Introduction
רוב הרקמות בגוף הן חומרי viscoelastic רכים עם מודול יאנג הנע בין 0.1 kPa למוח עד 100 kPa לסחוס רך, עדיין, רובם במחקר בתאים במבחנה מתבצע על קלקר תרבית רקמה (TCP) שבו יש מודול של ~ 1-GPA . 1 התאמה נוקשות זו מאוד משפיעה על הדרך בה תאים מגיבים לסביבתם. גוף הולך וגדל של מחקר הוא בכך מסור להבהרת ההשפעה של מצע נוקשות על גורלם של סוגי תאים שונים, 2,3 כולל תאי גזע. 4 כתוצאה מכך, הידרוג מרובה פותחו כדי לסייע בהבנה של תא נוקשות תלויה הביולוגיה כולל polyacrylamide (PA), פוליאתילן גליקול 5-7 (PEG), 8,9 polydimethylsiloxane (PDMS), 10 ואלגינט. 11 בעוד ההוכחה לכך שיש מצע נוקשות השפעה מהותית על גורל תא גדלה, רוב המחקרים שנערכו ב בקנה מידה קטנה עם מספר קטן של samples. מחקרים שיטתיים, רב-ממדיים על ההשפעה של מצע נוקשות למערך של סוגי תאים או תנאים סביבתיים הם נדירים. 12
מספר טכנולוגיות הידרוג'ל תפוקה גבוהה מבטיחות פותחו, כולל microarrays מבוסס PEG, 13 מכשירים microfluidic לייצור microbeads agarose הידרוג'ל, 14 או מיקרו וננו-מוטות שבו קשיחות היא מווסת על ידי הקוטר והגובה של microrods. 15 עם זאת , הטכנולוגיות להכנת מצעים כאלה הם מתוחכמים וזמינים למספר מוגבל של מעבדות. מחקרים רבים מעורבים תגובות תא נוקשות מווסתת מנצל polyacrylamide ג'לי (PA) שהם לא רק זולים ופשוטים ליישום, אלא גם להציג מגוון רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של מודול יאנג, כלומר 0.3 -. 300 kPa 16-22 עם זאת, קיימים שיטות לפברק הרשות הפלסטינית ג 'לים תרבית תאים הם עבודה אינטנסיבית וכתוצאה מכך הכנהared בקבוצות קטנות. חלק מהקשיים הכרוכים בהכנה של ג'לי הרשות הפלסטינית כמו מצעי תאי גזע מהדרישה שג'לים צריך להיות מוכן: 1) בהעדר החמצן כדי לאפשר פילמור מלא, 2) עם משטח שטוח וחלק להתיר תא אחיד התקשרות והפצה, ו 3) באופן קבוע המודבק בתחתית של צלחת תרבית תאים כדי למנוע צף.
כמה קבוצות ניסו לייצר ג'לי רשות לתרבית תאים בקבוצות גדולות. Semler et al. גיליונות עבים מוכנים של ג'לי הרשות הפלסטינית שהיו אז "לחתוך" עם ניקוב חורים והניחו לתוך 96-גם צלחות. 23 עם זאת, שיטה זו מוגבלת לג'לים נוקשה, כלומר,> 1 kPa במודול יאנג, כי רך יותר ג 'הם "דביק", קשה לחתוך, ונפגע בקלות. MIH et al. פיתח טכניקה מתוחכמת יותר המאפשרת לג'לים להיות polymerized ישירות בצלחת multiwell זכוכית תחתונה.
מאמר זה מתאר דרך פשוטה וזולה כדי להרכיב ג'לי הרשות הפלסטינית בצלחת multiwell שאפשר לאמץ בקלות על ידי כל מעבדה. כאן, תמיכת פלסטיק גמישה מנוצלת, שבו יש שני צדדים - אחד הידרופובי, שהוא דוחה לג'לי הרשות הפלסטינית, ואחד הידרופילי, שנקשר קוולנטית ג'ל הרשות הפלסטינית על תצהיר. ברגע גיליונות ג'ל הרשות הפלסטינית מופקדים וקבוע מודבקים תמיכת פלסטיק הגמישה, זה מאפשר טיפול בג'לים של כל עובי או נוקשות וחיתוכם לכל צורה רצויה. appr זהאוח לא רק מייצר מותאם אישית 'coverslips' הפלסטיק בגדלים לא אחר זמין מסחרי, אבל גם מונע את הצורך לטיפול מקדים משטחי זכוכית, או coverslips זכוכית או בארות של צלחות multiwell זכוכית תחתונה יקרות, עם פתרון הרשות הפלסטינית מחייב, שהוא מייגע וצעד זמן רב. לבסוף, ניתן להכין גיליונות ג'לי הרשות הפלסטינית אחידים בקבוצות גדולות ומאוחסנים דה-hydrated במשך כמה חודשים.
לסיכום, assay שהוצג כאן הוא שיפור פני שיטות קיימות במספר היבטים. ראשית, התהליך של הרכבה צלחת multiwell הוא יעיל, ואת העלות הכוללת של חומרים הדרושים היא נמוכה. שנית, הידרוג מיוצר בקבוצות גדולות בסרט ג'ל הומוגנית אחת. לבסוף, רק חומרים שהם זמינים מסחריים נדרשים. השירות של assay מודגם על ידי לחקור את ההשפעה של מצע נוקשות על מורפולוגיה של תאים ומתפשטים באזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של הפתרונות וAliquots קשורים-Hydrogel
- הכנת הפתרון מבשר ג'ל polyacrylamide.
- הכן פתרון מבשר ג'ל polyacrylamide על ידי ערבוב acrylamide (א) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), bisacrylamide crosslinker (ב) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), ודה מים מיוננים באחוזי הנפח שצוינו בטבלה 1.
הערה: ניתן להכין פתרונות אלה בקבוצות גדולות ומאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס עד למספר חודשים.- זהירות: Acrylamide הוא רעיל על שאיפה או בליעה, במיוחד, כאשר בצורת אבקה: כך, רצוי להשתמש 40% w / v פתרון לצמצום סיכוני רעילות. לטפל רק בעת לבישת ביגוד מגן, כגון כפפות, משקפי מגן, וחלוק מעבדה. חנות במכל אור-עמיד, סגור היטב במקרר (<23 ° C, מאוורר היטב באזור).
