Abstract
संक्रमण और सूजन के दौरान, परिसंचारी monocytes खून छोड़ दो और वे मैक्रोफेज में अंतर जहां ऊतकों में आ जाते हैं। मैक्रोफेज सूक्ष्मजीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में विकास के माध्यम से संरक्षित आणविक पैटर्न पहचान जो सतह टोल की तरह रिसेप्टर्स (TLRs), व्यक्त करते हैं। TLRs आमतौर पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है जो बृहतभक्षककोशिका सक्रियण में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। मैक्रोफेज कई बीमारियों में महत्वपूर्ण हैं और चिकित्सा के लिए आकर्षक लक्ष्य के रूप में उभरा है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम शराब बनानेवाला है thioglycollate माध्यम का उपयोग कर murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज अलग करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। उत्तरार्द्ध तदनुसार इस 10 गुना से मैक्रोफेज उपज बढ़ा देंगे, पेरिटोनियम में monocyte प्रवास को बढ़ावा देगा। कई अध्ययनों से अस्थि मज्जा, प्लीहा या पेरिटोनियल व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग कर बाहर किया गया है। हालांकि, पेरिटोनियल मैक्रोफेज अलगाव पर अधिक परिपक्व होना दिखाया और उनके कार्यात्मक में अधिक स्थिर रहे थेअल्पसंख्यक और फेनोटाइप। इस प्रकार, murine peritoneal गुहा से अलग मैक्रोफेज अलग प्रतिरक्षात्मक और चयापचय के अध्ययन में सेवा कर सकते हैं कि एक महत्वपूर्ण सेल की आबादी प्रस्तुत करते हैं। अलग होने के बाद, मैक्रोफेज विभिन्न TLR ligands के साथ प्रेरित किया गया और फलस्वरूप जीन अभिव्यक्ति मूल्यांकन किया गया था।
Introduction
reticuloendothelial phagocytic प्रणाली ऐसी अस्थि मज्जा, रक्त, यकृत और प्लीहा के रूप में विभिन्न ऊतकों और अंगों में कोशिकाओं से बना है। मैक्रोफेज बड़े पैमाने पर वे विशेष रूप से सहज में भाग लेते हैं और नियंत्रित करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और स्पष्ट संक्रमण अनुकूली जहां शरीर, चारों ओर वितरित कर रहे हैं। मेजबान बचाव में उनकी भूमिका के अलावा, मैक्रोफेज भी घाव भरने में और ऊतक homeostasis 1,2 बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, मैक्रोफेज प्रतिरक्षा समारोह के लिए ही महत्वपूर्ण नहीं हैं, लेकिन यह भी सक्रिय रूप से लौह समस्थिति 3 में भाग लेते हैं। शरीर में लोहे का लगभग 80% वृद्ध होनेवाला मैक्रोफेज 4 से phagocytosed जो कर रहे हैं, जब एरिथ्रोसाइट्स भीतर हीमोग्लोबिन में मौजूद है। दैनिक, इन मैक्रोफेज एरिथ्रोसाइट व्युत्पन्न लोहे की 25 मिलीग्राम रीसायकल और प्लाज्मा 5 में अपने परिवहन प्रदान करते हैं। इसके अलावा, संक्रमण और सूजन के दौरान, समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज लोहा availabili कम करने के लिए सीरम लोहे के एकांत में रहनादोनों प्रणालीगत और स्थानीय स्तर 6-8 पर रोगज़नक़ों, करने के लिए Ty। मैक्रोफेज और मुख्य रूप से hepatocytes लोहे के चयापचय 9, 10 के मास्टर नियामक माना जाता है कि hepcidin नामक एक रोगाणुरोधी पेप्टाइड है कि उत्पादन के रूप में अच्छी तरह से, अध्ययन से पता चला है। Hepcidin मुख्य रूप से भड़काऊ उत्तेजनाओं की वृद्धि हुई और जीर्ण सूजन 11-13 पर बृहतभक्षककोशिका में लोहे की ज़ब्ती के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार है। मैक्रोफेज में hepcidin अभिव्यक्ति बहुत अच्छी तरह से समझ नहीं है, जैसा कि हम इस विनियमन में टोल की तरह रिसेप्टर्स की संभावित भूमिका (TLRs) का अध्ययन किया। TLRs मुख्य रूप से मैक्रोफेज पर पाया गया है और उनके सक्रियण में एक केंद्रीय भूमिका निभा रहे हैं। इसके अलावा, जिगर में एलपीएस प्रेरित hepcidin अभिव्यक्ति TLR4 13 पर निर्भर है। इसलिए, हमारे अध्ययन निष्पादित करने के लिए, हम murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज के अलगाव पर आधारित एक विधि का इस्तेमाल किया।
बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों को मोटे तौर पर बृहतभक्षककोशिका संवर्धन में इस्तेमाल कर रहे हैंएँ; फिर भी विस्तारित संस्कृति जीन नुकसान भड़काने और इन सेल लाइनों में प्रतिरक्षा कार्य में कमी आई सकता है। इस प्रकार, peritoneal गुहा से मैक्रोफेज के अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है।
माउस पेरिटोनियल गुहा मैक्रोफेज 13-15 फसल के लिए एक आदर्श स्थल प्रस्तुत करता है। पृथक murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज उनकी प्रतिरक्षा समारोह के बारे में कई अध्ययन के लिए सुविधाजनक है। हालांकि, पेरिटोनियम में मैक्रोफेज की संख्या व्यापक अध्ययन के लिए अपर्याप्त है और माउस के अनुसार लगभग 1 एक्स 10 6 मैक्रोफेज का अनुमान है। इस प्रकार, बृहतभक्षककोशिका उत्पादन को बढ़ाने के लिए, इस तरह के thioglycollate के रूप में एक बाँझ eliciting एजेंट सेल फसल पूर्ववर्ती पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्ट किया गया था। Thioglycollate इंजेक्शन के बाद, माउस प्रति मैक्रोफेज की उपज 10 गुना की वृद्धि हुई थी। मैक्रोफेज उपज, मैक्रोफेज की भर्ती, जो माँ, जिसके परिणामस्वरूप एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है कि एक अड़चन के रूप में शराब बनानेवाला है thioglycollate मध्यम कृत्यों में वृद्धि के बावजूदY लेकिन जरूरी नहीं जीन अभिव्यक्ति प्रभावित करते हैं। इसलिए, गैर इलाज मैक्रोफेज से मिलकर एक नियंत्रण समूह प्रत्येक प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए। हमारे हाथ में, अत्यधिक सूजन से प्रेरित है जो hepcidin अभिव्यक्ति पेरिटोनियल मैक्रोफेज हासिल गैर इलाज thioglycollate में पता नहीं था। इसके अलावा, पढ़ाई शराब बनानेवाला है thioglycollate कई मैक्रोफेज रंगरूटों, लेकिन उनमें से 16 को सक्रिय नहीं कर रहा है कि पता चला है। दूसरी ओर, शराब बनानेवाला है thioglycollate मैक्रोफेज लाइसोसोमल एंजाइम में वृद्धि हुई है, लेकिन किया जाता सूक्ष्मजीवों 17 की हत्या में कमी देखी गई हासिल। गैर हासिल मैक्रोफेज 16 के साथ तुलना में हालांकि, जब phagocytic क्षमता प्रभावित नहीं था।
बर्तन में संवर्धित करने के बाद, पेरिटोनियल मैक्रोफेज इसलिए पेरिटोनियल गुहा से अलग कक्षों के अन्य प्रकार से उनके अलगाव की अनुमति देता है, पक्षपाती हो जाते हैं। बाद में, अलग मैक्रोफेज अलग TLRs एगोनिस्ट के साथ चुनौती दी थी।अंत में, mRNA के संवर्धित कोशिकाओं से निकाला गया था और जीन अभिव्यक्ति मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT- पीसीआर) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं केंद्र डे अति सूक्ष्म डु केंद्र Hospitalier डे ल Université de मॉन्ट्रियल के संस्थागत पशु की देखभाल समिति (CRCHUM) के अनुमोदन के बाद पशु की देखभाल के दिशा निर्देशों पर कनाडा परिषद के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।
1. अलगाव, पहचान, और संस्कृति Murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज की
- 3.8% शराब बनानेवाला है thioglycollate मध्यम तैयार करें। ऐसा करने के लिए आसुत जल के 1000 मिलीलीटर में thioglycollate माध्यम की 38 ग्राम निलंबित करने के लिए। पूरी तरह से मध्यम भंग करने के लिए फोड़ा करने के लिए समाधान लाने के। 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा जीवाणुरहित। आर टी 18 की उम्र में, अंधेरे में 3 महीने के लिए स्टोर।
