Abstract
Foruden etablerede metoder som Western blot, der er behov for nye metoder til hurtigt og let kvantificere sygdom-associeret α-synuclein (aS D) i eksperimentelle modeller af synucleopathies. En transgen mus linje (M83) overudtrykker de humane A53T aS og spontant udvikler en dramatisk klinisk fænotype mellem otte og 22 måneder gamle, er karakteriseret ved symptomer, herunder vægttab, udmattelse, og svær motorisk svækkelse, blev anvendt i denne undersøgelse. For molekylære analyser af aS D (sygdom-associeret aS) i disse mus, blev en ELISA designet til specifikt at kvantificere aS D i syge mus. Analyse af centralnervesystemet i denne musemodel viste tilstedeværelsen af aS D hovedsagelig i kaudale hjerneregioner og rygmarven. Der var ingen forskel i aS D fordeling mellem forskellige eksperimentelle betingelser, der fører til klinisk sygdom, det vil sige, i uninoculated og normalt aldrende transgene mus og i mus podet med hjernen ekstrakter fra syge mus. Den specifikke påvisning af aS D immunoreaktivitet under anvendelse af et antistof mod Ser129 phosphoryleret aS ved ELISA i det væsentlige korreleret med den, der opnås ved Western blot og immunhistokemi. Uventet blev lignende resultater observeres med flere andre antistoffer mod den C-terminale del af aS. Udbredelsen af aS D, hvilket tyder inddragelse af en "prion-lignende" mekanisme, kan således nemt overvåges og kvantificeret i denne musemodel ved hjælp af en ELISA-metode.
Protocol
Alle de procedurer og protokoller, der involverer dyr var i overensstemmelse med EF-direktiv 86/609 / EØF, og ratificeret af kommer den franske nationale komité til overvejelse af etik i dyreforsøg (protokol 11 til 0043). Dyrene blev opstaldet og plejes i Anses er godkendt eksperimentelle faciliteter i Lyon (godkendelse B 69387 0801).
1. Fremstilling af mus
- Aflive musene ved en intraperitoneal injektion af dødelig dosis af natriumpentobarbital.
- Hent hele hjernen fra mus kraniet og læg den i en 35 mm plastik petriskål på is indtil ekstraktion.
- Uddrag livmoderhalsen rygmarven.
BEMÆRK: Uddrag aS enten fra en af hjernehalvdelene efter sagittalt sektionering eller fra dissekerede mus hjerner, tilgængelige efter forsøgene er anført i tabel 1.
| Experimentariumt | Mus Inokulum (hjerne ækvivalent) | Survival periode (Dpi) | Median / maksimal overlevelse (dage gamle) | aS d påvisning ved ELISA / WB / IHC |
| 1 | Ikke-podede mus | 441 ± 166 | 419/736 | 8/8 |
| 2 | Inokuleret mus (0,2 mg) | 150 ± 52 | 140/241 | 9/9 |
Tabel 1. Liste over forsøg udført på M83-mus. Vaccinationer udførtes ved 6 uger for eksperiment 2 i striatum kortikale område med 20 pi af en hjernehomogenat af en syg mus (1% vægt / volumen i glucose 5%), efter anæstesi af 6 uger gamle homozygote M83 mus med 3% isofluran inhalation. dpi: dage efter inoculation.
2. aS Udsugning fra hjernehalvdele
- Sagittalt sender hjernen for at få to halvdele. Hver halvdel vejer en ribolysis rør indeholdende slibning bolde.
- Forbered High Salt (HS) buffer indeholdende 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% phosphatase og protease inhibitor cocktails. Tilføj High Salt buffer til hjernehalvdelene at opnå 20% (vægt / volumen) homogenater.
- Forbered prøver fra hjernehalvdelene ved hjælp af en mekanisk homogenisator på 6,0 m / s for 23 sek to gange. Efter den første 23 sek homogenisering placere rør indeholdende homogenaterne på is i 2 min før den anden 23-sec cyklus.
- Centrifugeres prøverne ved 1000 xg i 5 min for at fjerne umalet hjerne fragmenter. Recover supernatanterne, opdeles i 200 pi prøver og holde dem ved -80 ° C til efterfølgende ELISA-analyse.