- זהירות: Bis-acrylamide הוא רעיל על שאיפה או בליעה, במיוחד,כאשר בצורת אבקה: כך, רצוי להשתמש 2% w / v פתרון לצמצום סיכוני רעילות. לטפל רק בעת לבישת ביגוד מגן, כגון כפפות, משקפי מגן, וחלוק מעבדה. חנות במכל אור-עמיד, סגור היטב במקרר (4 מעלות צלזיוס האזור <, מאוורר היטב).
- הכן פתרון מבשר ג'ל polyacrylamide על ידי ערבוב acrylamide (א) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), bisacrylamide crosslinker (ב) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), ודה מים מיוננים באחוזי הנפח שצוינו בטבלה 1.
- הכנה ושימוש של N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, M r 492.40 g / mol) aliquots. זהירות: Sulfo-SANPAH גורמת לגירוי חמור בעיניים; להתמודד עם כפפות ועין נכונה או פנים הגנה. חנות ב -20 ° C עם קבלה ולפני aliquoting.
- כדי לאחסן sulfo-SANPAH: לפזר Sulfo-SANPAH בdimethylsulfoxane (DMSO) בשעה 50 מ"ג / מיליליטר. Aliquot פתרון המניות לתוך 50 צינורות צנטריפוגה מיקרו 20 μl לכל צינור. הקפאת Flash על קרח יבש או בחנקן נוזלי (צעד אופציונאלי, אך העדיף לשמור על יעילות מקסימלית crosslinker) ולאחסן ב -80 ° C.
הערה: aliquots can להיות מאוחסן במשך מספר חודשים. - כדי להשתמש בsulfo-SANPAH: להפשיר בקצרה aliquot ולדלל ב480 μl מים דה המיונן. השתמש באופן מיידי. Sulfo-SANPAH hydrolyzes במהירות במים: לכן לקחת בזהירות לבצע את כל השלבים לעיל במהירות.
- כדי לאחסן sulfo-SANPAH: לפזר Sulfo-SANPAH בdimethylsulfoxane (DMSO) בשעה 50 מ"ג / מיליליטר. Aliquot פתרון המניות לתוך 50 צינורות צנטריפוגה מיקרו 20 μl לכל צינור. הקפאת Flash על קרח יבש או בחנקן נוזלי (צעד אופציונאלי, אך העדיף לשמור על יעילות מקסימלית crosslinker) ולאחסן ב -80 ° C.
- הכנת persulfate אמוניום (M r 228.18 g / mol) aliquots.
הערה: persulfate אמוניום גורם העין, עור ומערכת נשימה. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת הטיפול. ידית אבקת persulfate אמוניום במנדף הכימי. אבקה יש לאחסן במקום יבש ומאוורר היטב. ברגע שaliquoted, התמיסה מהולה יכולה לשמש על ספסל העבודה.- לפזר persulfate אמוניום במים ללא יונים כדי להשיג ריכוז persulfate אמוניום סופי של 10% w / v. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. להפשיר מייד לפני השימוש.
- הכנה של קולגן Type I פתרון.
- הכן 0.2 מ"ג פתרון קולגן מיליליטר / על ידי דילול המניות כל כך-פתרון מלוחים 1x פוספט (PBS) של pH 7.4. אחסן בבקצרה קרח או להשתמש מייד עם דילול.
2. Hydrogel הכנה (עיין באיור 1)
- הכנת שקופיות זכוכית הידרופובי.
- מניחים כמה טיפות של פתרון הידרופובי על צלחת זכוכית ולהשתמש בנייר רקמה להתפשט על פני המשטח. בואו אוויר יבש ולנגב עם נייר טישו שוב אפילו את הציפוי הידרופובי.
הערה: פתרון הידרופובי חנות בקבינט דליק בRT. ללבוש ציוד מגן אישי בעת הטיפול. עובד באזור מאוורר היטב.
- מניחים כמה טיפות של פתרון הידרופובי על צלחת זכוכית ולהשתמש בנייר רקמה להתפשט על פני המשטח. בואו אוויר יבש ולנגב עם נייר טישו שוב אפילו את הציפוי הידרופובי.
- הכנת תמיכת פלסטיק גמישה.
- חותך את תמיכת פלסטיק הגמישה כדי להתאים את הגודל של צלחת הזכוכית מצופה הידרופובי.
- סמן את הצד הידרופובי של תמיכת פלסטיק הגמישה באורח קל מגרד את פני השטח עם כלי חד כמו סכין מנתחים.
הערה: לאחר ג'ל - שהוא שקוף לחלוטין - מתייבש, השריטות יעזרו להבחין באיזה צד תמיכת פלסטיק גמיש מכיל ג'ל.
הערה: יש תמיכת הפלסטיק הגמישה הידרופובי וצד הידרופילי. שהופקד ברגע, polyacrylamide באופן קבוע שומרת על הצד הידרופילי של תמיכת פלסטיק המאפשרת טיפול הידרוג'ל שלאחר מכן קל.
- ג'ל הכנה (ניתנים כרכי דוגמא לפתרונות מבשר ג'ל 5 מיליליטר).
הערה: 5 מיליליטר יהיה מספיק כדי לייצר ~ 40 ג 'לים, כאשר העובי הראשוני ג'ל הוא 0.5 מ"מ. ניתן לייצר יותר ג'לי אם עובי ג'ל מצטמצם.- הנח 4,972.5 μl של פתרון מבשר polyacrylamide של ריכוז סופי רצוי (טבלה 1) לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. מניחים בתא degassing למשך 30 דקות עם המכסה נפתח.
הערה: מעשי חמצן כמלכודת רדיקלים חופשית וכאשר קיימים, הוא מעכב פילמור. - הוסף 25 μl של 10% w / v persulfate אמוניום (עיין להצביע 1.3) כדי להשיג סופיריכוז persulfate אמוניום של 0.05%.
- להוסיף 2.5 μl של N, N, N ', tetramethylethylenediamine N'- (TEMED, M r 116.24 g / mol) לפתרון ג'ל degassed כדי להשיג ריכוז TEMED סופי של 0.5%.
