Introduction
Transgene musemodeller har vært medvirkende til å evaluere patofysiologien ved Alzheimers sykdom (AD), så vel som potensialet for terapeutiske intervensjoner. Kognitive oppgaver, slik som Morris vannlabyrint (MWM), blir ofte brukt med disse modellene for å identifisere de molekylære korrelater hukommelsessvikt og for å vurdere effekten av pre-kliniske medikamenter. Det avgjørende er imidlertid at det dynamiske området for den kognitive oppgaver være bred nok til å detektere subtile behandlingseffekter. Med musemodeller av AD, kognitiv svikt er vanligvis aldersavhengig, og mus viser progressive nedgang i ytelse (f.eks 1). Bruk av en følsom kognitiv oppgave kan tillate deteksjon av små forskjeller tidligere i dyrets liv, og dermed redusere kostnadene forbundet med aldring dyr. For eksempel å redusere antall treningsforsøk i hippocampus-avhengig Barnes labyrint 15-5 økt vanskelighetsgraden av oppgaven, noe som resulterer i detection av underskudd i 3xTg modellen i en tidligere alder enn tidligere rapportert to. Tidligere deteksjon av underskudd tilbyr ikke bare mye tid og kostnadsbesparelser, det øker også sannsynligheten for at de molekylære endringer liggende kognitiv svikt kan identifiseres.
En faktor som påvirker følsomheten av kognitive oppgaver er den genetiske bakgrunnen stamme av musemodell. For eksempel BALB / c-mus utviser overlegen ytelse i læring og hukommelsesoppgaver i forhold til andre stammer, slik som C57BL / 6 3. F1 FVB / N x 129S6 bakgrunn brukes til to av de mest anvendte modeller av AD, den Tg2576 og RTG (TauP301L) 4510-modeller. Denne belastningen viser overlegen læringsevne i MWM forhold til andre stammer, inkludert B6 / SJL mus fire. På grunn av denne overlegne læringsevne, kan bruk av en enkelt sonde etter omfattende opplæring maskere gruppeforskjeller som følge av over-trening. I tillegg følsomheten værey av probe forsøk kan være aldersavhengig. Vi har tidligere vist at tidligere sonde studier etter begrenset skjult plattform trening, er mer følsomme for forskjeller i ung Tg2576 sammenlignet med unge transgene-negative kull kontroller enn er probe forsøk satt inn etter mer omfattende opplæring fem. I kontrast probe forsøk følgende omfattende opplæring er mer sensitive eldre (20-25 mnd) Tg2576 mus sammenlignet med eldre søsken enn er tidligere sonde prøvelser 5. Ved spredt probe studier gjennom trening, er sannsynligheten for at en følsom prøve vil bli identifisert økes, særlig hvis langsgående testing er utført, og følsomheten for en spesiell sondeprøve er aldersavhengig. Figur 1 viser den overlegne ytelsen til F1 FVB / N x 129S6 mus i henhold til den protokoll som er optimalisert for denne stamme, sammenlignet med mus av B6 / SJL bakgrunn trent i henhold til en protokoll med mer omfattende opplæring.
Den MWM ergenerelt antatt å gi pålitelige tiltak som er reproduserbar tvers av både tid og laboratorier 6. For eksempel ble det primære protokollen opprinnelig brukt av vår Minnesota laboratorium 1,7 implementert med mindre modifikasjoner på West Virginia University 8. Tilsvarende ble tilsvarende nivåer av verdifall observert i RTG (TauP301L) 4510 mus i forhold til å kontrollere littermates hvis holdt under patogenfrie eller konvensjonelle betingelser ni. Imidlertid kan testomgivelsene påvirke sensitiviteten av MWM oppgaven. Faktorer som rommets belysning, luftventiler, temperaturgradienter, og lyder som alle bidrar til miljømessige signaler fire som kan til slutt påvirke ytelsen. Ved vårt laboratorium og Minnesota vivarium ble flyttet til en ny bygning, opp til en 38% reduksjon i vill-type ytelse ble observert, vesentlig redusere det dynamiske område av oppgaven og evnen til å påvise transgene-relaterte mangler. Denne endringen i performance skjedde til tross utforme testing rom for å være av tilsvarende størrelse og konfigurasjon, og bruker det samme gjelder visuelle signaler. En "re-optimalisering" av den opprinnelige protokoll var nødvendig for å øke det dynamiske område for det MWM oppgave i det nye testmiljøet.
Her den opprinnelige protokoll tilpasset for bruk med F1 FVB / N x 129S6 bakgrunn 5 er beskrevet. Fordi noen studier tyder på stress er forbundet med dårlig ytelse MWM 10 og pre-håndtering kan lindre dette stress-indusert underskudd i ytelse 11, ble en pre-håndteringsprotokoll utviklet for å akklimatisere musene til innføring og fjerning av bassenget før MWM testing . Etter pre-behandling, mus gjennomgå trening synlig plattform, hvor en hevet plattform er merket med et flagg. Synlig plattform trening brukes til å identifisere mus med ytelsesproblemer knyttet til sensorimotor unormalt. Ved hjelp av eksklusjonskriteriene er beskrevet i prot§ ocol, performance-inkompetente mus blir fjernet fra påfølgende undersøkelser av skjult plattform trening og sonde prøvelser. Svekkelser i skjulte plattformen opplæring og sonde studier tolkes som kognitiv svikt fordi sensorimotoriske ytelse er tatt ut av dataene. Etter fullførelse av synlig plattform trening, mus begynne skjult plattform trening hvor plattformen er nedsenket i vann, og forblir i den samme posisjon i forhold til eksterne signaler. Studier der plattformen er fjernet (probe studier) er ispedd hele skjult plattform trening for å vurdere påvirkning av ytterligere opplæring. Fordi sonde forsøk skjer ved begynnelsen av hver dag, før ytterligere skjult plattform trening, sonde forsøk måler evnen til dyret å huske plasseringen av plattformen etter en 20 timers forsinkelse, ansett som et mål for referanselageret 12. Til slutt, hvordan denne originale protokollen ble re-optimalisert når endringer i testmiljøetforstyrret kontroll ytelse er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med kravene i den Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og godkjent av West Virginia University IACUC.
