Introduction
Transgene musemodeller har været medvirkende til at evaluere patofysiologien for Alzheimers sygdom (AD), samt potentialet terapeutiske indgreb. Kognitive opgaver, såsom Morris water maze (MWM), er almindeligt anvendt med modellerne for at identificere de molekylære korrelater til hukommelsessvigt og vurdere effektiviteten af prækliniske lægemidler. Det er imidlertid afgørende, at den dynamiske område af kognitiv opgave være brede nok til at registrerer små behandlingseffekter. Med musemodeller for AD, kognitive typisk aldersbetinget, og musene vise progressive fald i ydeevne (f.eks 1). Anvendelse af en følsom kognitiv opgave kan tillade afsløring af subtile forskelle tidligere i dyrets liv, og derved reducere omkostningerne i forbindelse med aldrende dyr. For eksempel at reducere antallet af uddannelse forsøg i hippocampus-afhængige Barnes labyrint 15-5 øget opgavens vanskelighed, hvilket resulterer i detection af underskud i 3xTg modellen i en tidligere alder end tidligere rapporteret 2. Tidligere påvisning af underskud ikke kun tilbyder megen tid og omkostningsbesparelser, det øger også sandsynligheden for, at der kan identificeres de molekylære forandringer underliggende kognitive mangler.
En faktor, der påvirker følsomheden af kognitive opgaver er den genetiske baggrund stamme af musemodel. For eksempel BALB / c-mus udviser overlegen præstation i indlæring og hukommelse opgaver i forhold til andre stammer, såsom C57BL / 6 3. F1 FVB / N x 129S6 baggrund bruges til to af de mest udbredte anvendte modeller af AD, den Tg2576 og RTG (TauP301L) 4510-modeller. Denne stamme udviser overlegen indlæringsevne i MWM forhold til andre stammer, herunder B6 / SJL-mus 4. På grund af denne overlegne indlæringsevne, kan brugen af en enkelt sonde efter omfattende træning maske gruppeforskelle skyldes over-uddannelse. Derudover sensitivity fra sonde forsøg kan være aldersbetinget. Vi har tidligere vist, at tidligere forsøg sonde, efter begrænset skjult platform træning, er mere følsomme over for forskelle i unge Tg2576 sammenlignet med unge transgene-negative kuld kontrol end er probe forsøg indsat efter mere omfattende uddannelse 5. I modsætning hertil sonde forsøg efter omfattende uddannelse er mere følsomme i ældre (20-25 måned) Tg2576 mus sammenlignet med ældre søskende end er tidligere sonde forsøg 5. Ved at indflette sonde retssager i hele uddannelsen, er sandsynligheden for, at en følsom retssag vil blive identificeret øges, især hvis langsgående test er udført, og følsomheden af en særlig sonde forsøget er aldersbetinget. Figur 1 viser den overlegne ydeevne F1 FVB / N x 129S6 mus under protokol optimeret til denne stamme sammenlignet med mus i B6 / SJL baggrund uddannet under en protokol med mere omfattende uddannelse.
Den MWM ergenerelt menes at give pålidelige foranstaltninger, der er reproducerbare tværs af både tid og laboratorier 6. For eksempel blev det primære protokol oprindeligt blev brugt af vores Minnesota laboratorium 1,7 succesfuldt implementeret med mindre modifikationer på West Virginia University 8. Ligeledes blev ensartede værdiforringelse observeret i RTG (TauP301L) 4510 mus i forhold til at kontrollere søskende hvis opstaldet under patogenfrie eller konventionelle betingelser 9. Imidlertid kan testmiljø påvirke følsomheden af MWM opgave. Faktorer som rumbelysning, lufthuller, temperaturgradienter og lyde alle bidrage til miljømæssige signaler 4, der i sidste ende kan påvirke ydeevnen. Når vores Minnesota laboratorie- og vivarium blev flyttet til en ny bygning, op til en reduktion af vildtype ydeevne 38% blev observeret, væsentligt reducerer den dynamiske område af opgaven og evnen til at detektere transgene-relaterede underskud. Denne ændring i performance skete trods designe test plads til at være af tilsvarende størrelse og konfiguration, og bruger de samme anvendte visuelle indtryk. En "re-optimering" af den oprindelige protokol var forpligtet til at øge dynamikområdet af MWM opgave i det nye testmiljø.
Her den oprindelige protokol skræddersyet til brug med F1 FVB / N x 129S6 baggrund 5 beskrives. Fordi nogle undersøgelser tyder på stress er forbundet med dårlig MWM præstation 10 og pre-behandling kan afhjælpe dette stress-induceret underskud i ydeevne 11 blev en pre-håndtering protokol designet til at akklimatisere mus til indføring og fjernelse af puljen før MWM test . Efter pre-håndtering, mus gennemgår synlig platform træning, hvor en forhøjning er markeret med et flag. Synlig platform træning anvendes til at identificere mus med ydeevnen problemer relateret til sensomotoriske abnormiteter. Brug af udelukkelseskriterier beskrevet i protocol sektion, performance-inkompetente mus fjernes fra efterfølgende undersøgelser af skjulte platform uddannelse og sonde forsøg. Nedskrivninger i skjulte platform uddannelse og sonde forsøg tolkes som kognitive mangler, fordi sensorimotorisk ydeevne indregnet ud af dataene. Efter afslutning af synlig platform træning, begynder mus skjult platform træning hvor platformen er nedsænket i vand og forbliver i samme position i forhold til eksterne signaler. Forsøg, hvor platformen er fjernet (probe forsøg) veksler hele skjult platform træning for at vurdere indflydelsen af yderligere uddannelse. Fordi probe forsøg sker i begyndelsen af hver dag, før yderligere skjulte platform træning, probe forsøg måler evnen af dyret til at huske placeringen af platformen efter en 20 timers forsinkelse, betragtes et mål for henvisning hukommelse 12. Endelig måder, hvorpå denne originale protokol blev re-optimeret, når forandringer i testmiljøforstyrret kontrol ydeevne beskrives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med standarderne i Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) og godkendt af West Virginia University IACUC.