नोट: मैलापन एक जीवाणु संक्रमण को इंगित करता है जो विकसित अगर त्यागें। बाँझ रखा अगर समाधान अंधेरे में अप करने के लिए एक वर्ष के लिए रखा जा सकता है। - प्रत्येक एमओयू की पेरिटोनियल गुहा में 3.8% शराब बनानेवाला thioglycollate माध्यम से 1 मिलीलीटर इंजेक्षन, 23 जी सुइयों से जुड़ी 1 मिलीलीटर सीरिंज का प्रयोगएसई 3 दिनों के लिए इंतजार और। प्रत्येक माउस के लिए नई सिरिंज और सुई का प्रयोग करें।
- सोडियम pentobarbital (100 मिलीग्राम / किग्रा) की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों anesthetize और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों euthanize। सांस की दर की जाँच करके उचित anesthetization की पुष्टि करें। आम तौर पर तेजी से respirations माउस गहरा anaesthetized नहीं है कि संकेत मिलता है।
- 70% इथेनॉल के साथ प्रत्येक माउस के पेट धो लें। एक कैंची का प्रयोग, पेरिटोनियम के नीचे midline के साथ एक पार्श्व चीरा प्रदर्शन करते हैं।
- एक संदंश का प्रयोग, पारदर्शी पेरिटोनियल त्वचा को बेनकाब करने के लिए पेट की त्वचा वापस खींच। 20 जी सुइयों से जुड़ी 5 मिलीलीटर सीरिंज का उपयोग करना, प्रत्येक माउस के पेरिटोनियल गुहा में ठंड DPBS के 5 मिलीलीटर इंजेक्षन।
- पेरिटोनियल गुहा पर एक हल्की मालिश प्रदर्शन और फिर किसी भी अंग puncturing के बिना ध्यान से तरल पदार्थ aspirate। सुई निकालें और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों में पेरिटोनियल तरल पदार्थ के बग़ैर।
- एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र में 400 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।कोशिकाओं को पूरी प्रक्रिया के दौरान ठंड रहना चाहिए। RPMI मध्यम 1640 में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली त्यागें।
- एक hemocytometer का उपयोग, कोशिकाओं की गिनती और 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल सेल घनत्व को समायोजित करें।
- F4 / 80 के खिलाफ माउस और antibodie प्रति 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा अलग कक्षों के phenotype विशेषताएँ (एक सतह प्रतिजन मैक्रोफेज पर व्यक्त)।
2. सेल उपचार
- सीधे, अलगाव के बाद, अच्छी तरह से प्रत्येक में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा 2 के लिए उन्हें संवर्धन द्वारा 6 अच्छी तरह प्लेटों में पालन करने के लिए murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज छोड़ दें। धीरे गर्म पीबीएस के साथ 3 बार धोने से गैर पक्षपाती कोशिकाओं को निकाल दें।
- बाद में, 900 μl सीरम मुक्त DMEM में संस्कृति कोशिकाओं को निम्नलिखित TLR ligands की उपस्थिति में 24 घंटे के लिए: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0.5 मिलीग्राम / एमएल), पाली (मैं: सी) -TLR3 (10 मिलीग्राम / एमएल) ; LPS-TLR4 (100 एनजी / एमएल); flagellin-TLR5 (100 एनजी / एमएल); एफएसएल1-TLR6 / 2 (100 एनजी / एमएल); ssRNA40-TLR7 (1 माइक्रोग्राम / एमएल); ODN1826-TLR9 (1 माइक्रोन)।
नोट: प्रत्येक ligand के एक 10x शेयर समाधान के लिए तैयार करें। इस प्रकार एक 10 गुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन कर, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए बाद के 100 μl जोड़ें।
3. शाही सेना अलगाव
- एक विंदुक के माध्यम से कई बार अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1 मिलीलीटर TRIzol जोड़ने और सेल lysate पारित करके छह अच्छी तरह प्लेटें में सीधे सभी मध्यम और lyse कोशिकाओं निकालें। Nucleoprotein परिसरों की पूरी हदबंदी अनुमति देने के लिए, आरटी पर 5 से 10 मिनट के लिए homogenised नमूने सेते हैं।