הערה: חנות TEMED בקבינט דליק בRT. ידית במנדף כימי כאשר לובשים ציוד מגן אישי מתאים. שמור סגור היטב תחת גז אינרטי, כפי שהוא מאוד אוויר ולחות רגישה. - מערבבים את הפתרון בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-5 פעמים. לא מערבולת כדי למנוע דיפוזיה חמצן לתוך התמיסה המבשרת ג'ל.
- פיפטה פתרון ג'ל על הצד הידרופילי של תמיכה הגמישה מפלסטיק וכריך עם שקופיות זכוכית מצופים הידרופובי. להפריד בין שתי שקופיות עם מפרידי סיליקון בעובי רצוי (למשל, 0.5 מ"מ). להשאיר כמות קטנה (~ 100 μl) של פתרון מבשר פולימר בצינור חרוטי 50 מיליליטר לשימוש כמדד לgelation.
הערה:יכול לשמש כל spacer. לדוגמא, רצועה אחת של Parafilm נותנת עובי ג'ל נפוח סופי של 100-120 מיקרומטר. - מניחים צלחת זכוכית אחרת על גבי כריך התמיכה / ג'ל פלסטיק גמיש כדי לוודא משטח אפילו הידרוג'ל על פילמור.
- בואו ג'ל לפלמר במשך 45 דקות, למרות שפחות זמן יכול לשמש לג'לים של wt% גבוה יותר אם תרצה בכך. כדי לוודא שהג'ל polymerized, להתבונן הפתרון שנותר בצינור חרוטי 50 מיליליטר; אם הפתרון שנותר יש gelled, אז סביר להניח שgelation על צלחת הזכוכית כבר ביוזמת גם כן. עם זאת, שימו לב כי פתיחה מוקדמת של העובש תמנע פילמור מלא.
- ברגע שנוצר קריש, לקלף את תמיכת פלסטיק הגמישה עם ג'ל polyacrylamide המצורף קוולנטית על גבי, ולהגדיר ג'ל-עין לייבוש באוויר.
הערה: גם הסעה או ייבוש בחום ניתן להשתמש כדי להאיץ את הצעד הזה. ברגע שהתייבש על תמיכת פלסטיק הגמישה, ג'ל יכול להיות חנותד ללא הגבלת זמן.- לסמן כל כתמים חשופים של תמיכת פלסטיק הגמישה, שבו ג'ל polyacrylamide לא להיווצר עקב בועות. מארק ואילו הג'ל עדיין התייבשות כמו זה יהיה להתמזג עם תמיכת פלסטיק הגמישה פעם ג'ל הוא יבש.
- הנח 4,972.5 μl של פתרון מבשר polyacrylamide של ריכוז סופי רצוי (טבלה 1) לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. מניחים בתא degassing למשך 30 דקות עם המכסה נפתח.
3. אסיפת multiwell פלייט, קולגן ציפוי, ועיקור
- הרכבה צלחת multiwell.
- ברגע מיובש, לחתוך ג'לי הרשות הפלסטינית לצורות הרצויות.
- לצלחת 96-היטב, להשתמש בניקוב חורים כבד בקוטר של 6 מ"מ ~. השתמש בחותך נייר כבד לחתוך ג'ל לצורות מרובעות או מלבניות. לחלופין, להשתמש במספריים.
- הכן כ -500 μl של PDMS לכל צלחת 96-גם על פי הוראות היצרן. להדביק את ג'לי לתחתית צלחת multiwell, מקום טיפה קטנה (~ μl 5) של polydimethylsiloxane (PDMS) במרכזה של כל טוב. בעזרת מלקחיים, למקם polyacrylamid אחדג'ל דואר בצד כל הטוב, גמיש מפלסטיק תמיכה במורד. כדי לאפשר PDMS לרפא, לעזוב את הצלחת התאסף על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 4 שעות.
- ברגע מיובש, לחתוך ג'לי הרשות הפלסטינית לצורות הרצויות.
- ציפוי קולגן של ג'לים polyacrylamide.
- עם טפטפת העברה, הנח כמות קטנה (7-8 μl) של sulfo-SANPAH (עיין להצביע 1.2.2) בכל טוב ומערבולת מצד לצד למעייל משטח ג'ל באופן שווה. לעבוד מייד מאז sulfo-SANPAH אינו יציב במים.
- מניחים את הצלחת גם תחת מנורת UV בעוצמה גבוהה (עוצמת = 37 mW, λ = 302-365 ננומטר) למשך 5 דקות. יש לשטוף את ג'לי עם PBS להסיר sulfo-SANPAH העודף.
- פיפטה 50 μl של 0.2 מ"ג / מיליליטר קולגן Type I פתרון (ראה להצביע 1.4) גם לכל אחד. השאר את הצלחת מכוסות בRT לפחות 2 שעות או O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: כדי לזרז את התהליך של ציפוי קולגן, פיפטה העברה יכולה לשמש כדי להוסיף את פתרון קולגן. בדרך כלל, 1-2 טיפות של תמיסה צריכה להיות מספיק כדי להשליםly לכסות את פני השטח ג'ל. - השאר את הצלחת גם בRT לפחות 2 שעות כדי לאפשר מליטה קולגן.
- לשטוף עם PBS להסיר פתרון קולגן עודף ולעקר תחת UV (λ = 200 ננומטר) בשכונת תרביות רקמה עבור שעה 2.
- משרים את ג'לי במדיום מלא (ראה סעיף 4.1 למדיום הרכב) O / N מימה ולאזן. השתמש לתא זריעה באופן מיידי או בחנות במקרר לתקופה של עד 2 ימים.
4. זריעת תאים ברשות הפלסטינית הנוקשות Assay
הערה: למרות שאופייני לשורות תאים יונקים משותפות, הפרוטוקול המפורטים בסעיף זה באופן ספציפי בשימוש עם סרטן שד שורת תאי מד"א MB-231 (ראה איורים 4 ו -5).