1. Pre-håndtering
- Sett opp Pool
- Rekvisitt pre-håndtering bassenget, så det er hevet til en komfortabel høyde.
- Plasser 2 l vann (21 ° C) i pre-håndterings basseng til et nivå på omtrent 1 cm.
Merk: Ikke legg fargelegging.
- Prosedyre
- Ta med mus fra vivarium til testing rommet.
- Kontroller emnet identifikasjon (fagkode, hale tatovering, øre klipp, osv.).
- Mark musens hale med en permanent markør for å skille mus i buret som har gjennomgått forhånds håndtering testing fra dem som gjenstår å bli testet. Merke alle mus i ett bur med samme farge.
- Plasser en mus i overføringen beger for den tilnærmettely 5 sek. Deretter helles forsiktig på musen ut av begeret til den pre-håndterings bassenget.
- Ved hjelp av en timer, lar musen til å forbli i bassenget i 20 sekunder.
- Etter 20 sek, forsiktig plassere scoop (uten fiske det) foran musen. Kort fortalt lar musen til å utforske scoop, og om nødvendig, oppfordrer musen for å få på scoop ved å forsiktig skyve scoop under muse mens sakte løfte. Pass på å ikke skremme mus med scoop.
- Når musen er i scoop, transportere den tilbake til driftsenheten buret.
- Gjenta disse prosedyrer for hver mus i buret en gang per dag i 10 dager. Med jevne mellomrom (for eksempel etter hvert dyr), plukke opp fecal Boli og sengetøy fra bassenget ved hjelp av et nett.
- Skyll overførings beger med vann med jevne mellomrom (for eksempel etter avslutning av et bur av mus).
- Når disse trinnene er fullført, skyll overføring beger med vann flere ganger, dumpe ut vann frabassenget, og skyll bassenget omtrent to ganger med vann.
2. Synlig Platform Training
- Oppsett Mouse Ytelse Tracking Software f.eks Viewer (se tabell for material).
- Kalibrere video å matche dimensjonene av labyrinten under "Configuration" - "Filtre og Objects" -kategorien.
- Sette filtre, slik at programvaren kan skille en mus fra bakgrunnen.
- Juster "følsomhet" under "Bakgrunn filter" område slik at sporing identifiserer dyret.
- Klikk på "godta" alternativet når sporing identifiserer dyret. Velg "Rediger" til blackout områder utenfor labyrinten området.
- Velg riktig "animal filter" og "min. dyr size ".
- Opprette Run Sheets <ol>
- Opprett en løpetur ark notering hver mus, hver potensiell plassering, og en plass for notater som inneholder informasjon om avvikende atferd.
- Forhåndsbestemme stedene for det synlige plattformen testen som er den samme for hver gruppe av mus. Således, for den første prøve, pre-fastslå at plattformen vil bli plassert på motsatt side av der mus blir plassert inn i labyrinten, på høyre side i nærheten av veggen. For det andre forsøket, pre-fastslå at plattformen vil bli plassert på et annet sted langs bakveggen for hver mus, og at dette vil fortsette for hver av de 6 forsøkene.
- Hang gardiner rundt i rommet slik at eventuelle romlig og er skjult.
- Plasser karet slik at det samsvarer med konfigurasjonen i sporing ved å sikre labyrinten passer med oppsettet konfigurasjonen på "Configuration" - "Zone definisjon" -kategorien. Merk: Det helps å sikre karet er på riktig sted før du fyller den med vann som karet er ikke lett flyttet en gang fylt.
- Fyll badekaret med vann fra springen, og ved hjelp av et termometer, sikre vanntemperaturen er ca 21 ° C. Pass på at vannet holder seg innenfor en grad av temperaturen gjennom testing, så kaldere vann kan påvirke ytelse, spesielt når du bruker eldre mus åtte.
Merk: Ikke legg fargelegging. - Ved hjelp av de forutbestemte steder, plassere plattformen, som har en montert flagg som når en høyde på 13 cm og er 4,5 cm x 4,5 cm med en fet "S" -formet karakter preget på den, i den første plasseringen av karet, slik at den er omtrent en tomme over overflaten av vannet.
- Ta første musen fra buret, verifisere emnet identifikasjon, markere halen ved hjelp av en permanent markør for riktig farge, og plasser i begeret.
- Forsiktig plassere mouse inn i karet, starte tidtakeren, og sørge for at sporingsprogramvare sporer dyret. Tillat musen opp til 2 min for å lokalisere plattformen. Når musen lokaliserer plattformen, at musen 20 sekunder på plattformen.
- Hvis dyret finner plattformen og fortsetter å hoppe eller falle av, scoop musen og plassere musa på plattformen. Hvis musen fortsetter å hoppe eller falle av plattformen, hold muse på plattformen, slik at mus lærer at gjenværende på plattformen fører å flykte fra karet.
Merk: Musen bør forbli på plattformen for en kombinert tid på 20 sekunder; Dermed, hvis musen hopper av etter 5 sek, er mengden av tiden som er igjen på plattformen i 15 sekunder og ikke tilbakestilt til 20 sek. - Hvis dyret ikke finne plattformen i 2 min periode, scoop musen og plassere den på plattformen for 20 sek.
- Etter 20 sek på plattformen, fjerne musen fra plattformen som gjøres i pre-håndtering trening og plassere musen i the oppvarmet bur foret med papirhåndklær og varmet opp til ~ 31 ° C ved en varmepute og varmelampe i 30 sek. Utføre periodisk vurdering av kroppstemperaturen med en rektal termometer for å sikre at visse stammer av mus eller mus i en viss alder ikke er differensielt utsatt for hypotermi indusert ved eksponering til vann.