1. Pre-håndtering
- Opsætning af Pool
- Prop pre-håndtering puljen, så det er hævet til en behagelig højde.
- Place 2 I vand (21 ° C) i den præ-handling pulje til et niveau på ca. 1 cm.
Bemærk: Du må ikke tilføje farve.
- Procedure
- Bringe musene fra vivarium til test værelse.
- Kontroller emnet identifikation (emne nummer, hale tatovering, øre klip osv.).
- Mark musens hale med en permanent markør til at skelne mus i buret, der har undergået en pre-handling test fra dem, der mangler at blive testet. Markere alle mus i et bur med samme farve.
- Placer en mus i overførslen bæger for opstillet cately 5 sek. Derefter forsigtigt hældes musen ud af bægerglasset i pre-handling pool.
- Ved hjælp af en timer, lade musen til at forblive i puljen i 20 sekunder.
- Efter 20 sek, placere forsigtigt scoop (uden lystfiskeri det) foran musen. Kortvarigt tillader musen til at udforske scoop, og om nødvendigt, opfordre musen til at komme på scoop ved forsigtigt at skyde den scoop under musen, mens langsomt løft. Pas på ikke at skræmme mus med scoop.
- Når musen er i scoop, transportere den tilbage til den bedrift buret.
- Gentage disse procedurer for hver mus i buret gang om dagen i 10 dage. Med jævne mellemrum (f.eks efter hvert dyr), afhente fecal Boli og strøelse fra puljen ved hjælp af en net.
- Skyl overførslen bægerglas med vand med regelmæssige mellemrum (f.eks efter gennemført et bur af mus).
- Når disse trin er udført, skylles overførslen bæger med vand flere gange, dumpe vand frapoolen, og skyl den pulje cirka to gange med vand.
2. Synlig Platform Træning
- Opsætning Mouse ydeevne Tracking Software f.eks Viewer (se tabel Materialer).
- Kalibrer video til at matche de dimensioner af labyrinten under "Configuration" - "Filtre og objekter" fanen.
- Indstille filtre så programmet kan skelne en mus fra baggrunden.
- Juster "følsomheden" under "Baggrund filter" område, så tracking software identificerer dyret.
- Klik på "acceptere" valgmulighed, når tracking software identificerer dyret. Vælg "Rediger" for at blackout områder uden for labyrinten området.
- Vælg den relevante "dyr filter" og "min. dyrets størrelse ".
- Oprettelse af Run Sheets <ol>
- Opret en køre ark notering hver mus, hver potentiel placering, og et rum til noter, der indeholder oplysninger om afvigende adfærd.
- Forudbestemme steder for synlig platform test, der er de samme for hver gruppe af mus. Således for første forsøg, pre-fastslå, at platformen vil blive placeret på den modsatte side af, hvor mus anbringes i labyrinten, på højre side tæt på væggen. For det andet forsøg, pre-fastslå, at platformen vil blive placeret i en anden placering langs bagvæggen for hver mus, og at dette vil fortsætte for hver af de 6 forsøg.
- Hæng gardiner rundt i lokalet, således at eventuelle rumvirkning er skjult.
- Placer karret, så det matcher konfigurationen i tracking software ved at sikre labyrinten matcher med opsætningen konfiguration på "Konfiguration" - fanebladet "Zone Definition". Bemærk: Det hELPS at sikre karbad er i den rigtige placering, før fylde det med vand som karret ikke let flyttes en gang fyldt.
- Fyld karret med vand fra hanen, og med et termometer, sikre vandtemperaturen er omkring 21 ° C. Sørg for, at vandet forbliver inden for en grad af denne temperatur i hele test, da koldere vand kan påvirke ydeevnen især når du bruger alderen mus 8.
Bemærk: Du må ikke tilføje farve. - Ved anvendelse af de forudbestemte steder, placere platform, som har en monteret flag, der når en højde på 13 cm og er 4,5 cm x 4,5 cm med en fed "S" formet karakter præget på den, i den første placering af karret, således at det er cirka 1 inch over overfladen af vandet.
- Tag den første mus fra buret, kontrollere emnet identifikation, markere halen ved hjælp af en permanent markør for den rigtige farve, og plads i bægeret.
- Forsigtigt placere musene ind i karret, starte timeren, og sikre, at tracking software sporer dyret. Tillad musen op til 2 min at lokalisere platformen. Når musen lokaliserer platformen, tillade musen 20 sek på platformen.
- Hvis dyret finder platformen og fortsætter med at hoppe eller falde, skovl musen og placere musen på platformen. Hvis musen fortsat hoppe eller falde af platformen, hold musen på platformen, så musen erfarer, at forblive på platformen fører at flygte fra karret.
Bemærk: Musen bør forblive på platformen for en kombineret tid på 20 sek; således, om musen hopper ud efter 5 sek, mængden af tid tilbage på platformen er 15 sek og ikke nulstillet til 20 sek. - Hvis dyret ikke finde platformen i 2 min periode, scoop musen og placere den på platformen for 20 sek.
- Efter 20 sek på platformen, skal du fjerne musen fra platformen som udført i pre-håndtering uddannelse og placere musen i the opvarmet bur foret med køkkenrulle og opvarmes til ~ 31 ° C ved en varmepude og varmelampe i 30 sek. Udføre periodisk vurdering af kropstemperaturen med en rektal termometer til at sikre, at visse stammer af mus eller mus i en vis alder, ikke differentielt modtagelige for hypotermi induceret af eksponering for vand.