- 1.5 मिलीलीटर में lysate स्थानांतरण RNase- और DNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब। 1ml TRIzol प्रति 0.2 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म जोड़ें। 15 सेकंड के लिए हाथ से सख्ती ट्यूब हिला और 5 से 10 मिनट के लिए आरटी पर उन्हें सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र। एक कम लाल चरण (फिनोल के क्लोरोफॉर्म) में अलग मिश्रण, एक interphase और एक बेरंग ऊपरी जलीय चरण का निरीक्षण करें। शाही सेना जलीय चरण में विशेष रूप से बनी हुई है।
- ट्रॅनinterphase परेशान बिना एक ताजा ट्यूब sfer ध्यान से ऊपरी जलीय चरण। Isopropyl शराब के 0.5 मिलीलीटर के साथ मिश्रण से इसे से शाही सेना वेग। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर 10 मिनट और सेंट्रीफ्यूज के लिए आरटी पर नमूने सेते हैं। शाही सेना ट्यूब के पक्ष और तल पर एक सफेद गोली गठन अवक्षेप।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें। 75% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार शाही सेना गोली धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7500 XG पर vortexing और सेंट्रीफ्यूज से नमूने मिलाएं। संक्षेप में आरएनए (10 मिनट के लिए शुष्क हवा) सूखी। 0.1 मिलीलीटर DEPC (RNase मुक्त पानी) में शाही सेना भंग और 55 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
- एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग शाही सेना यों। ऐसा करने के लिए, नमूने DEPC पानी में 100 गुना पतला और 260 एनएम के तरंग दैर्ध्य में पढ़ा। शाही सेना एकाग्रता तो हो जाएगा: आयुध डिपो 260 X 40 एनजी / उल एक्स कमजोर पड़ने कारक।
- शाही सेना सांद्रता बराबर है और सबसे पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण किट के लिए आरटी पीसीआर सिस्टम का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार सीडीएनए synthesize। जैसानिर्माता के निर्देशों के अनुसार, वास्तविक समय पीसीआर एक वास्तविक समय डीएनए का पता लगाने प्रणाली में (45 चक्रों) द्वारा जीन mRNA स्तर को मापने। उदाहरण β-actin और GAPDH के लिए दो हाउसकीपिंग जीन के साथ जीन की अभिव्यक्ति का स्तर मानक।
नोट: ML 500 माइक्रोग्राम / शाही सेना की एकाग्रता मानक के अनुसार और सीडीएनए संश्लेषण के लिए 0.5 माइक्रोग्राम का उपयोग करें।
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Representative Results
हम पहले से फ्लो द्वारा पृथक murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज होती है। ऐसा करने के लिए, हम विशेष रूप से केवल मैक्रोफेज द्वारा व्यक्त मार्करों समझते हैं कि (F4 / 80) एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। यह लक्षण वर्णन पृथक बृहतभक्षककोशिका का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए और अलगाव की प्रक्रिया के दौरान प्राप्त की कोशिकाओं के बीच अलग करने के लिए आवश्यक है। (चित्रा 1) में दिखाया गया है, कोशिकाओं का प्रतिशत F4 / 80 लगातार 95% से ऊपर हो पाया था प्रतिजन व्यक्त। इसके बाद, मैक्रोफेज में जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, अलग कक्षों कई TLR ligands के साथ इलाज किया गया: Pam3CSK4 (TLR1 / 2), एलपीएस (TLR4) और FSL1 (TLR6 / 2)। इसके बाद, Hepcidin (Hamp), ब्याज की हमारे जीन की mRNA स्तर आरटी पीसीआर द्वारा मापा गया। TLR1 / 2, (चित्रा 2) में दिखाया गया है, TLR4 और TLR6 / 2 ligands के murine मैक्रोफेज 19 में hepcidin mRNA के उत्तेजक करने में सक्षम थे। साथ में, इन परिणामों सफल करने के लिए इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता का प्रदर्शनly के murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज अलग करने और ठीक जीन अभिव्यक्ति की आणविक विनियमन जांच करने के लिए।