- Etter 2 min til holde bur med varmelampe, overføre musen til holde bur med bare en varmepute, men ingen varme lampe, for å gjenopprette mellom studier. Til slutt, plassere alle musene fra et enkelt hjem bur i samme driftsenhet bur under testing.
- Rengjør labyrint av rusk med en netto etter hver mus har gjennomført en prøveperiode, for å forstyrre olfactory signaler.
Merk: Plattformen vil forbli på samme sted for hver mus i løpet av et enkelt forsøk og vil bliflyttet til den andre forutbestemte steder for de etterfølgende forsøk. Dette gjøres for å sikre at mus 1) lære det er en plattform for å flykte fra, 2) svømme direkte til synlig plattform, og dermed demonstrere intakt visuell kompetanse, og 3) har ingen motor underskudd.
Merk: bruk av en hånd tidsur kan også være fordelaktig for å sikre nøyaktigheten av sporing.
3. Morris Water Maze Hidden Platform Training
- Set opp rommet
- Henge opp gardiner i rommet for å skjule, romlig og i laboratoriet.
- Plasser pekepinner strategisk på gardinene. Pass på at signaler er stort og inneholder kontrasterende farger (ex .: sort og hvit) for bedre synlighet. Hang signaler på avstand og høyde der de er synlige for mus fra innsiden av karet. Merk: signaler er statisk og beveger seg ikke i løpet av testing.
- Oppsett Mouse ytelse sporing programvare
- Kalibrere video å matche dimensjonene av labyrinten under "Configuration" - "Filtre og Objects" -kategorien.
- Sett filtrene slik at programvaren kan skille musene fra bakgrunnen.
- Bruk samme fremgangsmåte som beskrevet i det synlige plattformen testing (trinn 2.1.2.1-2.1.2.3) for å sette opp filtre for Morris vannet labyrint skjult plattform trening.
- Lag fire like kvadranter inne i labyrinten
- Klikkden "Ellipse" under "Zone Definition" -kategorien først, og lage en sirkel som passer labyrinten på skjermen. Merk: I denne kategorien er selve labyrinten satt opp vises, så det gjør at muligheten til å matche datamaskin oppsett med selve labyrinten oppsett.
- Klikk på "rektangel" og lage fire like firkanter. Plasser disse rutene på skjermen for å opprette fire like kvadranter innenfor den nyopprettede sirkel.
- Lag plattformene i labyrinten.
- Velg "Ellipse" alternativet, og lage en sirkel på størrelse med plattformen som skal brukes. Merk: Plassering plattformen i labyrinten på forhånd kan være gunstig for å skape en ellipse den nøyaktige størrelsen på plattformen.
- Plasser den nylig skapte plattformen sted i midten av målet kvadrant. (Det anbefales å nevne dette objektet "mål" for å skille de riktige plattformene fra resten). Kritisk punkt: I boksen bare below "Grid", velg "stopp" under "trigger" for målet plattformen. Dette vil føre til at programmet stanse når musen når plattformen.
- Lag tre andre identiske plattform områder, og plassere dem i den eksakte steder i de andre kvadrantene. Ikke velg "stopp" i "trigger" alternativet.
- Opprette Run Sheets
- Opprett en løpetur ark notering hver mus, hvert forsøk, en plass til å skrive ned tiden for å komme til plattformen, og en plass å merke seg avvikende atferd (tabell 1).
- Forhånds bestemme avgivelsespunktet for hver mus i en pseudotilfeldig måte. Bruk pseudo-tilfeldig utvalg, slik at avstanden til plattformen er lik hver dag, hver av de fire stedene er brukt like, og vinkelen fra start til plattformen (dvs., Fra venstre eller høyre) blir balansert i og mellom dager.
Merk: plasseringen av plattformen på rømmenark for å sikre plasseringen av plattformen ikke beveger seg fra den opprinnelige posisjonen. Sørg for at plattformen er i sentrum av en av de fire sonene som ble opprettet på sporing.
Merk: Hvis lengde testing blir utført ved ulike aldre, flytte plattformen til en ny plassering i hver alder.
- Sett opp Maze
- Juster enten vannet labyrint eller kameraet slik at det er en kamp mellom labyrinten og oppsettet konfigurasjonen på "Configuration" - "Zone definisjon" -kategorien.
- Merke de fire usett kvadranter av labyrinten (N, S, E, W). Sjekk at disse samsvarer med konfigurasjonen i sporing programvare for å sikre mus blir løslatt fra riktig utgangspunkt.
Kritisk Step: Plasser disse etikettene utenfor labyrinten og ut av visning av en svømme dyr gitt at signaler innenfor labyrinten utgjør en ikke-romlig, ikke-hippocampus avhengig oppgave. - Fyll labyrinten med springen water (ca. 21 ° C), slik at plattformen er omtrent 5 mm under overflaten av vannet.
- Plasser plattformen i det forhåndsbestemte stedet.
Merk: Plasseringen av plattformen vil være den samme for alle mus blir testet på tvers av alle dager og prøvelser. - Bruk giftfri hvit tempera maling for å gjøre vannet ugjennomsiktig. Gjør dette for å sikre at toppen av plattformen er usynlig fra dyrenes øyehøyde når du svømmer.
- Prosedyre
- Ta musen fra buret, merk halen ved hjelp av en permanent markør for riktig farge, og plasser i begeret.
- Forsiktig helle musen inn i labyrinten, slik at den kommer inn mot veggen. Merk: Hver mus vil bli plassert i samme startposisjonen for en unik studie.
- På den første utgivelsen av musen, begynner timeren og stå i et område der testeren ikke er lett synlig ved musene. Sikre at dyr sporing programvare er riktig å spore dyret. Når dyret når plattformen la den forbli på plattformen i 15 sekunder.
