart i forskning inriktad på att förstå styvhetsberoende cellsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K.
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D.
- Lin, Y. C., et al.
- Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J.
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C.
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