- Efter 2 min til bedriften bur med varmelampe, overføre musen til bedriften bur med kun en varmepude, men ingen varme lampe, at inddrive mellem forsøg. Til sidst, placere alle mus fra en enkelt hjem bur i samme bedrift bur under testen.
- Rengør labyrint af snavs med en netto efter hver mus har gennemført et forsøg, at forstyrre olfaktoriske tidskoder.
Bemærk: Platformen vil forblive på samme sted for hver mus i en enkelt prøve og vil væreflyttet til de andre forudbestemte steder til det efterfølgende forsøg. Dette sker for at sikre, at mus 1) lære der er en platform til at flygte fra, 2) svømme direkte til den synlige platform, hvilket viser intakt visuelle kompetence, og 3) har ingen motoriske underskud.
Bemærk: Brugen af en hånd timer kan også være fordelagtigt at sikre nøjagtigheden af tracking software.
3. Morris Water Maze Hidden Platform Træning
- Set op på værelset
- Hænge gardiner i rummet for at skjule rumlige signaler i laboratoriet.
- Placer tidskoder strategisk på gardinerne. Sørg for, at signaler er store og indeholder kontrastfarver (tidl .: sort og hvid) for bedre synlighed. Hæng stikord på afstand og højde, hvor de er synlige for mus fra inde i karret. Bemærk: De signaler er statiske og ikke bevæger sig under testning.
- Opsætning Mouse ydeevne Tracking Software
- Kalibrer video til at matche de dimensioner af labyrinten under "Configuration" - "Filtre og objekter" fanen.
- Indstille filtrene så programmet kan skelne musene fra baggrunden.
- Brug de samme procedurer som beskrevet i det synlige platform test (trin 2.1.2.1-2.1.2.3) for at oprette filtre til Morris water maze skjult platform uddannelse.
- Opret fire lige store kvadranter inde i labyrinten
- Klikden "Ellipse" under fanebladet "Zone Definition" først, og oprette en cirkel, der matcher labyrinten på skærmen. Bemærk: På denne fane, er den faktiske labyrinten oprettet vises, så det giver mulighed for at matche computer setup med den faktiske labyrinten setup.
- Klik på "Rektangel", og oprette fire lige store firkanter. Placer disse firkanter på skærmen for at oprette fire lige kvadranter inden den nyoprettede kreds.
- Opret platformene i labyrinten.
- Vælg "Ellipse" valgmulighed, og oprette en cirkel på størrelse med den platform, der vil blive anvendt. Bemærk: Placering af platformen i labyrinten på forhånd kan være en fordel at oprette en ellipse den nøjagtige størrelse af platformen.
- Placer nyoprettede platform beliggenhed i centrum af målet kvadrant. (Det anbefales at navngive denne objekt "mål" at skelne de rigtige platforme fra resten). Afgørende skridt: I boksen bare below "Grid", vælg "stop" under "trigger" for målet platform. Dette vil få programmet til at stoppe, når musen når platformen.
- Opret tre andre identiske platform områder, og placere dem i de nøjagtige steder i de andre kvadranter. Vælg ikke "stop" i "trigger" valgmulighed.
- Oprettelse af Run Sheets
- Opret en køre ark notering hver mus, hvert forsøg, en plads til at nedskrive tid til at nå platformen, og en plads til at notere afvigende adfærd (tabel 1).
- Pre-bestemme frigivelse punkt i hvert mus i en pseudotilfældig måde. Bruge pseudo-tilfældig udvælgelse, således at afstanden til platformen er lig hver dag, hver af de 4 steder anvendes ligeligt, og vinklen fra start til platformen (dvs.., Fra venstre eller højre) er afbalanceret i og mellem dage.
Bemærk: placeringen af platformen på flugtark for at sikre placeringen af platformen bevæger sig ikke fra den oprindelige position. Sørg for, at platformen er i midten af en af de fire zoner, der er oprettet på tracking software.
Bemærk: Hvis langsgående test bliver gennemført på forskellige aldre, flytte platform til en ny placering ved hver alder.
- Opsætning af Maze
- Juster enten vandet labyrint eller kameraet sådan at der er et match mellem labyrinten og setup konfigurationen på "Konfiguration" - "Zone Definition" fanen.
- Mærke de fire usete kvadranter i labyrinten (N, S, E, W). Kontroller, at disse match med konfigurationen i tracking software til at sikre mus bliver frigivet fra de korrekte udgangspunkter.
Kritisk Trin: Sted disse mærker uden for labyrinten og ud i lyset af en swimming dyr eftersom tidskoder i labyrinten udgør en ikke-rumlig, ikke-hippocampus afhængige opgave. - Fyld labyrinten med hanen water (ca. 21 ° C), således at platformen er ca. 5 mm under vandoverfladen.
- Placer platformen i forudbestemt sted.
Bemærk: Placeringen af platformen vil forblive den samme for alle mus bliver testet på tværs af alle dage og prøvelser. - Brug ikke-giftige hvid tempera maling for at gøre vandet uigennemsigtigt. Gør dette for at sikre, at toppen af platformen er usynlig fra dyrenes øjenhøjde mens svømning.
- Procedure
- Tag musen fra buret, markere halen ved hjælp af en permanent markør for den rigtige farve, og placere i bægeret.
- Hæld forsigtigt musen ind i labyrinten, så den kommer ind mod væggen. Bemærk: Hver mus vil blive placeret i samme udgangspunkt sted for en enestående retssag.
- På den første udgivelse af musen, begynder timeren og stå i et område, hvor testeren ikke let synlige af mus. Sørg for, at dyr tracking software er korrekt spore dyret. Når dyret når platformen, gør det muligt at forblive på platformen i 15 sek.
Bemærk: Dette tillader dyret at orientere dens rumlige placering i rummet. - Efter 15 sek på platformen, fjerne dyret fra labyrinten og returnere musen til det opvarmede bur.