पेरिटोनियल गुहा बरामद मैक्रोफेज की। संवर्धन से अलग कक्षों की चित्रा 1. लक्षण CD16 / CD32 एंटीबॉडी के साथ अविशिष्ट धुंधला अवरुद्ध बाद F4 / 80 एंटीबॉडी का उपयोग प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई है और लगातार 95% से ऊपर हो पाया था।
चित्रा 2. TLR murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज में hepcidin अभिव्यक्ति को प्रेरित ligands। TLR1 / 2 के साथ murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज अलगाव और उत्तेजना के बाद, TLR4 और TLR6 / 2 ligands, hepcidin mRNA स्तर मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन से अध्ययन किया गया। डाटा SEM के ± मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं;एन डी (पता लगाने योग्य नहीं); * पी <0.05 नियंत्रण बनाम (Ctrl)। परिणाम स्वतंत्र रूप से प्रदर्शन किया 3 इसी तरह के प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं।
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Discussion
मैक्रोफेज अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं और प्रतिरक्षात्मक उद्देश्यों के लिए मेजबान हेरफेर करने के लिए एक आकर्षक लक्ष्य प्रदान करते हैं। TLRs और अन्य मान्यता के अणुओं की खोज प्रतिरक्षात्मक बहस के केंद्र के लिए मैक्रोफेज का आयोजन किया है। मैक्रोफेज साइटोकिन्स, क्षति जुड़े आणविक पैटर्न अणु (damps) 20 और रोगजनकों (PAMPs) 21 के समूहों के साथ जुड़े अणुओं सहित उत्तेजनाओं की एक किस्म है, का जवाब। ये अलग उत्तेजनाओं प्रतिक्रियाओं मैक्रोफेज सक्रियण के पाठ्यक्रम का प्रतिनिधित्व करते हैं, और आमतौर पर जीन अभिव्यक्ति 22 में अचानक परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैं।
गैर भड़काऊ स्थितियों में, मैक्रोफेज के बहुमत के शरीर में रणनीतिक स्थानों में रहते हैं। वे सभी ऊतकों में है और रक्त में monocytes परिसंचारी के रूप में पाया जा सकता है। इसलिए, मैक्रोफेज माइक्रोबियल आक्रमण के लिए सबसे अतिसंवेदनशील साइटों में मौजूद हैं।
मेजबान रक्षा एक मैं के रूप में वर्णित किया गया हैशास्त्रीय बृहतभक्षककोशिका सक्रियण के साथ जुड़े इंट्रासेल्युलर रोगजनकों के उन्मूलन के लिए nflammatory प्रतिक्रिया। मैक्रोफेज की शास्त्रीय सक्रियण इस तरह के समर्थक भड़काऊ एम 1-मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को बढ़ावा मिलेगा जो एक Th1 साइटोकाइन वातावरण में lipopolysaccharides के रूप में सूक्ष्म जैविक उत्पादों से प्रेरित है। ऊतकों को नुकसान में सूजन परिणामों की दृढ़ता और मेजबान के अस्तित्व के लिए आवश्यक विरोधी भड़काऊ तंत्र का विकास। इसलिए, Th2 साइटोकिन्स तो रोकता है और एम 1 प्रतिक्रिया को नियंत्रित करता है, जो विरोधी भड़काऊ M2-मैक्रोफेज ध्रुवीकरण की शुरूआत की अनुमति देते हैं, और यह भी ऊतकों की मरम्मत को बढ़ावा देता है। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल में, peritoneal गुहा में thioglycollate इंजेक्शन शास्त्रीय भड़काऊ झरना को बढ़ावा देने और एम 1 मैक्रोफेज की भर्ती के लिए जाता है।
तिथि करने के लिए, कई अध्ययनों से अस्थि मज्जा, प्लीहा या पेरिटोनियल व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग कर बाहर किया गया है। ये मैक्रोफेज heterogene का प्रतिनिधित्वविभिन्न गतिविधियों के साथ ous आबादी। उनकी आकृति विज्ञान और सतह आणविक विशेषताओं के आधार पर, पढ़ाई पेरिटोनियल मैक्रोफेज अस्थि मज्जा और तिल्ली व्युत्पन्न मैक्रोफेज 23 से भी अधिक परिपक्व हो रहे हैं कि स्थापना की है। व्युत्पन्न मैक्रोफेज तिल्ली के विपरीत और पेरिटोनियम, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज pahgocytosis और प्रसार