Merk: Dette gjør det mulig for dyret til å orientere sin romlige beliggenhet i rommet. - Etter 15 sekunder på plattformen, fjernes dyret fra labyrinten og returnere musen til den oppvarmede buret.
- Hvis musen finner plattformen og fortsetter å hoppe eller falle av før 15 sek, scoop mus og plassere den på en plattform for resten av 15 sek, slik at musen lærer å forbinde plattformen med unnslippe.
- Hvis musen lokaliserer ikke plattform innen 60 sekunder, forsiktig scoop musen og plassere den på plattformen. La den forbli på plattformen i 15 sekunder, og deretter fjerne dyret med scoop og bringe den tilbake til det oppvarmede buret.
- Rengjør labyrint av rusk med et nett for å forstyrre olfactory signaler.
- Gjenta disse prosedyrene for de resterende mus i gruppen. Derfor, for testing dager 4 til 9, gjennomføre fire forsøk med skjult plattform togeting per dag med ca 20 min mellom hvert forsøk.
- Endre start plassering pseduorandomly for hvert forsøk. Dermed under rettssaken 1, slipper alle mus fra samme startposisjonen, og deretter gjenta prosedyren fra en annen startposisjon for de påfølgende forsøkene. Hver dag, varierer utgivelsen poeng for å sikre dyr ikke utvikler en ikke-romlig, ikke-hippocampus avhengig motorisk strategi. For eksempel, hvis mus blir løslatt fra N, S, E og W poeng på dag én, ikke slipp dem i samme rekkefølge neste dag.
- Under skjult plattform trening, bruke dyret sporing programvare for å måle latency å nå plattform, veilengden av dyret, og andelen av tid eller distanse dyret bruker i hver labyrint kvadrant. Få disse målingene fra "Vann labyrint" -kategorien under "Experiment list" og kan eksporteres direkte til et Excel-regneark.
Merk: bruk av en hånd timer sikrer riktigheten av sporingsprogramvare.
4. Probe Trials
- Oppsett Mouse ytelse sporing programvare
- Bruk av de samme prosedyrer som i Morris vannlabyrint skjult plattform prosedyre (trinn 3.2.1-3.2.4.3) med ett unntak. Kritisk punkt: For probe studier sikre "stopp" alternativ for "trigger" er slått av under sonde prøvelser. Dette vil hindre at programmet stopper når en mus krysser plattform området.
- Opprette Run Sheets
- Opprett en løpetur ark notering hver mus, hvert forsøk, og en plass å merke seg avvikende atferd. Forhånds bestemme avgivelsespunktet i løpet av sonde forsøkene slik at de alternerer mellom de to motstående sider av plattformen. Således forhånds bestemme avgivelsespunktene slik at mus ikke blir frigjort fra de to sidene som er tilstøtende til plattformen.
- Prosedyre
- Gjennomføre probe studier ligner skjult plattform trening, med excepning at ingen plattformen er i labyrinten.
- Slipp en mus fra en forhåndsbestemt utgivelse punkt. Under sonden rettssaken, fjerne plattformen og musen har 60 sekunder å svømme i labyrinten.
- Under testing gjennomføre fire probe studier. Alter utgivelsen poenget med musene mellom sonden prøvelser. Således endrer frigjøringspunktet for strømsonden prøve fra den forrige sonden forsøket.
- Under forsøkene probe ved å bruke dyr sporing for å spore veilengden av dyret, den prosentandel av tiden dyret bruker i hver kvadrant av labyrinten og antallet ganger et dyr svømmer over tidligere platformed området. Få tak i disse målingene fra "Dataanalyse" -fanen og "Water labyrint" -kategorien under "Experimental list", og eksportere direkte til et Excel-regneark.
Merk: bruk av en hånd tidsur kan også være fordelaktig for å sikre nøyaktigheten av sporing. - Gjennomføre en sonde rettssak førskjult plattform trening på dager 6, 7, 8 og 10. (figur 2). Etter disse granskings studiene, gjennomføre fire forsøk med skjult plattform trening hver dag. Dermed utføre en sonde første, umiddelbart etterfulgt av skjult plattform opplæring for alle mus som bruker de samme prosedyrene som er beskrevet i kapittel 3. I kontrast, ikke foreta ytterligere skjult plattform trening etter sonden rettssak på dag 10.
5. Analyser
- Synlig Platform Training
- Gjennomføre gjentatte målinger ANOVAs separat for (a) veilengde, (b) latens for å finne plattformen, og (c) å svømme hastighet, med transgene (eller en annen variabel, som for eksempel behandling) som mellom-variabel og gjenstand dager eller trening blokker så innen-faget variabel. Merk: For mer komplekse konstruksjoner, kan en konsultasjon med en statistiker være nyttig. Se 8,13 for informasjon om gruppestørrelser tilstrekkelig til å skikkelig drive denne oppgaven med vanlig brukte modeller av Alzheimer7 sykdom.
- Ytelse Inkompetanse
- Identifisere prestasjons inhabil mus, inkludert mus som viser visuell eller motor inkompetanse, eller dyr som ikke erverver saksbehandlings komponentene i testen, og fjerne disse musene fra påfølgende statistiske analyser av skjult plattform og probe ytelse.
- Beregn gjennomsnittlig ventetid og svømme hastighet for den siste dagen av synlig plattform opplæring for hver mus. Fjern mus med midler to standardavvik over gruppen mener, da dette kan være en indikasjon på motor eller synshemmede.
- Identifisere og fjerne mus unnlater å orientere til eller følge flukten scoop, eller mus utviser avvikende atferd, som kork-skrue svømming eller flytende.
- Identifisere prestasjons inhabil mus, inkludert mus som viser visuell eller motor inkompetanse, eller dyr som ikke erverver saksbehandlings komponentene i testen, og fjerne disse musene fra påfølgende statistiske analyser av skjult plattform og probe ytelse.