- Hvis musen finder platformen og fortsætter med at hoppe eller falde inden 15 sekunder, skovl musen og placere den tilbage på platformen i den resterende del af 15 sek så musen lærer at associere platform med escape.
- Hvis musen ikke finde platform inden 60 sek, forsigtigt scoop musen og placere den på platformen. Lad det forblive på platformen i 15 sekunder, derefter fjerne dyret med skovl og bringe den tilbage til den opvarmede bur.
- Rengør labyrint af snavs med et net til at forstyrre olfaktoriske tidskoder.
- Gentag disse procedurer for de resterende mus i gruppen. Således til test dage 4 til 9, foretage fire forsøg med skjult platform toging dagligt, og ca. 20 min mellem hvert forsøg.
- Skift start placering pseduorandomly for hvert forsøg. Således under retssagen 1, løslade alle mus fra samme udgangspunkt placering, derefter gentage proceduren fra en anden udgangsposition for de efterfølgende forsøg. Hver dag varierer release punkter for at sikre dyr ikke udvikler et ikke-rumlig, ikke-hippocampus afhængige motorisk strategi. For eksempel, hvis musene frigives fra N, S, E og W point på dag ét, ikke frigive dem i den samme rækkefølge den følgende dag.
- Under skjult platform træning, brug dyret tracking software til at måle ventetid for at nå platformen, vejlængde af dyret, og den procentdel af tid eller afstand dyret tilbringer i hvert labyrint kvadrant. Få disse målinger fra fanen "Vand labyrint" under "Experiment liste", og kan eksporteres direkte til en Excel-regneark.
Bemærk: Brugen af en hånd timer sikrer nøjagtigheden af sporingsoftware.
4. Probe Trials
- Opsætning Mouse ydeevne Tracking Software
- Brug de samme procedurer som i Morris water maze skjult platform procedure (trin 3.2.1-3.2.4.3) med én undtagelse. Afgørende skridt: For sonde forsøg sikre "stop" mulighed for "trigger" slukkes under sonde forsøg. Dette vil forhindre programmet i at stoppe, når en mus krydser platform området.
- Oprettelse af Run Sheets
- Opret en køre ark notering hver mus, hvert forsøg, og en plads til at notere afvigende adfærd. Pre-bestemme frigivelse punkt under sonden forsøg, således at de skifter mellem de to sider modsat platformen. Således, pre-bestemme frigivelse punkter sådan, at mus ikke frigives fra de to sider, der støder op til platformen.
- Procedure
- Gennemføre sonde forsøg ligner skjult platform træning, med undtation, at ingen platformen er i labyrinten.
- Slip en mus fra en forudbestemt release punkt. Under prøveforsøget, fjern platform og musen har 60 sek til at svømme i labyrinten.
- Under testen gennemføre 4 sonde forsøg. Alter frigivelse punkt i musene mellem sonden forsøg. Således ændre frigivelsen af den igangværende prøveforsøget fra det foregående prøveforsøget.
- Under proben forsøg bruge dyret tracking software til at spore vejlængde af dyret, den procentdel af tiden dyret bruger i hver kvadrant af labyrinten, og antallet af gange et dyr svømmer over tidligere platformed område. Få disse målinger fra "Dataanalyse" fanen og "Vand labyrint" fanen under "Experimental liste", og eksportere direkte til en Excel-regneark.
Bemærk: Brugen af en hånd timer kan også være fordelagtigt at sikre nøjagtigheden af tracking software. - Gennemføre en sonde retssag førskjult platform træning på dage 6, 7, 8 og 10. (figur 2). Efter disse probe forsøg udføre 4 forsøg med skjult platform uddannelse hver dag. Således udfører en sonde først, umiddelbart efterfulgt af skjult platform uddannelse for alle mus ved hjælp af de samme procedurer som beskrevet i afsnit 3. I modsætning hertil ikke udfører yderligere skjulte platform uddannelse efter sonden retssagen på dag 10.
5. Analyser
- Synlig Platform Træning
- Foretage gentagne målinger ANOVA'er separat for (a) banelængde, (b) latenstid til at finde platformen, og (c) svømme hastighed med transgen (eller en anden variabel, såsom behandling) som mellem-emne variabel og dage eller uddannelse blokke som indenfor-emne variabel. Bemærk: For mere komplekse motiver en konsultation med en statistiker være nyttig. Se 8,13 for oplysninger om gruppe størrelser tilstrækkelig til korrekt magten denne opgave med almindeligt anvendte modeller af Alzheimers7; s sygdom.
- Ydeevne Inkompetence
- Identificer præstationsfremmende inkompetente mus, herunder mus, der viser visuel eller motor inkompetence, eller dyr, der ikke erhverve de proceduremæssige elementer af testen, og fjerne disse mus fra efterfølgende statistiske analyser af skjult platform og sonde ydeevne.
- Beregn den gennemsnitlige latenstid og svømme hastighed for den sidste dag i synlig platform træning for hver mus. Fjern mus med hjælp 2 standardafvigelser over gruppen betyder, da dette kan være tegn på motor eller synshandicap.
- Identificere og fjerne mus undlader at orientere eller følg flugt scoop eller mus udviser afvigende adfærd, såsom kork-skrue svømning eller flydende.
- Identificer præstationsfremmende inkompetente mus, herunder mus, der viser visuel eller motor inkompetence, eller dyr, der ikke erhverve de proceduremæssige elementer af testen, og fjerne disse mus fra efterfølgende statistiske analyser af skjult platform og sonde ydeevne.
- Morris Water Maze Hidden Platform Træning
- Foretage gentagne målinger ANOVA'er på (a) banelængde, at (b) latenstid finde den skjulte platform, (c) svømme hastighed, og (d) procent tid eller procentdistance i kvadrant med transgen som mellem-emne variabel og undersøgelser som den inden for individet variabel.