3. aS Udsugning fra dissekeret Brain Regioner
- Dissekere enhele hjernen i en 35 mm plastik petriskål på is med en lav effekt lup (8X forstørrelse) under anvendelse af to forcipes hvis ender holdes sammen undtagen når dissekering hippocampus. Må ikke overstige 10 min for at bevare hjernen integritet. Placer hjernen højre side op og hente følgende områder af hjernen i denne rækkefølge:
- Separat en af de to olfaktoriske pærer ved anvendelse af pincetter placeret lige bag pæren. Frigøre den fra hjernen ved en nedadgående bevægelse. Gentag denne operation for den anden pære.
- Forsigtigt kile tangen mellem de to cortexes og flytte det fremad for at lette dissociation af de to cortexes. Holde hjernen på plads med en pincet, bruge en anden til at adskille cortex fra hippocampus.
- Placer tangen 2 mm under cortex. Oprethold et let tryk på tangen, indtil toppen af hippocampus er synlig. Skrælle første del af cortex, og gentag med den anden del. Brug pincet til at adskille de to cortexesbegyndende ved hippocampus og bevæger sig mod den forreste del af hjernen.
- Placer de åbne pincet omkring en af hippocampusen. Luk pincet i bunden af hippocampus derefter forsigtigt fjerne det, inddrive så meget som muligt. Gentag proceduren for den anden hippocampus.
- Placer de åbne pincet under et af striata og forsigtigt adskille den fra hjernen. Brug pincet til at fjerne eventuelt resterende cortex fra striatum. Gentag denne procedure for den anden striatum.
- Brug pincet til forsigtigt at trykke med 2 mm konturen af lillehjernen at lette adskillelsen af cerebellum fra hjernen. Placer pincet lige bag lillehjernen og fjern den ved at flytte tangen fremad.
- Brug det store del af pincet til at hæve mesencephalon for klart se, hvor det slutter sig til hjernestammen. Lav en lodret snit ved forbindelsen derefter fjerne hjernestammen.
- Placer pincet bag mesencephalon, som jegs sammensat af fire afrundede strukturer. Incise vertikalt indtil mesencephalon er helt adskilt fra den resterende hjerne.
- Forbered homogenater af variabel% (vægt / rumfang) i HS-puffer, afhængig af mængden af tilgængelige væv, dvs. 5% homogenat for en vægt mellem 10 og 30 mg, 10% for en vægt mellem 30 og 80 mg, og 20% for en vægt over 80 mg.
- Tilføj et tilstrækkeligt volumen af HS buffer til de dissekerede hjerneregioner at opnå den forventede% af homogenat.
- Vortex og kontroller, at vævet er fuldt nedsænket i HS buffer.
- Homogenisere prøver fremstillet ud fra de dissekerede hjerneregioner eller den cervikale rygmarv med en vævsmalemaskine sammensat af et borsilicatglas rør og to pestles, A og B.
- Hæld hver hjerne region skal knuses direkte ind i røret. Indsæt pistil A ind i røret og trække det. Gentag denne bevægelse omkring ti gange for at dissociere vævet. Brug derefter pistil B til continue formaling af vævet med yderligere 20 bevægelser. Overfør homogenater i et 1,5 ml rør med en 1 ml pipette transfer.
- Centrifugeres prøverne ved 1000 xg i 5 min ved 4 ° C for at fjerne eventuelle umalet hjerne fragmenter. Hent supernatanterne, dele dem op i 200 pi prøver og holde dem ved -80 ° C til efterfølgende ELISA-analyse.
4. Påvisning af aS ved ELISA
- Fortynde coating antistoffer til 0,01 ng / ml. Brug enten anti-aS kanin polyklonale eller monoklonale klon 42-antistof i 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO3-buffer (pH 9,6).