- Morris Water Maze Hidden Platform Training
- Gjennomføre gjentatte målinger ANOVAs på (a) veilengde, til (b) latens finne skjulte plattformen, (c) svømme hastighet, og (d) prosent tid eller prosentavstand i kvadrant med transgenet som mellom-faget variabel og prøvelser som innen-faget variabel.
- Probe Trials
- Swim hastighet
- Gjennomføre gjentatte tiltak ANOVAs på svømmetur hastighet over probe forsøk med transgenet som mellom-faget variabel og prøvelser som innen-faget variabel.
- Plattform krysset index
- Bruke sonden rettssaken konfigurasjon for hver mus, er plattformen krysset indeks (PCI) beregnes ved hjelp av følgende formel: PCI = antall ganger musen krysser målet beliggenhet - gjennomsnittlig kryssinger av tilsvarende plassering i de andre tre kvadranter.
Merk: Dette blir utført for å bestemme hvorvidt mus er ved hjelp av en romlig søkestrategi, som antydet med flere kryssinger over trent plattformen, eller et ikke-romlig formasjonen thigmotaxic svømming, som antydet med omtrent like store Overganger enn alle fire steder. - Conduct gjentattTiltak ANOVAs på PCI med transgenet som mellom-faget variabel og prøvelser som innen-faget variabel.
- Bruke sonden rettssaken konfigurasjon for hver mus, er plattformen krysset indeks (PCI) beregnes ved hjelp av følgende formel: PCI = antall ganger musen krysser målet beliggenhet - gjennomsnittlig kryssinger av tilsvarende plassering i de andre tre kvadranter.
- Prosent tid eller prosent avstand i kvadrant
- Beregn prosent tid eller avstand hver mus tilbringer i de fire kvadranter av labyrinten. Gjennomføre gjentatte tiltak ANOVAS på prosent av tiden, eller distanse, med transgenet som mellom-faget variabel og prøvelser som innen-faget variabel. Bruk prosent tid til å avgjøre hvorvidt en romlig søkestrategi blir brukt; Funnene i ca 25% tid i målet kvadranten indikere mus utfører på sjansen nivå og ikke bruker en romlig søkestrategi.
- O / N glemme
- Sammenlign ventetid på plattformen området krysset på sonden rettssaken til ventetid for å finne plattformen på den siste rettssaken mot gårsdagen. Merk: Hvis latency av plattformen krysset på sonden rettssaken er betydelig lengre enn ventetid for å finne den plattform;m under den siste rettssaken mot skjult plattform på forrige dagen, da O / N glemme av plattformen plasseringen skjer.
- Swim hastighet
- Post hoc-analyse
- Følg betydelige RMANOVAs med post hoc sammenligninger av transgenet ved hvert forsøk.
6. Eksempel på Re-optimalisering for en ny testmiljø
- Pre-håndtering. Gjennomføre pre-håndtering i huset rommet. Plassere merdene uten lokk på en transportvogn for hele økten.
Merk: Mål for modifisering av pre-håndteringsprosedyre er til mer gradvis introdusere Gafler manipulasjoner og eksponering for transportinnretninger (beger og scoop) og for å øke tiden mus er i hjemmet buret uten mikroisolatorbur lokk og utsiden av buret i en åpne feltet og lysere lysforhold.- Dag 1 og 2
- Tillat mus for å akklimatisere seg til hendene være i buret, etterfulgt av milde rørende, Etterfulgt av å bli løftet for tatoveringen inspeksjon og merking av halen. Starter på dag 2 av pre-håndtering, plassere supplerende reirmateriale i buret for å gi ekstra materiale for reir bygg og husly mens øyelokkene har blitt fjernet 9.
- Dag 3 og 4
- Plasser transport beger, scoop, og av den synlige plattformen i pre-håndtering boks flagget og la mus til å lete etter to forsøk på 2 min per rettssaken.
- Ikke bruk vann i denne protokollen under pre-håndtering. Snarere sikre boksen inneholder nok rent sengetøy til å dekke gulvet og er parfymert med en liten mengde av kvinnelige og mannlige skittent kull hvis begge kjønn blir testet. Endre sengetøy hver dag.
- Dag 5
- Plasser mus i pre-håndtering boks som inneholder lite skittent kull og synlig plattform flagget for tre forsøk, i 20 sekunder hver. Bruk begeret og scoop å transportere mus til og fra boksen.
- Synlig Platform Training
- Innstilt vanntemperatur ved 27 ° C (som rutinemessig anvendes for Minnesota testmiljøet).
- Returnere musene til hjemmet buret ved anskaffelse av spolt plattformen.
- Tillat mus opp til 60 sek til å erverve synlig plattform.
- Gjennomføre treninger som består av tre forsøk per dag i 5 dager.
- Hidden Platform Training
- Endre visuelle signaler. Med unntak av én stor gardin å tilsløre handler, enten eliminere eller gjøre smalere andre gardiner rundt bassenget slik som å ha en mer åpen plass. Plassere flere gjenstander om rommet (f.eks utsatt hyller, svart stoff plakat med en hvit symbol, en svart og hvit strand ball, store svarte trakter, notatbøker, og en svart utstoppede dyr), noe som resulterer i en balansert, men mer variert visuell cue- satt enn tidligere anvendt.
- Begynn skjult plattform opplæring 72 timer etter avsluttet synlig plattform Training, med et intervall på omtrent 30 min mellom forsøkene.
- Gjennomføre treninger som består av to studier i 8 dager.
- Probe Trials
- Utfør probe prøvelser 72 timer etter skjulte treningsforsøk 8, 12 og 16.Include en 3-dagers intervall mellom forsøkene 8-9, og 12-13 av trening.
- Sett sonden varigheten for 30 sek.