- איסוף תאים מבקבוק תרבות רקמה על ידי חשיפה ל5% טריפסין / EDTA במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. השתמש ~ 80 μl של טריפסין / EDTA לכל 2 סנטימטר של שטח בקבוק תרבות; לדוגמא, השתמש 2 מיליליטר של טריפסין / EDTA fora T25 בקבוק תרבית תאים. מחדש להשעות תאים שנאספו במדיום מלא בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ופניצילין 1% / סטרפטומיצין בריכוז תא סופי רצוי. אם ניקח בחשבון זמן הכפלת תאים, כמו גם את משך זמן התאים יהיו זרע על assay, לבחור ריכוז תא תת-מחוברות מתאימה. ודא שהוסיף בינוני מספיק כדי להטביע את הידרוג לחלוטין.
הערה: מאחר הידרוג כבר מראש equilibrated בתקשורת (ראה צעד 3.2.6) 100 μl נפח צריך להיות מספיק. כרכים בינוניים טיפוסיים המשמשים לצלחות multiwell צריכים להיות מספיק מאז ג 'כבר מראש equilibrated בתקשורת בשלב הקודם.
הערה: assay יהיה מתאים לכל סוג תא מצורף תלויה.- ספירת תאים מספר תחת מיקרוסקופ הפוכה באמצעות hemacytometer. טען 10 μl של תא השעיה לכל יציאת hemacytometer ומחשבים את ממוצע ספירת תאים מלפחות 8 רביעים. כדי לקבל אתריכוז תא סופי, להכפיל את ספירת תאים על ידי 10 4.
הערה: תוצאות ספירת תאים הטובות ביותר מתקבלות כאשר מספר תאים בכל רבע hemacytometer הוא 20-50.
- ספירת תאים מספר תחת מיקרוסקופ הפוכה באמצעות hemacytometer. טען 10 μl של תא השעיה לכל יציאת hemacytometer ומחשבים את ממוצע ספירת תאים מלפחות 8 רביעים. כדי לקבל אתריכוז תא סופי, להכפיל את ספירת תאים על ידי 10 4.
- תרבות התאים על assay נוקשות הרשות הפלסטינית בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים. איסוף תאים בעת צורך על ידי חשיפה ל5% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השתמש ~ 80 μl של טריפסין / EDTA לסנטימטר 2 של בקבוק בתרבית רקמה. במהלך כל שלבי המניפולציה התא, לקבל טיפול מיוחד שלא לשבש את פני השטח הידרוג'ל: לשאוב או בינוני פיפטה על ידי מעט להטות את צלחת multiwell הצידה ונוגע בקצה פיפטה על הקיר הצדדי של כל אחד גם, בניגוד לנגיעה בהידרוג'ל.
הערה: פרט לטיפול מיוחד שלא לפגוע במשטח הידרוג'ל במהלך טיפול בתרבית רקמה רגיל, התאים שנזרעו על assay הנוקשות ניתן להשפיע באותה הצורה כמו אם הם היו זורעים בלצלחת multiwell רגילה.
5. הדמיה של תאים שנזרעו על הרשות הפלסטינית הנוקשות Assay
- תאי תמונה ישירות על assay נוקשות הרשות הפלסטינית.
הערה: כל מיקרוסקופ - הפוך, או confocal ניאון, יכולה לשמש להדמית תא.
הערה: תמיכת הפלסטיק הגמישה המשמשת לבניית assay הנוקשות היא שקופה לחלוטין ואינה autofluoresce או להפריע להדמית תא. עם זאת, למרות שתמיכת פלסטיק הגמישה עצמו היא שקופה, יכולות הדמיה תהיה מוגבלות על ידי מרחק העבודה של המטרה. יש תמיכת הפלסטיק הגמישה בעובי של 0.23 מ"מ ומרחק עבודה טיפוסי של מטרת 10X הוא ~ 4 מ"מ, בחדות יורדת להגדלות גדולות יותר.- הדמיה תא חי, עמדת assay נוקשות הרשות הפלסטינית בבעל צלחת מיקרוסקופ ותמונה. שמור פגישות הדמיה תחת 2 שעות, או להשתמש במיקרוסקופ מצויד בתא סביבתי לפעמי הדמיה עוד.
- כאשר im תא החיההזדקנות היא לא המטרה, לתקן תאים 4% תמיסת פורמלדהיד בתוספת חומרי ניקוי 0.1%. משרים תאים במקבעים ב RT עבור מינימום של 2 שעות. לשטוף עם PBS פעמיים. השלך פסולת מקבע במכל פסולת מיועד.
ניתן הדמיה תאים באופן מיידי או מאוחסנים שקוע בPBS על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות: הערה. זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל על שאיפה ומגע. ידית עם כפפות במנדף הכימי.