- Belægge 96-brønds mikroplader med 100 pi per brønd af denne overtræksopløsning, og henstår ved 4 ° CO / N. Bruge anti-aS kanin-polyklonalt antistof i belægningsopløsningen for ELISA'er under anvendelse af antistoffer til påvisning syn514, klon 42, LB509, AS11, 4D6 eller 8A5. Bruge anti-aS monoklonalt antistof klon 42 som en coatingopløsningi kombination med anti-pSer129 aS detektion antistof.
BEMÆRK: Om nødvendigt kan pladerne opbevares ved 4 ° C i en uge før ELISA udføres. - Brug en pladevasker at vaske pladerne fem gange med 300 pi phosphatpufret saltvand med 0,05% Tween 20 (PBST) pr. Fra dette trin og fremefter, inkubation er ved stuetemperatur.
- Tilsæt 200 pi PBS T20 blokeringspuffer per brønd. Omrystes i 1 time ved 150 rpm. Pladerne skylles fem gange med PBST.
- Fortynde hjernehomogenater (fortynding 1: 100 af de 20% homogenater, 01:50 af de 10% homogenaterne og 01:25 af de 5% homogenater i PBST BSA 1%), og der tilsættes 100 ul til hver brønd. Derefter inkuberes i 2 timer under omrystning ved 150 rpm. Pladerne skylles fem gange med PBST.
- Tilsæt de forskellige antistoffer aS detektion i PBST med BSA 1% i de fortyndinger, der er nævnt i Materials List. Der inkuberes i 1 time ved 150 rpm. Pladerne skylles fem gange med PBST.
- Tilføj enten anti-mouse eller anti-kanin IgG HRP-konjugater fortyndet 1: 8.000 i PBST suppleret med BSA 1% i 1 time under omrystning ved 150 rpm. Pladerne skylles fem gange med PBST.
- Tilsættes 100 pi 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) til hver brønd og inkuberes i 15 minutter i mørke under omrystning ved 150 rpm.
- Reaktionen standses ved tilsætning af 100 pi af 1 N HCI per brønd derefter måle absorbansen ved 450 nm med mikropladelæser.
- Til dataanalyse, subtrahere OD-værdien opnået i en brønd med alle reagenser undtagen enhver muse hjerneprøver (blindprøvebrønd) fra OD-værdierne målt for hvert af de analyserede prøver.
5. Epitopkortlægning
- Udføre epitopkortlægning ifølge fremgangsmåden beskrevet af Osman 16 fremgangsmåde. Kort fortalt spot peptider af det humane α-synuclein sekvens indeholdende 12 aminosyrer på nitrocellulose med 10 overlappende aminosyrer.
- Blok med 50 mM Tris / 150 mM NaCl pH 10 indeholdende 0,05% Tween 20 og 5% mælkepulver. Inkubere antistoffet i blokeringsopløsning i en koncentration på 2 pg antistof pr ml ved 2-10 ° CO / N.
- Vask membranen tre gange ved anvendelse af 50 mM Tris / 150 mM NaCI-buffer pH 10 indeholdende 0,05% Tween 20. Der inkuberes med gede-anti-muse-IgG HRP-konjugat. Vask membranen yderligere fem gange med samme puffer derefter pletten med en Western blot TMB farvning kit.
6. Statistisk analyse
- Brug R software og nlme pakke til at udføre blandede effekter regressioner til model OD. For hver sammenligning, udføre en blandet effekt regressionsmodel. Brug en fast effekt at skelne symptomatisk fra asymptomatiske grupper.