में उल्लेखनीय क्षमता मौजूद है और पूरी तरह से मैक्रोफेज पूर्वज कोशिकाओं 20,24,25 से भेदभाव किया जा सकता है। इसके अलावा, अस्थि मज्जा मैक्रोफेज के अलगाव के लंबे जीवन के साथ एक समरूप उपज प्रस्तुत करता है। दूसरी ओर, इन मैक्रोफेज पूरी तरह विशेषता नहीं कर रहे हैं और प्रायोगिक अध्ययन में उनके उपयोग उनके phenotype की चंचलता के कारण जटिलताओं प्रस्तुत करता है और 26 कार्य करता है। अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज, प्लीहा और पेरिटोनियम मैक्रोफेज के विपरीत अधिक कार्यात्मक और 23 phenotypically स्थिर होने लगते हैं।
Murine पेरिटोनियल मैक्रोफेज सी की इसलिए, अलगावएक अलग प्रतिरक्षात्मक अध्ययन और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सेवा करते हैं। इसके अलावा, माउस पेरिटोनियल गुहा कटाई निवासी मैक्रोफेज 27 के लिए एक आदर्श स्थल देता है। हालांकि, हासिल संख्या उदारवादी और माउस प्रति 1 एक्स 10 6 मैक्रोफेज आसपास होने का अनुमान है। इस प्रकार, thioglycollate 3 दिन सेल अलगाव 28 से पहले पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्ट किया गया था जैसे एजेंटों eliciting, मैक्रोफेज की फसल को बढ़ाने के लिए। इस एजेंट एक भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रेरित है और तदनुसार बृहतभक्षककोशिका फसल में वृद्धि होगी।
यह किसी भी अंग puncturing के बिना धीरे धीरे पेरिटोनियल द्रव वापस लेने से पहले पेरिटोनियल गुहा पर एक हल्की मालिश प्रदर्शन करने के लिए जरूरी है। अधिक से अधिक संभव मात्रा बाहर खींच सबसे बड़ी सेल नंबर इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है। रक्त प्रदूषण के मामले में, एक lysis बफर लाल रक्त कोशिकाओं को त्यागने के लिए प्रक्रिया के अंत में इस्तेमाल किया जा सकता है। हासिल मैक्रोफेज तो प्रवाह cytometr द्वारा लक्षण वर्णन किया जा सकता है Y F4 / 80 के रूप में मैक्रोफेज के लिए अद्वितीय हैं कि एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग।
प्रक्रिया के दौरान, सभी अभिकर्मकों endotoxin मुक्त कर रहे हैं और सभी जानवरों को स्थायी रूप से विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत रखे थे कि सुनिश्चित करें। पूर्व आसन्न प्रयोगों के लिए बृहतभक्षककोशिका उत्तेजना काफी परिणामों के विश्लेषण बदल जाएगा क्योंकि रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत इस प्रक्रिया का प्रदर्शन महत्वपूर्ण है।
एक बार अलग, पेरिटोनियल मैक्रोफेज भड़काऊ साइटोकिन्स, phagocytosis, कोशिका संकेतन, जीन अभिव्यक्ति, कीमोटैक्सिस और विष विज्ञान में 29 के उत्पादन सहित कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न TLR ligands के साथ उत्तेजना के बाद, हम हासिल मैक्रोफेज में लोहे के चयापचय में नाम hepcidin की एक प्रमुख नियामक की आणविक विनियमन की जांच की। सेल उपचार के बाद 24 घंटा, कुल शाही सेना TRIzol अभिकर्मक के साथ अलग किया गया था, और जीन अभिव्यक्ति QRT- पीसीआर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था।
_content "> हम TLRs सक्रियण और जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन कर रहे हैं, सीरम मुक्त DMEM के उपयोग की सिफारिश की है। सीरम मुक्त माध्यम प्रदूषणों से डिग्री कम कर देता है और संक्रामक एजेंटों के किसी भी संभावित स्रोत को खत्म करने।शाही सेना के अलगाव के लिए एक सरल प्रक्रिया लगता है देरी, RNase और डीएनए संदूषण आरएनए गिरावट को रोकने और सटीक QRT- पीसीआर परिणाम प्राप्त करने से परहेज किया जाना चाहिए। डीएनए संदूषण का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा तरीका एक आरटी पीसीआर प्रयोग में प्रत्येक शाही सेना के नमूने के लिए एक 'शून्य-आर टी' नियंत्रण शामिल है। एक पीसीआर उत्पाद तो लिखित रिवर्स नहीं किया गया था, उत्पाद डीएनए contaminating से परिलक्षित किया गया था कि एक शाही सेना के नमूने से उत्पन्न होता है। डीएनए संदूषण के मामले में, DNase उपचार के उपयोग संभव है। यह नए संश्लेषित डीएनए नीचा नहीं करता तो यह है कि हालांकि, DNase पूरी तरह से पूर्व आरटी पीसीआर को निष्क्रिय किया जाना चाहिए।