הערה: פרוטוקול קיבוע תא צריך להיות נבחר על סמך פרוטוקולי מכתים תא וטיפול שלאחר מכן, משום שfixatives מסוים לפגוע כמה חלבוני תא. - להדמית ניאון, כתם קבוע תאים עם כתם תא רצוי ישירות בצלחת multiwell. תמונה באופן מיידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polyacrylamide הידרוג (PA) נמצא בשימוש נרחב כדי לבדוק את תגובות תא נוקשות תלויה. 17,24 על ידי ערבוב ריכוזים שונים של acrylamide () וbis-acrylamide (B) אחד יכול לעשות ג'לי הרשות הפלסטינית כי היקף מגוון הנוקשות של רוב הרקמות הרכות ב הגוף - 0.3 -.. 300 מודולוס של kPa הצעיר 1 עם זאת, הכנת ג'לים polyacrylamide היא מייגעת ביותר זמן, לעתים קרובות מגביל את השימושיות שלהם ביישומים "תפוקה גבוהה" כמו להקרנת דוגמא תרופת 12 הנה, שיטה פשוטה ומהירה ל הרכבת ג'לי הרשות הפלסטינית בצלחות רבות גם או כל כלי תרבית רקמה רצוי אחר מוצג (איור 1). איור 2 א תערוכות מודולוס של יאנג כפונקציה של מספר ריכוזי A ו- B (גם בטבלה 1). Moduli של שילובים וB נוספים שדווח בספרות. 17,25,26 נוקשות ג'ל של swolle מלאn ג'לי נמדד על ידי rheology (rheometer AR 2000ex, מכשירי ת"א) עם גיאומטריה 20 מ"מ העליון מקבילה, בדיקת סריקת תדרי oscillatory 1 - הרץ 10, ומתח מתמיד 2%. כצפוי, זה היה הראה כי שני מודול האחסון, G ', ומודול האובדן, G ", אינם תלויים בתדירות (איור 2). כמו כן, אישר כי ייבוש ולאחר מכן ג'לי-לחות מחדש, לא השפיע על מודול יאנג שלהם (איור 2 ג). מודול יאנג היה קשור למודול האחסון על ידי המשוואה הבאה: 
כאשר E הוא מודול יאנג וv הוא היחס של פואסון שמקורב לרמה של 0.5 לג'לי הרשות הפלסטינית. 27 שימו לב שהערכים המדווחים להידרוג מוכן עם TEMED. הידרוג הרשות הפלסטינית יכול להיות גם שהוכן על ידי crosslinking UV כאשר זמן חשיפה ועוצמת UV מותאם (
יתר על כן, הוא הוכיח כי תאים שנזרעו על הידרוג של stiffne שונהss הציג מורפולוגיה שונה. לצורך הניסוי הזה, סרטן שד תאי מד"א MB-231 היו זורעים על גבי ג'לים הרשות ל24-72 שעות. תאים בתרבית בינונית RPMI בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין 1% / סטרפטומיצין בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תאים היו זרע ב1 x 10 5 תאים / מיליליטר או 1 x 10 4 תאים / גם לצלחת 96-היטב. זוהי צפיפות זריעת תא טיפוסית - פי 4 נמוכים מצפיפות תאי confluency, שבו confluency לשורת תאי יונקים הוא הגיע ב ~ 1 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר. תמונות צולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי ההפוך ונותחו על ImageJ באמצעות מתאר הצורה ותוכנת פינת תוספות. היה נראה כי כאשר זורעים על ג'לי הרשות הפלסטינית למשך 24 שעות, סרטן שד תאי מד"א MB-231 נשארו עגול וב-0.5 1 ג 'לים kPa הרך, אבל היו מסוגל להתפשט ולהאריך על הג'ל kPa 100 הנוקשה (איור 4). איור 4 גם showcases העובדה שהידרוג עשה על גבי תמיכת פלסטיק הגמישה שקופה ומאפשרת להדמיה קלה ומיקרוסקופיה. יתר על כן, תמיכת הפלסטיק הגמישה לא autofluoresce ולכן אינו מפריעה להדמיה של תאים שכותרתו fluorescently. מורפולוגיה של תאים הייתה לכמת נוסף במונחים של תא הכולל הפצת אזור וגורם צורת תא - מעגלי (איור 5). אזור הפצת תא נמדד על ידי יצירת מסכה כדי לעקוב אחר ההיקף של כל תא. צורת תא (מעגלי) הייתה אז מחושבת ממערכת היחסים הבאות: 
המעגליות נמדדה בסולם של 1 - 0, שבו 0.6-1 נלקחו לייעד תאים מעוגלים ו0-0.5 נלקחו לייעד תאים מוארכים. כשלושה מאה תאים מלפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים נותחו עבור כל poin נתונים t. הבדלים סטטיסטיים חושבו בהתבסס על ניתוח יחיד גורם של שונות (ANOVA) שבו ערכות נתונים נחשבו שונות באופן משמעותי כאשר p <0.05.
איור 1. ייצוג סכמטי של הכנת ג'ל polyacrylamide על תמיכת פלסטיק גמישה. הדמות מייצגת מעורבים בהכנת ג'לי הרשות הפלסטינית על תמיכת פלסטיק גמישה בצעדים השונים. לאחר ג'ל מתייבש לחלוטין, ניתן לחתוך אותו או אגרופים לכל צורה רצויה. אגרוף כולו (~ 6 מ"מ קוטר) הוא נוח ביותר בעת הכנת ג'לים לצלחת 96-היטב, ואילו חותך נייר כבד יכול לשמש לצורות מרובעות או מלבניות. הדמות מדגישה גם את הקצוות של הבארות, שניהם עם ובלי ג'ל, על מנת להוכיח כי כיסוי גם תחתון מלא ניתן להשיג בשיטה זו. OAD / 52,643 52643fig1large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. נוקשות של הרשות הפלסטינית, כפי שנמדדו על ידי הידרוג rheology. () מודולוס של נציג הצעיר לחמישה ריכוזים & B שונים (ראה טבלת 1 לראשי תיבות); (ב) אחסון ומודולוס הפסד כפונקציה של תדר, כפי שנמדד על ידי rheology; ג'לי (C) להפגין את אותו מודול יאנג בתחילה (ראשוני) ואחרי שהם כבר מיובשים ומחדש התייבשות (Re-hydrated) עצמאי של ריכוז מבשר פולימר. כל ג'לים למדידות rheology נערך ללוחות של 20 מ"מ קוטר ו 1 - גובה מ"מ 1.5 (על נפיחות מלאה).
/52643fig3.jpg "/>
איור 3. ציפוי קולגן על ג'לי הרשות הפלסטינית. ציפוי קולגן (הירוקה) מופץ ביעילות ובשמר על ג'ל הרשות הפלסטינית (אדום) העצמאי של מודול של הידרוג'ל נוקשות צעירות פני השטח). קולגן שכותרתו עם Cy5 שימש לנתונים אלה. חרוזים אדומים-ניאון היו משובצים להידרוג'ל הרשות להדמית סיוע. תמונות חתך נלקחו על מיקרוסקופ confocal (בר = 100 מיקרומטר בקנה מידה). תמונה המותאמת מZustiak et. אל. 5 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. חוזה Phase (שורה העליונה) וניאון (בשורה תחתונה) תמונות של מד"א MB-231 תאים שנזרעו על ג'לי הרשות הפלסטינית למשך 24 שעות. מד"א MB-231 תאים נשארים עגול בג'לי רך (צעיר 7; s מודולוס של 0.5 ו 1 kPa) אבל להאריך על ג'לי רשות נוקשה (מודול יאנג של 100 kPa). תאי זרע על ג'לים למשך 24 שעות, קבוע באתנול ומוכתם בכתום acridine (AO - ירוק) כדי להמחיש את הציטופלסמה התא וDAPI (כחול) כדי לחזות גרעין תא; סרגל = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אזור איור 5. תא התפשטות ומעגלית מושפעים מהנוקשות של המצע הבסיסי. (א) שטח תא מד"א MB-231 הפצה גדל באופן משמעותי על 100 kPa בניגוד ל0.5 ג'לי kPa. (ב) מעגלי סלולארי פוחת עם עלייה ברשות הפלסטינית ג'ל נוקשות. כוכביות לייעד הבדלים משמעותיים; p <0.05.