- Probe Trials
- Swim hastighed
- Foretage gentagne målinger ANOVA'er på svømme hastighed tværs sonde forsøg med transgen som mellem-emne variabel og undersøgelser som den inden for individet variabel.
- Platform passage indeks
- Brug af sonden retssagen konfiguration for hver mus, er indekset platform passage (PCI) beregnes ved hjælp af følgende formel: PCI = antal gange musen krydser målet placering - gennemsnitlige krydsninger af tilsvarende placering på de andre 3 kvadranter.
Bemærk: dette er udført for at bestemme, om musen bruger en rumlig søgestrategi, som angivet ved flere krydsninger over uddannet platform placering, eller en ikke-rumlig strategi thigmotaxic svømning, som angivet ved omtrent lige store sporkrydsninger alle fire steder. - Conduct gentogmåler ANOVA'er på PCI med transgen som mellem-emne variabel og undersøgelser som den inden for individet variabel.
- Brug af sonden retssagen konfiguration for hver mus, er indekset platform passage (PCI) beregnes ved hjælp af følgende formel: PCI = antal gange musen krydser målet placering - gennemsnitlige krydsninger af tilsvarende placering på de andre 3 kvadranter.
- Procent tid eller procent distance i kvadrant
- Beregne procent tid eller afstand hver mus tilbringer i de fire kvadranter i labyrinten. Foretage gentagne ANOVA'er foranstaltninger på procent af tiden, eller afstand, med transgen som mellem-emne variabel og undersøgelser som den inden for individet variabel. Brug procent tid til at afgøre, om der anvendes en rumlig søgestrategi; fund af ca. 25% tid i målet kvadrant angiver mus klarer på tilfældigt niveau og ikke bruger en rumlig søgestrategi.
- O / N glemmer
- Sammenlign latensen af platformen område passage på proben forsøg at latenstiden for at finde platformen på endelige afprøvning af den foregående dag. Bemærk: hvis latenstiden af platformen passage på proben forsøget er betydeligt længere end latenstiden for at finde den platform;m under den sidste retssag mod skjult platform på den foregående dag, så O / N glemmer af platformen placering sker.
- Swim hastighed
- Post-hoc analyse
- Følg betydelige RMANOVAs med post hoc sammenligninger af transgen ved hvert forsøg.
6. Eksempel på Re-optimering for et nyt testmiljø
- Pre-håndtering. Gennemføre præ-håndtering i huset rummet. Placer bure uden låg på en transport vogn for hele sessionen.
Bemærk: Mål for ændring af præ-håndtering procedure skal mere gradvist indføre handleren manipulationer og eksponering til transport enheder (bæger og øse), og for at øge den tid mus er i hjemmet bur uden microisolator låg og uden for deres bur i en åben mark og lysere lysforhold.- Dag 1 og 2
- Tillad mus til at akklimatisere sig til hænder bliver i buret, efterfulgt af blid berøring, Efterfulgt af at blive løftet for tatovering eftersyn og mærkning af halen. Begyndende på dag 2 af præ-håndtering, placere supplerende redebygningsmateriale i buret for at give yderligere materiale til redebygning og læ, mens låg er fjernet 9.
- Dag 3 og 4
- Anbring transport bæger, øse, og flag synlig platform i før-håndtering boksen og tillade mus til at udforske for 2 forsøg på 2 min pr forsøg.
- Brug ikke vand i denne protokol under pre-håndtering. Snarere sikre boksen indeholder nok ren strøelse til at dække gulvet og er parfumeret med en lille mængde af kvindelige og mandlige snavset strøelse, hvis begge køn er ved at blive afprøvet. Ændre strøelse hver dag.
- Dag 5
- Placer mus i den præ-håndtering boks indeholdende let snavset strøelse og synlig platform flag i 3 forsøg for 20 sek hver. Brug bægerglas og scoop at transportere musene til og fra boksen.
- Synlig Platform Træning
- Indstil vandtemperatur ved 27 ° C (rutinemæssigt anvendes til Minnesota testmiljø).
- Retur mus til hjemmet bur ved at erhverve cued platform.
- Tillad mus op til 60 sek for at erhverve den synlige platform.
- Gennemføre kurser, der består af 3 forsøg per dag i 5 dage.
- Skjult Platform Træning
- Ændre visuelle referencer. Bortset fra en stor gardin at tilsløre handleren, enten fjerne eller gøre smallere andre gardiner omkring poolen for at have en mere åben plads. Placere yderligere objekter om rummet (f.eks udsat reoler, sort stof plakat med et hvidt symbol, en sort og hvid badebold, store sorte skorstene, notesbøger, og en sort udstoppet dyr), hvilket resulterer i en afbalanceret, men mere varieret visuel cue- indstillet end tidligere anvendt.
- Begynd skjult platform træning 72 timer efter afslutningen af synlige platform training, med et interval på ca. 30 minutter mellem forsøg.
- Gennemføre kurser, der består af 2 forsøg i 8 dage.
- Probe Trials
- Udfør probe forsøg 72 timer efter skjulte uddannelse forsøg 8, 12 og 16.Include en 3-dages interval mellem forsøg 8-9, og 12-13 af uddannelse.
- Indstil sonden varigheden i 30 sek.