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Acknowledgments
इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (NSERC, कोई 298,515-2011 अनुदान)। अल एक पीएच.डी. के प्राप्तकर्ता है प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, और एमएस से छात्रवृत्ति (कोई अनुदान। MOP123246 CIHR) कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान से एक अनुदान से समर्थन किया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA) | 475 | |
| Thioglycollate | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 19032-500G | |
| 70% ethanol | |||
| 10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.)) | |||
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages | WISENT INC Canada (QC) | 311-425-CL | |
| RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum). | WISENT INC Canada (QC) | 350-000-CL | |
| 1 and 5 ml syringes | BD USA (NJ) | 309659 | |
| 6-well plates | Corning Incorporated (NY, USA) | MCT-150-C | |
| Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-pm25 | |
| Polyionosine–polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLRL-PIC | |
| LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | L2880 | |
| Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FLIC-10 | |
| Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-FSL | |
| ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 μg/ml) | InvivoGen (San Diego, USA) | TLR-LRNA-40 | |
| Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 μM) | InvivoGen (San Diego, USA) | 11B16-MM | |
| TRIzol | Invitrogen, (Burlington, ON, Canada) | 15596-026 | |
| 20 G and 23 G needles | BD USA (NJ) | 305175 | |
| Scissor | |||
| Forceps | |||
| 50 ml conical tubes placed on ice | Sarstedt (Newton, MA, USA) | 62.547.205 | |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | R7757-100ML | |
| Refrigerated centrifuge | |||
| Hemocytometer | |||
| F4/80 antibody | BIO-RAD ( CA, USA) | MCA497APC | |
| CD16/CD32 antibodies | Pharmingen, {Mississauga, ON, CA) | 553141 | |
| Flow cytometer | Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA) | ||
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Axygen Scietific (CA,USA) | 3516 | |
| Chloroform | Fisher Scientific (ON, Canada) | UN1888 | |
| Isopropyl alcohol | JT Baker (PA, USA) | 70566 | |
| 75% ethanol (in DEPC treated water) | Commercial Alchohols (QC, Canada) | 17394 | |
| 0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave) | Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO) | 216.542.8 | |
| Omniscript RT-PCR system | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 205113 | |
| Rotor Gene 3000 | Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada) | ||
| QuantiTect SYBR Green I PCR kits | Qiagen, (Mississauga, ON, Canada) | 204141 |
References
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