איור 6. ייצוג סכמטי של הכנת ג'ל polyacrylamide חלופית על תמיכת פלסטיק גמישה. הדמות מייצגת מעורבים בהכנת ג'לי הרשות הפלסטינית על תמיכת פלסטיק גמישה בצעדים השונים. לחתוך מראש כאן תמיכת הפלסטיק הגמישה תחילה ל" coverslips "פלסטיק של צורה וגודל רצויה. טכניקה זו עובדת הכי טובה בשביל הידרוג רך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| ראשי תיבות | % Acrylamide | % Bis-acrylamide | Acrylamide מ 40% מניות פתרון (מיליליטר) | Bis-acrylamide מ 2% מניות פתרון (מיליליטר) | מים (מיליליטר) | SD ± 'G (kPa) | E ± SD (kPa) |
| PA1 | 5 | 0.025 | 625 | 62.5 | 4,312.5 | 0.62 ± 0.19 | 1.85 ± 0.57 |
| PA2 | 5 | 0.1 | 625 | 250 | 4125 | 3.55 ± 0.12 | 10.64 ± 0.36 |
| PA3 | 8 | 0.1 | 1,000 | 250 | 3750 | 9.71 ± 0.64 | 29.14 ± 1.93 |
| PA4 | 8 | 0.25 | 1,000 | 625 | 3375 | 22.00 ± 2.10 | 66.01 ± 6.31 |
| PA5 | 12 | 0.25 | 1,500 | 625 | 2,875 | 37.42 ± 2.68 | 112.25 ± 8.03 |
טבלת 1. ריכוזים של acrylamide () וcrosslinker bis-acrylamide (B) ונוקשות ג'ל הרשות הפלסטינית כתוצאה. נוקשות, מיוצגים כאן על ידי G "ו- E, נמדד על ידי rheology. G "הוא מודול האחסון בתדר Hz 1. מודול יאנג, E, חושב ממשוואה. 1. סטיית תקן (SD) חושבה על בסיס שלושה ניסויים בלתי תלויים עם 3-5 דגימות שנמדדו לכל ניסוי. ראשי התיבות בטבלה מתאימות לראשי התיבות המשמשות באיור 2 א.
| עצמת UV = 15 mW / 2 סנטימטר | זמן חשיפה = 300 שניות | ||
| זמן (ים) | E (kPa) ± SD | בדריכות (mW / 2 סנטימטר) | E (kPa) ± SD |
| 75 | 0.14 ± 0.03 | 15 | 28.05 ± 2.62 |
| 100 | 6.98 ± 2.34 | 26 | 21.13 ± 3.01 |
| 125 | 19.11 ± 2.29 | 37 | 20.01 ± 2.38 |
| 300 | 28.05 ± 2.62 | 66 | 19.35 ± 2.86 |
2. פילמור UV השולחן הוא אלטרנטיבה ושיטה מהירה יותר להכנת ג'ל הרשות הפלסטינית, כאשר תנאי gelation מותאמים; PA3 (ראה טבלה 1) ג'ל מתואר. השולחן מסכם מודולוס של יאנג כתוצאה, כאשר גם זמן חשיפה (משמאל שתי עמודות) או עוצמת UV (מימין שתי עמודות) היא מגוון לאותו הפתרון. בהתבסס על התוצאות מהשולחן, נראה כי זמן חשיפה של 300 שניות ו -15mW / 2 סנטימטר בעוצמה UV לתת את נוקשות ג'ל הרשות הפלסטינית הגבוהות ביותר, אשר ניתן להשוות את הנוקשות של ג'ל polymerized המסורתי כפי שדווחו בטבלה 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ג'ל polyacrylamide, שפותח במקור עבור אלקטרופורזה, 28 המשמשים כיום באופן שיגרתי כמו מצעי תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות של מצע נוקשות על מורפולוגיה של תאים, תנועתיות, ותקשורת 3,24,29 בין מאפייני תא אחרים. Polyacrylamide מאפשרת מניפולציה של מצע נוקשות להקיף את הנוקשות של כל הרקמות הרכות בגוף (.3-300 kPa) 1 עם שינוי פשוט בריכוז מבשר פולימר (איור 2, טבלת 1, ראה גם אזכור 17,25,26). מצמידים את העובדה שהרשות פלסטינית ג'לי הוא די זול ופשוט להכנה, הם הפכו פלטפורמות חיוניות בחקר אינטראקציות תא-חומר נוקשות תלויות. עם זאת, למרות שפשוט, הטכניקה הנוכחית להכנת ג'לי הרשות הפלסטינית מוגבלת לקבוצות קטנות. מגבלות זה נובעות מאופי gelation הידרוג'ל, אשר הוא פילמור רדיקלים חופשיים זרז ידי persulfate אמוניוםוTEMED. 30 מאז התגובה היא פילמור שרשרת של רדיקלים חופשי, יכול להיות מעוכב על ידי זה כל אלמנט המשמש כמלכודת רדיקלים חופשית, כגון חמצן. לכן, מאז דיפוזיה חמצן לתוך תמיסת הפולימר יש להימנע במהלך פילמור - אשר יכול להימשך עד 45 דקות לג'לי הרך ביותר - פשוט pipetting ג'לי הרשות לצלחת multiwell פתוח הוא לא ריאלי. כמו כן, כדי לשמש כמצע תא דו-ממדי (2D), את פני השטח של ג'ל הרשות הפלסטינית צריכים להיות שטוחים. שתי הדרישות הנ"ל להכתיב כי כדי לייצר ג'לי הרשות הפלסטינית כמו מצעי תא 2D, פתרון מבשר ג'ל הרשות הפלסטינית צריך להיות דחוקים בין שני משטחים שטוחים במהלך פילמור - לעכב דיפוזיה חמצן ולשטח את פני השטח ג'ל. בנוסף, המשטח העליון צריך להיות כזה שהוא יכול בקלות לקלף מן הג'ל חושף את פני השטח לקובץ מצורף תא. זו מושגת בדרך כלל על ידי ציפוי הידרופובי של משטח זכוכית. לבסוף, כשהוא מוצב לתוך הבארות דואר של צלחת multiwell, ג'לים הרשות הפלסטינית צריכה לכסות את כל פני השטח היטב ולהיות מוגבלות מצף. כיסוי פני השטח גם תחתון מלא הוא חשוב במיוחד ביישומים בהם מבחני המשמשים להערכת התאים מהסוג שלוקח בחשבון את כל אוכלוסיית התאים בהיטב (למשל, MTT). אם הג'ל הרשות הפלסטינית אינו מספק לכסות את כל פני השטח