- Dag 1 og 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har brukt Morris vannlabyrint for å studere effektene av beta-amyloid (Tg2576 mus) og P301L mutant tau (RTG (TauP301L) 4510 mus) på romlig referanse hukommelse (for eksempel 1,5,7,8). Figur 3 representanten resultat rapportert i vår studie som undersøker effekten av voksen-utbruddet P301L tau uttrykk på læring og hukommelse 8, utnytte testing Miljø A. Å vurdere motoriske og visuelle evner, ble mus sammenlignes på tvers synlig plattform trening blokker, hvor hver trening blokk besto av 3-studier. Veilengde i synlig plattform trening var ikke forskjellig mellom kontroller og TauP301L mus (figur 3A), noe som tyder transgen positive og negative mus utviser sammenlign svømming og begge gruppene kan se visuelt (flagg) merking plattformen. Ingen mus ble identifisert som prestasjons inhabil basert på kriteriene for utelukkelse. Neste, ytelse i skjult plattform trening blokken ble sammenlignet, der hverblokk består av en dag (4 forsøk) på trening. Da musene har lært plassering av plattformen, og den veilengde tid til å finne plattformen redusert. Men veilengde var signifikant lenger i TauP301L mus sammenlignet med kontroller på hver trening blokk (figur 3B), noe som tyder romfølelse ble svekket i TauP301L mus. Fire sonde studier, hvor plattformen var fjernet, ble innimellom gjennom gjemt plattform trening og fant sted ved begynnelsen av dagen, før starten av skjult plattform trening. Dermed disse sonde forsøkene målt romlig referanse minne. Sammenligning over disse fire probe studiene Controls betydelig forbedret med ytterligere opplærings (figur 3C), som indikert ved økt tid i målet kvadrant. I kontrast, gjorde TauP301L mus ikke bedre med ekstra trening. Således, de største forskjellene mellom de to gruppene i denne aldersgruppen skjedde på sondeprøve 4. Disse data indikerer at P301L tau ekspresjoner assosiert med både romfølelse og romlige referanse hukommelsessvikt. Mens vannlabyrintoppgave kan være relativt stabil overfor noen prosessuelle forskjeller, F1 FVB / N x 129S6 bakgrunn stamme kan være spesielt følsomme for visse miljøendringer. Den første protokollen skissert ble også med hell brukes i Miljøvern B (f.eks., 1,7). Imidlertid var vill-type probe ytelse vesentlig lavere når den første protokollen ble anvendt i et tredje sted, miljø C. Gjen optimaliserte protokoll betydelig forbedret vill-type probe ytelse (figur 4).
Figur 1:. Optimalisering av protokoll for Bakgrunn Strain Wild-type 7-8 måneder gamle mus ble trent med de samme signaler og testing miljø. F1 FVB / N x 129S6 (N = 24) og B6 / SJL (N = 16) mus først fikk 18 og 24 synlige plaTForm treningsforsøk henholdsvis levert til 6 og 8 forsøk per dag hhv. Begge stammer mottatt 4 skjulte plattformen treningsforsøk per dag. For F1 FVB / N x 129S6 mus ble sonde studier utført 20 timer etter 8, 12, 16, og 24 treningsforsøk. For B6 / SJL-mus, ble proben forsøk utført 20 timer etter 12, 24 og 36 treningsforsøk.
Figur 2:. Tidslinje Mus fikk synlig plattform trening i 3 dager, 6 forsøk per dag, etterfulgt av skjult plattform trening i 6 dager, 4 forsøk per dag. Fire sonde forsøk ble utført 20 timer etter 8, 12, 16, og 24 skjulte treningsforsøk.
Figur 3: Representant Resultater for Morris Water Maze TauP301L mus som bærer den menneskelige P.301L tau genet ble undersøkt på ca 6,5 måneders alder etter tre måneder med P301L tau uttrykk (n = 41 tauP301L og n = 46 kontroller med en omtrent like mange menn og kvinner i hver gruppe). (A) veilengde i synlig plattform trening var ikke forskjellig mellom kontroller og TauP301L mus (p s> 0,05). (B) Under skjult plattform trening, TauP301L mus viste signifikant lengre pathlengths over alle trenings blokker (Transgene: F (1, 83) = 41,96, p <0,0001; Transgene × Block: F (5, 415) = 0,6141, p = 0,69 ). (C) Controls forbedret over de fire probe prøvelser, mens TauP301L mus ikke (Transgene: F (1, 83) = 29,1, p <0,0001; Transgene × Trial: F (3, 270) = 4,91, p = 0,008). Hver trening blokk besto av tre studier for synlig plattform trening eller fire prøvelser for hidden plattform trening. Tukey post-hoc-analyser: * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001. Deler av figur 3 gjengitt fra Hunsberger et al., Effect størrelsen av hukommelsessvikt i mus med voksen alder P301L tau uttrykk, Behav Brain Res, vol. 272, s. 181-95. Copyright 2014, med tillatelse fra Elsevier.
Figur 4: Probe Poeng er betydelig påvirket av Testing Environment and Training Protocol Tre grupper av tau negative F1 FVB / N x 129S6 mus trent med ulike kombinasjoner av trening protokollen og testing miljø generert vesentlig forskjellige sonde score etter 8, 12, og 16 trening. forsøk (Gruppe: F (2, 42) = 14,89, p <0,0001; Gruppe x Trial: F (4, 84) = 1,10, p = 0,36). Mus trent utnytte protokoll 1 og same sett anvendte signaler viste signifikant lavere probe score henhold Miljø C i forhold til Miljøvern B (Miljø: F (1, 25) = 28,58, p <0,0001; Miljø x Trial: F (2, 50) = 1,93, p = 0,16) . Mus trent under Miljøvern C vises betydelig høyere probe score når modifisert signaler og re-optimalisert protokoll 2 ble benyttet i forhold til mus trent utnytte de opprinnelige signaler og protokoll 1 (Protokoll: F (1, 30) = 15,32, p <0,001; Protocol x Trial: F (2, 60) = 0,91, p = 0,41) ** p <0,001, *** p <0,0001..