- Dag 1 og 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har brugt Morris water maze at undersøge virkningerne af beta-amyloid (Tg2576-mus) og mutant P301L tau (RTG (TauP301L) 4510-mus) om rumlig henvisning hukommelse (fx 1,5,7,8). Figur 3 er repræsentanten resultat rapporteres i vores undersøgelse at undersøge effekten af voksen-debut P301L tau udtryk på indlæring og hukommelse 8, udnytte testmiljø A. For at vurdere motoriske og visuelle evner blev mus sammenlignes på tværs synlig platform uddannelse blokke, hvor hver uddannelse blok bestod af 3 forsøg. Vejlængde i synlig platform træning var ikke forskellig mellem kontrol og TauP301L mus (figur 3A), hvilket tyder på transgen positive og negative mus udviser sammenlignelige svømning og begge grupper kan se den visuelle cue (flag) markerer platformen. Ingen mus blev identificeret som performance-inkompetente baseret på udelukkelseskriterierne. Dernæst ydeevne i skjult platform træning blok blev sammenlignet, hvor hverblok består af 1 dag (4 forsøg) uddannelse. Som musene lært placeringen af platformen, den vejlængde og tid til at finde platformen faldet. Men vejlængde var signifikant længere i TauP301L mus sammenlignet med kontrol ved hver træning blok (figur 3B), hvilket tyder på rumlig indlæring blev svækket i TauP301L mus. Fire sonde forsøg, hvor platformen blev fjernet, blev afbrudt i hele skjult platform træning og fandt sted i begyndelsen af dagen, før starten af skjulte platform træning. Således er disse probe forsøg målte geografiske referencesystem hukommelse. Sammenligning på tværs af disse fire sonde forsøg Controls væsentligt forbedret med yderligere uddannelse (figur 3C), som angivet ved øget tid i målet kvadrant. I modsætning hertil TauP301L mus ikke bedre med yderligere uddannelse. Således opstod de største forskelle mellem de to grupper i denne alder på sonde retssag 4. Disse data indikerer, at P301L tau udtryker forbundet med både rumlig indlæring og rumlige henvisning hukommelse underskud. Mens vandet labyrint opgave kan være relativt stabilt til nogle proceduremæssige forskelle, F1 FVB / N x 129S6 baggrund stammen kan være særligt følsomme over for visse miljømæssige forandringer. Den første protokol skitserede blev også med succes brugt i Miljø B (f.eks., 1,7). Imidlertid vildtypeprobe præstation var signifikant lavere, når den første protokol blev anvendt i et tredje sted, miljø C. Den fornyede optimerede protokol signifikant forbedret vildtypeprobe ydeevne (figur 4).
Figur 1:. Optimering af Protokol for Background Strain Wild-typen 7-8 måneder gamle mus blev trænet med de samme tidskoder og test miljø. F1 FVB / N x 129S6 (N = 24) og B6 / SJL (N = 16) -mus først modtog 18 og 24 synlig platform uddannelse forsøg henholdsvis leveres på 6 og 8 forsøg om dagen hhv. Begge stammer modtaget 4 skjulte platform træning forsøg om dagen. For F1 FVB / N x 129S6 mus, blev probe-forsøg udført 20 timer efter 8, 12, 16, og 24 uddannelse forsøg. For B6 / SJL-mus, blev probe-forsøg udført 20 timer efter 12, 24 og 36 uddannelse forsøg.
Figur 2:. Tidslinje Mus modtog synlig platform træning i 3 dage, 6 forsøg pr dag, efterfulgt af skjult platform træning i 6 dage, 4 forsøg per dag. Fire probe forsøg blev udført 20 timer efter 8, 12, 16 og 24 skjulte uddannelse forsøg.
Figur 3: Repræsentative resultater for Morris Water Maze TauP301L mus, der bærer det humane P.301L tau-gen blev undersøgt ved ca. 6,5 måneder efter tre måneders P301L tau udtryk (n = 41 tauP301L og n = 46 kontroller med en ca. lige mange hanner og hunner i hver gruppe). (A) vejlængde i synlig platform træning var ikke forskellig mellem kontrol og TauP301L mus (p s> 0,05). (B) I skjult platform uddannelse, TauP301L mus viste signifikant længere vejlængder på tværs af alle uddannelse blokke (Transgene: F (1, 83) = 41.96, p <0,0001; Transgene × Block: F (5, 415) = 0,6141, p = 0,69 ). (C) Kontrol forbedret på tværs af de fire sonde forsøg, mens TauP301L mus gjorde ikke (Transgene: F (1, 83) = 29,1, p <0,0001; Transgene × Trial: F (3, 270) = 4,91, p = 0,008). Hver uddannelse blok bestod af 3 forsøg for synlig platform uddannelse eller 4 forsøg for hidden platform træning. Tukey post-hoc analyser: * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001. Dele af figur 3 genoptrykt fra Hunsberger et al., Effekt størrelse hukommelse underskud i mus med voksen-debut P301L tau udtryk Behav Brain Res, Vol. 272, pp. 181-95. Copyright 2014 med tilladelse fra Elsevier.
Figur 4: Probe Scores Er væsentligt påvirket af testmiljø og træning protokol Tre grupper af tau negative F1 FVB / N x 129S6 mus trænet ved hjælp af forskellige kombinationer af træning protokol og testmiljø genereret markant forskellige sonde scores efter 8, 12 og 16 uddannelse. forsøg (Group: F (2, 42) = 14,89, p <0,0001; Gruppe x Trial: F (4, 84) = 1,10, p = 0,36). Mus uddannet udnytte protokol 1 og same sæt anvendte stikord vises signifikant lavere sonde scores under Miljø C i forhold til miljø B (Miljø: F (1, 25) = 28.58, p <0,0001; Miljø x Trial: F (2, 50) = 1,93, p = 0,16) . Mus trænet under Environment C viste signifikant højere sonde scores når modificerede tidskoder og re-optimeret protokol 2 blev udnyttet i forhold til mus uddannet udnytte de oprindelige signaler og protokol 1 (Protokol: F (1, 30) = 15,32, p <0,001; Protokol x Trial: F (2, 60) = 0,91, p = 0,41) ** p <0,001; *** p <0,0001..