היטב, יש להקפיד לחסום הידבקות תא אל פני השטח גם נחשפו כתאים יכולים בקלות להתגלגל ג'ל על משטח הזכוכית או פלסטיק. במידת צורך, חסימת BSA הבאה פרוטוקולים סטנדרטיים או באמצעות מחוץ למדף ערכות חסימת הידבקות תא מבוסס BSA צריכה להיות מספיק כדי לחסום מצורף תא לתחתית הצלחת גם. לדוגמה, כדי להכין את פני השטח מכוסה BSA-, 0.5 מ"ג / מיליליטר פתרון של BSA ב PBS, pH 7.4 צריך להיספח על צלחת תרבית רקמה במשך 20 דקות ב RT, שטפו עם PBS ולהשתמש מייד או לאחסן 4 ° C ל עד 2 שבועות. BSA הוכח לחסום o הידבקות תאתרבויות f יונקים תא בשני משטחי הקלקר הידרופילי והידרופובי על ידי כוחות הידבקות התא מקטין מאוד, כפי שנמדדו על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי. 31 BSA נעשה שימוש באופן שגרתי כדי לחסום הידבקות תאים יונקים, כמו גם ליצור משטחים בדוגמת תא. 32,33
הטכניקה המתוארת במאמר זה, עונה על כל הדרישות לעיל מאפשרות ייצור ההמוני של ג'לי הרשות הפלסטינית אחיד בגודל מותאם אישית ובצורה. הטכניקה היא פשוטה ויעילה יותר מאשר התקן של הרבדה פתרון מבשר ג'ל הרשות הפלסטינית בין שני coverslips הזכוכית הנוכחי. יתר על כן, היא אינה דורשת כל ציוד מתוחכם ובכך היא בקלות לאימוץ על ידי כל מעבדת מחקר. זה גם יותר חסכוני כפי שהוא אינו מחייב שימוש בלוחות זכוכית או coverslips זכוכית, שאינם יקרים רק, אלא גם באים בגדלים מוגבלים. הטכניקה היא גם מהיר יותר מכמה סיבות. ראשית, הוא אינו כרוך בצעדים מקדיםאופייני למשטחי זכוכית מאז תמיכת פלסטיק הגמישה נועדה עם שני משטחים שונים - צד הידרופילי שקבעו מתחבר לpolyacrylamide וצד הידרופובי שניתן התקלף בקלות לאחר היווצרות קריש. שנית, משום שתמיכת הפלסטיק גמישה, קל יותר ומהיר יותר לקלף את הג'ל נוצר: כאשר דק ג'לי נוצרים בין שתי שקופיות זכוכית, קילוף השקופיות הידרופובי העליונים היא קשות ולעתים קרובות תוצאות שבירה שגם פוגעת בג'ל. לבסוף, בגלל שקיפות תמיכת פלסטיק הגמישה, פילמור UV מהיר יותר יכול להיות מועסק בניגוד לפילמור מבוסס TEMED הסטנדרטי שיכול לקחת כ 45 דקות (טבלה 2). הנתונים בטבלה 2 מראים כי קשיחות דומה כאשר זמן פילמור ועוצמת אור UV מותאמים יכולה להיות מושגת על ידי שתי שיטות פילמור TEMED וUV.
הידרוג ערוכים על pl גמישתמיכת astic כמתואר באיור 1. מומלץ לבצע את gelation בתא degassing כדי למנוע פילמור שלם של קצות ג'ל (כלומר, השפעות קצה) עקב דיפוזיה של חמצן בין שני המשטחים שכריך פתרון הפולימר. המטרה היא ליצור סרט הידרוג'ל גדול על גבי תמיכת פלסטיק הגמישה, וכך, צלחת זכוכית בכל גודל תהיה מתאימה, אבל זה יכתיב את הגודל של סרט polyacrylamide שניתן להשיג. הזכוכית יכולה להיות מצופה עם כל ציפוי הידרופובי או לחלופין, בצד הידרופובי של תמיכת פלסטיק הגמישה יכול לשמש במקום. ברגע שסרט ג'ל הרשות הפלסטינית נוצר, הוא מיובש, חתוך לצורות הרצויות, ולאחר מכן מחדש התייבשות לפני השימוש. כאשר יבש, יכול להיות מאוחסן בג'לי לזמן בלתי מוגבל. זה אושר על ידי rheology, שג'ל נוקשות הרשות הפלסטינית היא ללא שינוי על החזרת נוזלים גם כאשר ג'לי מאוחסנים במצב היבש במשך כמה חודשים (איור 2 ג). עם זאת, למאוד Sofג 't (≤ 1 kPa במודול יאנג) קימוט ייבוש מחדש לחות משטח להחמיר ולפצח היווצרות. התנהגות זו היא משותפת לג'לי רך שעובר דה-הידרציה ומחדש את לחות שלאחר מכן בעת היותו מוגבלים גיאומטרי. 34,35 לא כל קמט ג'לי או סדק, ובכך, אפשר לבחון מבחינה ויזואלית הידרוג לפני שימוש ולהשתמש רק הדגימות המציג משטח חלק. כדי להימנע מהיווצרות קמט לחלוטין ופיצוח, שיטה חלופית כדי להכין את הידרוג רך מתוארת באיור 6. הנה, תמיכת הפלסטיק הגמישה היא מראש לחתוך בצורה הרצויה וג'ל הרשות הפלסטינית נוצר על גבי, ובכך, ג'לים לא צריך להיות דה-התייבשות, אך יכול לשמש כהכין. יתרון נוסף של אסטרטגית חלופה זו הוא שניתן להפיק ~ 2.5 ג'לי יותר מאותו הנפח של תמיסה המבשרת הידרוג'ל (האומדן מבוסס על הכנת ג'לים לצלחת 96-היטב סטנדרטית כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול). זהירות אחד כשהכנת הידרוג באופן זה היא לטפל כדי למנוע חדירת חמצן, במיוחד לג'לים לגודל קטן יותר (למשל, ג'לים לשימוש בצלחת 96-היטב). גם כאשר הפתרון המבשר ג'ל degassed לחלוטין, כלומר, חמצן חופשי, חמצן יהיה לשדר בין שני המשטחים שכריך הפתרון של הרשות הפלסטינית. לפיכך, על מנת למנוע תופעות קצה או היווצרות קריש שלמה בשולי, עדיף לאפשר לפילמור לקרות בהיעדר חמצן. מניסיוננו, תא ואקום עובד היטב, למרות שסביבת גז אינרטי יכולה לשמש בהצלחה שווה.