| Dag 1 | Morris Water Maze - Cohort: | Dato: _________ | ||||||
| Plattformen i SE kvadranten | Tester: &# 160; Starttid: Finish tid: Vann temp: | 1m max prøvetiden / 15s på plattform / * plassert på plattform | ||||||
| Gruppe 1 | ||||||||
| Trial 1 | ||||||||
| Animal ID | Merking | Cage # | End tid | Utgivelse punkt | Platform plassering | Finn plattform? | Tid | Merknader (dvs. merkelig oppførsel) |
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| W | SE | |||||||
| 20 minutters ITI | ||||||||
| Trial 2 | ||||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| E | SE | |||||||
| 20 minutters ITI | ||||||||
| Trial 3 | ||||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| N | SE | |||||||
| 20 minutters ITI | ||||||||
| Trial 4 | ||||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
| </ Td> | S | SE | ||||||
| S | SE | |||||||
| S | SE | |||||||
Tabell 1:. Hidden Platform Run Sheet Et eksempel kjøre ark der plattformen ligger i sørøst (SE) kvadrant er gitt. Eksperimentator bør skrive musens ID-nummer, noen kjennetegn på halen eller ører, og buret gruppering. Frigjørings punkt er angitt på arket, og bør være pseudo-tilfeldig bestemt som beskrevet i trinn 3.3.2. Registrere om musen finner plattformen og tid til å finne plattformen. Merkelig oppførsel, inkludert flytende eller thigmotaxis, bør noteres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den MWM Oppgaven blir mye brukt til å vurdere romlig læring og hukommelse. Imidlertid kan robustheten denne oppgaven påvirkes av mange faktorer og krever optimalisering for både bakgrunn belastning og testing miljø. Som vist i figur 4, samme opplæring protokollen og anvendt visuelle signaler som brukes i to forskjellige test rom (tilsvarende størrelse og layout) ga signifikant forskjellig probe ytelse. Siden mange funksjoner i testrommet kan bidra til romlig og 4, ble det spekulert i at de to rommene var signifikant forskjellig i noen ukjent måte som gjorde testen vanskeligere. I modifisere ekstra-labyrint pekepinner, valgte vi å effektivt øke antall visuelle signaler. I tillegg, ved å minimere bruken av gardiner, noen hørbar eller lukt signaler som kan eksistere kan ha blitt endret. Lysnivået av de to test rommene var tilsvarende, men hjemmeburet lysnivået i den nye vivarium var lavere, noe som resultereri et høyere lysnivå differensial når du går hjemmefra buret til testing rommet. Det har vært antydet at BALB / c-mus er i stand til å utføre den oppgaven å gi MWM lysnivået er tilstrekkelig lav 14. Men forsøk på å forbedre ytelsen ved å senke testing rom lysnivåer var mislykket (upubliserte observasjoner). Til dags dato er det ikke kjent hva faktor (er) bidro til nedgangen i ytelse i den nye testmiljøet, men den modifiserte pre-håndtering, signaler, og opplæring protokollen har resultert i en betydelig økning i probe score.
Hvis det er mulig, er det anbefalt å teste en gruppe av villtype eller kontroll mus av samme bakgrunn belastning og alder som planlagt eksperiment for å vurdere frekvensen av læring og optimal probe plassering for den aktuelle testmiljøet. Ideelt sett er den første proben plasseres når omtrent halvparten av musene viser en sannsynlig positiv forspenning søk (% -Tid i target≥35) og den siste sonde nårde fleste kontroll mus viser en positiv søk partiskhet og har nådd ytelse platå. Denne strategien har blitt brukt til å bestemme probe plassering for overlegne utøvere (F1 FVB / N x 129S6) og en bakgrunn som lærte saktere (blandet C57BL / 6 x FVB / N x 129S6), hvor omtrent halvparten av musene hadde målet kvadrant occupancies av ≥35 etter henholdsvis åtte forsøk eller 18 studier med en gruppe bety om lag 35% -time for første sonde. Påfølgende sonder bør være høyere enn det første hvis satt på denne måten, gjerne med minst en 15-punkts forskjell sammenlignet med baseline på 25% -tid. Hvis man sammenligner probe Stillingen som er moderat lav (~ 35%) -Tid, sørge for at dette representerer en betydelig skjevhet for målet og dermed en gyldig forskjell, ved å sammenligne målet med ikke-target kvadranter 4,5. I tillegg bør den minste gruppen midlere ikke være vesentlig lavere enn 25% -time i målet kvadrant, som ville bli betraktet som grunnlinje eller mulighet ytelse. Sammenligning target ikke-target belegg kan bidra til å identifisere om det er rom skjevheter, f.eks mus bruker mer tid i motsatt kvadrant enn noen av de tilstøtende kvadrantene ville være en uventet søkemønster.
Noen anbefalinger mens gjennomføre testing inkluderer å begrense antall mennesker testing hver kohort av dyr til en person til å redusere variabiliteten i håndtering og testing stiler mellom forskere, og gjennomføre testing på omtrent samme tid hver dag. Også har det vært antydet at mus som fikk to forsøk per dag lærer nesten like raskt som de som får fire forsøk per dag 15. Det er viktig at dyr fra forskjellige stammer / bakgrunn / behandlingsgruppene være representert i hver testgruppe hvis mer enn én kullet må kjøres i løpet av en dag. Til slutt må man sørge for å sikre at musene ikke blir hypotermisk, som hypotermi kan påvirke ytelsen og er sex og bakgrunn belastning avhengig 16. Selv the inter-prøveintervall anvendt her (20 min) bør være tilstrekkelig til å hindre nedkjøling, andre fremgangsmåter omfatter å justere temperaturen i vannet, å plassere musene i en oppvarmet holde bur mellom studier, eller en kombinasjon av de to etter behov. Imidlertid bør det bemerkes at vanntemperaturen kan påvirke ytelsen i begge retninger. For eksempel proestrous rotter yter bedre under varme forhold (33 ° C), mens estrous rotter prestere bedre under kalde forhold (19 ° C) 17. Således må man sørge for å kontrollere for vanntemperaturer over eksperimenter. Bør hypotermi være en bekymring for et bestemt dyr, kan eksperimentator hånd tørke det dyret med et papirhåndkle i tilfelle at de ikke klarer å stelle post-svømmetur eller gi noen indikasjon på hypotermisk atferd. Regelmessige vurderinger av kroppstemperatur kan sikre at betingelsene er tilstrekkelige til å hindre nedkjøling.