| Dag 1 | Morris Water Maze - Kohorte: | Dato: _________ | ||||||
| Platform i SE kvadrant | Tester: &# 160; Start tid: Finish tid: Vand temp: | 1m max retssag tid / 15s på platform / * placeret på platformen | ||||||
| Gruppe 1 | ||||||||
| Forsøg 1 | ||||||||
| Animal ID | Mærkning | Bur # | End tid | Frigivelse punkt | Perron placering | Find platform? | Tid | Bemærkninger (dvs. ulige adfærd) |
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| 20 minutter ITI | ||||||||
| Forsøg 2 | ||||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| 20 minutter ITI | ||||||||
| Forsøg 3 | ||||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| 20 minutter ITI | ||||||||
| Trial 4 | ||||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| </ Td> | S | SE | ||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
Tabel 1:. Hidden Platform Run Sheet Et eksempel løb ark, hvor platformen er beliggende i den sydøstlige (SE) kvadrant er tilvejebragt. Eksperimentatoren skal skrive musens ID-nummer, anonymiseres mærker på halen eller ørerne, og buret gruppering. Frigivelsen punkt er angivet på arket, og bør være pseudo-tilfældigt bestemt som beskrevet i trin 3.3.2. Optage, om musen finder platformen og tid til at finde platformen. Mærkelig adfærd, herunder flydende eller thigmotaxis, bør bemærkes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den MWM opgave er almindeligt anvendt til at vurdere rumlig indlæring og hukommelse. Imidlertid kan robustheden af denne opgave være påvirket af mange faktorer og kræver optimering til både baggrund stamme og testmiljø. Som vist i figur 4, samme uddannelse protokol og anvendt visuelle signaler, der anvendes i to forskellige test værelser (tilsvarende størrelse og layout) gav væsentligt anderledes sonde ydeevne. Da mange funktioner i test værelse kunne bidrage til rumlig tidskoder 4, blev det spekuleret på, at de to værelser var signifikant forskellige på en eller anden ukendt måde, som gjorde testen vanskeligere. Ved at modificere de ekstra labyrint signaler, vi har valgt til effektivt øge antallet af visuelle referencer. Desuden ved at minimere brugen af gardiner, eventuelle auditive eller olfaktoriske signaler, der måtte være kan være blevet ændret. Lysniveauet af de to test værelser var tilsvarende, men hjemmet bur lysniveauet i det nye vivarium var lavere, hvilket resultereri en højere lysniveau forskellen, når man går fra hjemmet bur til test værelse. Det er blevet foreslået, at BALB / c-mus er i stand til at udføre MWM opgave at tilvejebringe de lysniveauer er tilstrækkeligt lave 14. Men forsøg på at forbedre ydeevnen ved at sænke test værelse lysniveauer var mislykkede (upublicerede observationer). Til dato er det ikke kendt, hvad faktor (er) bidraget til faldet i ydelse i det nye testmiljø, men det modificerede pre-håndtering, signaler og uddannelse protokollen har resulteret i en betydelig stigning i sonde scoringer.
Hvis det er muligt, anbefales det at teste en gruppe af vildtype eller kontrolmus af samme baggrund stamme og alder som den planlagte eksperiment for at vurdere hastigheden af læring og optimal probe placering for den pågældende testmiljø. Ideelt er den første probe placeres når omtrent halvdelen af musene viser en sandsynlig positiv søgning bias (% -tid i target≥35) og det sidste probe, nårfleste kontrol mus viser en positiv søgning bias og har nået ydeevne plateau. Denne strategi er blevet anvendt til at bestemme probe placering for overlegen kunstnere (F1 FVB / N x 129S6) og en baggrund, som lært langsommere (blandet C57BL / 6 x FVB / N x 129S6), hvor ca. halvdelen af musene havde målkvadranten occupancies af ≥35 efter 8 forsøg eller 18 forsøg med henholdsvis en gruppe betyde ca. 35% -tid for første sonde. Efterfølgende sonder bør være højere end den første, hvis indstillet på denne måde, ideelt med mindst 15 point forskel i forhold til baseline på 25% -tid. Hvis man sammenligner probe scores som moderat lav (~ 35% -Tiden), sikre, at dette udgør en betydelig skævhed til målet og dermed et gyldigt forskel, ved at sammenligne målet til ikke-target kvadranter 4,5. Desuden bør den mindste gruppe middelværdi ikke være væsentligt lavere end 25% -tid i målet kvadrant, som ville blive betragtet baseline eller chance ydeevne. Sammenligning Target ikke-target belægning kan bidrage til at identificere, om der er rum systematiske fejl, fx mus bruger mere tid i den modsatte kvadrant end nogen af de tilstødende kvadranter ville være en uventet søgemønster.
Nogle anbefalinger mens udførelse test omfatter begrænsning af antallet af mennesker, tester hver kohorte af dyr til 1 person til at reducere variation i håndtering og afprøvning stilarter mellem eksperimentatorer, og udfører test på omkring samme tid hver dag. Det har også været foreslået, at mus, der modtog 2 forsøg pr dag lærer nær så hurtigt som dem, der modtager 4 forsøg per dag 15. Det er vigtigt, at dyr fra forskellige stammer / baggrunde / behandlingsgrupper være repræsenteret i hver test gruppe, hvis mere end én kohorte skal køres i løbet af en dag. Endelig skal der sikres musene ikke bliver hypotermisk, som hypotermi kan påvirke ydeevnen og er sex og baggrund stammen afhængige 16. Selvom the inter-trial interval anvendes her (20 min) skal være tilstrækkelig til at forhindre hypotermi, andre fremgangsmåder indbefatter tilpasning af vandtemperaturen, anbringelse musene i en opvarmet bedrift bur mellem forsøg, eller en kombination af de to efter behov. Imidlertid bør det bemærkes, at vandtemperaturen kan påvirke ydeevnen i begge retninger. For eksempel proestrous rotter klare sig bedre under varme forhold (33 ° C), mens brunst rotter klare sig bedre under kolde forhold (19 ° C) 17. Derfor skal man sørge for at kontrollere for vandtemperaturer tværs eksperimenter. Skulle hypotermi være en bekymring for et bestemt dyr, kunne forsøgslederen hånd tørre dette dyr med en køkkenrulle i tilfælde af at de undlader at soignere efter svømmetur eller give nogen indikation af hypotermisk adfærd. Periodisk vurdering af kropstemperaturen kan sikre betingelserne er tilstrækkelige til at forhindre hypotermi.