זהירות סופית אחד בעת הכנת הרשות הפלסטינית הידרוג כמו מצעי תא כדי לבדוק את תגובות תא נוקשות תלויה, היא שעובי הידרוג'ל התוצאה הוא חשוב: לדק מאוד ג'לים, התאים מסוגלים לחוש את המצע הבסיסי 36 שימוש בתאוריה וניסוי,. לין et al. הוכיח כי העומק שבו תאים יכולים Feאל המצע הבסיסי תלוי בממד הרוחב של התא. 29 מאז המחקר הנוכחי הוא סותר, זיהוי העובי המינימאלי הנדרש כדי למנוע את תאי חישה מהמצע "המוסתר" להיות מכמה מיקרונים 36 לעד 60 מיקרון, 37 עובי ג'ל מינימום של 100 מיקרומטר צריך להיות מכוון ל.
כשהרכבת ג'לי הרשות הפלסטינית לתוך צלחת multiwell, טיפה קטנה של PDMS משמשת כדי לאבטח את הג'ל לתחתית הבאר. PDMS נבחר משום שהוא פועל דבק קבוע כעל התקשות, זה שקוף לחלוטין ואינו מפריע לניסויים במיקרוסקופ שלאחר מכן, הוא מלא שאינו רעיל לתאים, וזה מרפא בכ 4-8 שעות והשאיר מספיק זמן להרכבת צלחת. בבטחה אבטחת הידרוג לתחתית העזרים גם בטיפול תא: לדוגמא, שטיפה נמרצת יכולה לסלק הידרוג אם לא מאובטחת היטב. אם שינוי תכוף במ 'תאעדיה היא לא דאגה, אז ג'לי יכול להיות מאובטח באופן זמני אל פני השטח היטב על ידי טיפה קטנה של נוזל שאינו רעיל לתאים וצמיגים מאוד כגון גליצרין.
הצעדים האחרונים לפני זריעת תאים כרוכים ציפוי ECM של עיקור ג'ל ולאחר מכן. כאן קולגן Type I ציפוי מתואר (איור 3) למרות שבאותה הטכניקה יכולה להיות מיושמת על כל חלבון ECM אחר. Crosslinker דו-פונקציונלי sulfo-SANPAH מנוצל כדי להשיג אפילו מעיל monolayer. המחקר קודם הראה כי קובץ מצורף קוולנטיים כגון מניב ציפוי אחיד יותר מאשר חלבון ספיחה פשוטה וגם מאפשר לכוונון 12 של פי כמות החלבון המצורפת פשוט על ידי שימוש בפתרון חלבון משתנה ריכוז. 6 לבסוף, צלחת ג'ל multiwell התאסף מעוקר תחת UV בברדס בתרבית הרקמה עד שעה 2. עיקור UV מאפשר לassay להיות מורכב על ספסל מעבדה מחוץ למכסה המנוע, שהופך את התהליך לוגיסטי פשוט וכולל יותר מהר.
איורים 4 ו -5 להמחיש כמה תוצאות נציג מתאי סרטן השד מד"א MB-231 בתרבית על ג'לי גמיש מפלסטיק מצורף תמיכת הרשות הפלסטינית בדרגות שונות של נוקשות. מד"א MB-231 תאים נבחרו להדגים את תועלת השיטה כי הם הוכחו להגיב לקשיחות המצע הבסיסית על ידי שינויים מדידים במורפולוגיה שלהם. 5,12 כצפוי, התאים היו מוארכים יותר והיה לי אזור הפצה גדול ב 100 ג 'לים kPa הרשות הנוקשה לעומת 0.5 ו 1 ג' לים kPa הרשות הרך (איורים 4 ו -5). בשורה התחתונה באיור 4 גם מדגימה את השימוש בשני צבעי ניאון שלהכתים את גרעין התא והתא בציטופלסמה, מציג לראווה את העובדה שתמיכת פלסטיק הגמישה לא להפריע הדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
לסיכום, שיטה פשוטה להכנת הידרוג polyacrylamide בפורמט צלחת multiwell מוצג. הטכניקה היא מהירה יותר, יעילה יותר, ופחות יקרה מאשר שיטות קיימים להכנת ג'לי הרשות הפלסטינית כדי לשמש כמצעי תא, כמו גם מאפשר הכנת ג'לים של גדלים מותאמים אישית אחרת לא זמינה. כפי שהוא אינו דורש שום ציוד מיוחד, השיטה יכולה להיות מאומצת בקלות על ידי כל מעבדת מחקר ויהיה שימושי במיוחד במחקר מתמקד בהבנת תגובות תא נוקשות תלויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K.
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -M., Wang, H. -B., Dembo, M., Wang, Y. -l Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D.
- Lin, Y. C., et al.
- Chrambach, A. The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J.
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C.
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