En annen prosessuelle hensyn gjelder synlig plattform Training. Yngre mus eller annen belastning kan trenge færre synlige plattform treningsforsøk. En foreslått retningslinje er å trene til kontrollgruppen har nådd gulvet i ytelse under de siste 3-6 påfølgende treningsforsøk, og gir den eksperimentelle gruppen viser tilsvarende ytelse. Hvis det eksperimentelle designet inkluderer både unge og gamle mus, sett synlig plattform trening varighet for gruppen, som krever det høyeste antall treningsforsøk for å nå gulvet i ytelse 5. I tillegg kan den synlige plattformen være effektive mot mus akklimatisering til håndtering og testprosedyren, og kan unngå behovet for pre-håndtering dersom musene ikke er meget små når først testet eller human håndtering er ikke overdrevent motvilje til belastningen som skal testes.
Brede fordeler av Morris vannlabyrint omfatte dets relative ufølsomhet for motivasjonsfaktorer i forhold til mat-baserte oppgaver, dens gyldighet som et mål på hippocampus-avhengige spatial navigasjon og referanse minne, og dens kryss arter effekt 15. En potensiell begrensning av teknikken er at, fordi denne protokollen er skreddersydd for en bestemt bakgrunn påkjenning, kan det ikke være effektivt med andre dyr eller andre bakgrunns stammer av mus. I tillegg, som en del av protokollen, er det gjort forsøk på å lage og strategisk plassere identifiserbare signaler hele mazing rommet. Det er imidlertid uklart hva eksakte høyden er optimal når du plasserer pekepinner rundt i rommet. Således signaler som er store og kan skilles fra hverandre er nødvendige for effektiv trening.
Oppsummert kan optimalisere MWM oppgave for bruk med en bestemt bakgrunn belastning og testing miljø i betydelig grad øke det dynamiske område for oppgaven, som resulterer i betydelige tids- og kostnadsbesparelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences (Reed / Engler-Chiurazzi - U54GM104942), Statens institutt for nevrologiske lidelser og hjerneslag (Ashe - R01NS33249, R01NS63249 og R01NS79374), Cobre (Engler-Chiurazzi - P20GM109098), den Alzheimers Association (Reed - NIRG-12-242187), en WVU fakultet Forskning Senatet Grant (Reed), en WVU PSCOR stipend (Reed), og interne midler fra wvu College of Medicine Dean kontor (Engler-Chiurazzi). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle utsikt over NIH eller Alzheimers Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viewer Tracking software | Biobserve | This particular software is not a requirement - there are other tracking systems available | |
| Pre-handling pool | Dimensions approximately 1 foot wide x 2 feet long x 1.5 feet deep | ||
| Plastic beaker | 1 L | ||
| Scoop | |||
| Small net | |||
| Stopwatch | |||
| Non-toxic white tempera paint | Any color paint can be used; however, most tracking software programs require that the paint contrast with the color of the animal. | ||
| Visible platform | Color should contrast that of maze | ||
| Curtain rod | |||
| Curtains | |||
| Circular tub | Usually white in color; approximately 4 feet in diameter | ||
| Hidden platform | Painted same color as the water |
References
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). The Journal of Neuroscience. 25, 10637-10647 (2005).
- Attar, A., et al. A shortened barnes maze protocol reveals memory deficits at 4-months of age in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 8, e80355 (2013).
- Johnson, J. M., Bailey, J. M., Johnson, J. E., Newland, M. C. Performance of BALB/c and C57BL/6 mice under an incremental repeated acquisition of behavioral chains procedure. Behavioural Processes. 84, 705-714 (2010).
- Crawley, J. N. What's wrong with my Mouse Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 1st edition, Wiley-Liss. 94-95 (2000).
- Westerman, M. A., et al. The relationship between abeta and memory in the Tg2576 mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of Neuroscience. 22, 1858-1867 (2002).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60-90 (2001).
- Santa Cruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309, 476-481 (2005).
- Hunsberger, H. C., et al. Effect size of memory deficits in mice with adult-onset P301L tau expression. Behavioural Brain Research. 272, 181-195 (2014).
- Yue, M., Hanna, A., Wilson, J., Roder, H., Janus, C. Sex difference in pathology and memory decline in rTg4510 mouse model of tauopathy. Neurobiology of Aging. 32, 590-603 (2011).
- Sandi, C. The role and mechanisms of action of glucocorticoid involvement in memory storage. Neural plasticity. 6, 41-52 (1998).
- Hölscher, C. C. impairs performance in spatial water maze learning tasks. Behavioural Brain Research. 100, 225-235 (1999).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 11, 47-60 (1984).
- Reed, M. N., Liu, P., Kotilinek, L. A., Ashe, K. H. Effect size of reference memory deficits in the morris water maze in Tg2576 mice. Behavioural Brain Research. 212, 115-120 (2010).
- Huang, Y., Zhou, W., Zhang, Y. Bright lighting conditions during testing increase thigmotaxis and impair water maze performance in BALB/c mice. Behavioral Brain Research. 226, 26-31 (2012).
- Baker, R. Water maze. , Available from: http://www.watermaze.org (2013).
- Ivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puolivali, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behavioural Brain Research. 141, 207-213 (2003).
- Rubinow, M. J., Arseneau, L. M., Beverly, J. L., Juraska, J. M. Effect of estrous cycle on water maze acquisition depends on the temperature of the water. Behavioral Neuroscience. 118 (4), 863-868 (2004).