En anden proceduremæssige overvejelser vedrører synlig platform training. Yngre mus eller anden stamme kan have brug for færre synlige platform træning forsøg. En foreslået retningslinje er at træne indtil kontrolgruppen har nået gulvet i ydeevne i løbet af de sidste 3-6 på hinanden følgende uddannelse forsøg, der giver forsøgsgruppen viser tilsvarende resultater. Hvis den eksperimentelle design omfatter både unge og gamle mus, skal du indstille det synlige platform træning varighed for gruppen, som kræver det højeste antal uddannelse forsøg for at nå gulvet i ydeevne 5. Desuden kan den synlige platform være effektiv retning af acclimatizing mus til proceduren håndtering og testen og kan fjerne behovet for pre-handling, hvis musene er ikke meget ung, da først testet eller human håndtering er ikke overdrevent generende for den stamme, der testes.
Brede fordele ved Morris water maze omfatte dens relative ufølsomhed over for motivationsfaktorer i forhold til mad-baserede opgaver, dens gyldighed som et mål for hippocampus-afhængig spyttedeial navigation og reference hukommelse, og dens cross-arter effekt 15. En potentiel begrænsning af teknikken er, at fordi denne protokol er skræddersyet til en bestemt baggrund stamme, kan det ikke være effektiv med andre dyr eller andre baggrund musestammer. Derudover, som en del af protokollen, er gjort forsøg på at skabe og strategisk placere identificerbare tidskoder hele mazing værelse. Det er imidlertid uklart, hvad højden er optimal, når du placerer tidskoder rundt i lokalet. Således tidskoder, der er store og kan skelnes fra hinanden er nødvendige for effektiv uddannelse.
Sammenfattende kan optimere MWM opgave til anvendelse med en særlig baggrund stamme og testmiljø øge det dynamiske område af opgaven, hvilket resulterer i en betydelig tids- og omkostningsbesparelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences (Reed / Engler-Chiurazzi - U54GM104942), det nationale institut for Neurologiske og Stroke (Ashe - R01NS33249, R01NS63249 og R01NS79374), Cobre (Engler-Chiurazzi - P20GM109098), den Alzheimers Association (Reed - NIRG-12-242187), en WVU Faculty Research Senatet Grant (Reed), en WVU PSCOR tilskud (Reed), og interne midler fra WVU College of Medicine Dean kontor (Engler-Chiurazzi). Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NIH eller Alzheimers Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viewer Tracking software | Biobserve | This particular software is not a requirement - there are other tracking systems available | |
| Pre-handling pool | Dimensions approximately 1 foot wide x 2 feet long x 1.5 feet deep | ||
| Plastic beaker | 1 L | ||
| Scoop | |||
| Small net | |||
| Stopwatch | |||
| Non-toxic white tempera paint | Any color paint can be used; however, most tracking software programs require that the paint contrast with the color of the animal. | ||
| Visible platform | Color should contrast that of maze | ||
| Curtain rod | |||
| Curtains | |||
| Circular tub | Usually white in color; approximately 4 feet in diameter | ||
| Hidden platform | Painted same color as the water |
References
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). The Journal of Neuroscience. 25, 10637-10647 (2005).
- Attar, A., et al. A shortened barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 8, e80355 (2013).
- Johnson, J. M., Bailey, J. M., Johnson, J. E., Newland, M. C. Performance of BALB/c and C57BL/6 mice under an incremental repeated acquisition of behavioral chains procedure. Behavioural Processes. 84, 705-714 (2010).
- Crawley, J. N. What's wrong with my Mouse Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 1st edition, Wiley-Liss. 94-95 (2000).
- Westerman, M. A., et al. The relationship between abeta and memory in the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of Neuroscience. 22, 1858-1867 (2002).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60-90 (2001).
- Santa Cruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309, 476-481 (2005).
- Hunsberger, H. C., et al. Effect size of memory deficits in mice with adult-onset P301L tau expression. Behavioural Brain Research. 272, 181-195 (2014).
- Yue, M., Hanna, A., Wilson, J., Roder, H., Janus, C. Sex difference in pathology and memory decline in rTg4510 mouse model of tauopathy. Neurobiology of Aging. 32, 590-603 (2011).
- Sandi, C. The role and mechanisms of action of glucocorticoid involvement in memory storage. Neural plasticity. 6, 41-52 (1998).
- Hölscher, C. C. impairs performance in spatial water maze learning tasks. Behavioural Brain Research. 100, 225-235 (1999).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 11, 47-60 (1984).
- Reed, M. N., Liu, P., Kotilinek, L. A., Ashe, K. H. Effect size of reference memory deficits in the morris water maze in Tg2576 mice. Behavioural Brain Research. 212, 115-120 (2010).
- Huang, Y., Zhou, W., Zhang, Y. Bright lighting conditions during testing increase thigmotaxis and impair water maze performance in BALB/c mice. Behavioral Brain Research. 226, 26-31 (2012).
- Baker, R. Water maze. , Available from: http://www.watermaze.org (2013).
- Ivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puolivali, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behavioural Brain Research. 141, 207-213 (2003).
- Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