- Brug en tilfældig effekt afspejler variabiliteten af gentagelser i en bestemt mus. Tjek homoscedasticity ved at undersøge residualerne og om nødvendigt, skal du bruge varians funktioner til at modellere variansen struktur indenfor-gruppen fejl i overensstemmelse med Pinheiro og Bates 17. Indstil 0,05 som tærskel betydning af P.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse de ELISA anvendes specifikt identificeret sygdomsassocierede aS (aS D) i hjernehomogenater udarbejdet i en High Salt buffer fra syge M83 mus. Anvendelse af et antistof, der specifikt genkender pSer129 aS (p = 0,0074), ELISA let skelner gamle, syge mus (> 8 måneder gammel) fra unge (2-5 måneder gamle), sunde M83 mus (figur 1). Flere andre antistoffer viste tilsvarende høje signaler (> 0,6 OD) kun i hjernehomogenater fra syge mus. Dette er tilfældet for 4D6 (p = 0,01), LB509 (p = 0,0047) og 8A5 (p <0,001) mod forskellige sekvenser af den C-terminale del af proteinet (124-134, 115-122, og 129-140 henholdsvis) og, i meget mindre omfang, syn514 mod den N-terminale ende (2-12) af proteinet (p = 0,0003). Endvidere AS11 monoklonale antistof produceret i vores laboratorium mod humane fibrillære rekombinante aS 18 efter immunisering af C57BL / 6S (B6 aS-null) 19mus med en deletion af α-syn-locus, viste tilsvarende høje signaler (p <0,01) Kun hjernehomogenater fra syge mus. Dette antistof er nu blevet vist at genkende aminosyresekvensen (P) VDPDNEAY (E), i aS, svarende til 118-125-sekvensen af humant α-synuclein.
I modsætning hertil under disse forsøgsbetingelser, analyser af hjernehomogenater med klonen 42 detektor-antistof rettet mod et centralt område af α-synuclein (91-96 sekvens), viste en meget lavt signal til både syge og raske M83 mus. Det kunne ikke skelne mellem de to populationer af mus (p = 0,1158). Unge M83 mus alligevel viste en højere immunoreaktivitet end gjorde ikke transgene B6C3H mus (M83 genetisk baggrund linje). Kontrasten var endnu større med C57BL / 6S (B6 aS-null) mus, som har en slettet α-syn-locus. Dette antyder, at mindre immunoreaktivitet i M83 mus svarer til lav detektion af normale aS signal. A'etnalytical følsomt ELISA blev vurderet i sammenligning med en tidligere beskrevet Western blot-metode 4 til påvisning af uopløseligt Ser129 phosphoryleret α-synuclein, ved at undersøge, under anvendelse af både ELISA og Western blot fremgangsmåder, serielle fortyndinger af hjernehomogenater fremstillet ud fra den samme syge M83 musehjerne (figur 2). Omtrentlige 10 ug hjernen ækvivalenter var tilstrækkelig til at opnå et positivt ELISA-signal for hjernen homogenat fra denne syge mus, med både LB509 og PSer129 antistoffer. Tværtimod blev mindst 200 ug hjerne ækvivalenter nødvendige til påvisning pSer129 aS i sarkosyl-uopløselige fraktion analyseret ved Western blot under anvendelse af den samme PSer129 antistof 15. Dette indikerer, at ELISA har en analytisk sensitivitet nogle 20 gange den for Western blot-metode.
I syge og gamle M83 mus (figur 3A), hjernehomogenater fra mesencephalon, hjernestammen og rygmarven sho wed mærket immunoreaktivitet med både LB509 og PSer129 antistoffer i ELISA. Imidlertid blev ingen påviselig immunreaktivitet observeret i de andre hjerneregioner, herunder lugtekolben, cerebral cortex, striatum, hippocampus, thalamus og hypothalamus. ELISA gav et svagt signal for cerebellum. Immunoreaktiviteten i de forskellige hjerneregioner af M83 mus udvikler en fremskyndet klinisk sygdom efter injektion af en hjerne ekstrakt fra en syg M83 muse 4 (figur 3B) var ikke til at skelne fra det, der ses hos ældre (> 8 måneder gammel) uinokuleret M83 mus. Disse resultater er i fuld overensstemmelse med dem, der opnås ved Western blot (figur 3C) og immunhistokemi 15, der viser en meget større aflejring af Ser129 α-synuclein i den kaudale regioner af hjernen og rygmarven.
/52752/52752fig1highres.jpg "Width =" 700 "/>
Figur 1. ELISA påvisning af sygdom-associeret α-synuclein (aS D) i hele hjernehomogenater fra M83 mus. ELISA kombinerer kanin anti-aS polyklonale (coating) med syn514, LB509, AS11, 4D6, 8A5 (påvisning), eller klon 42 (coating) med anti-pSer129 aS (PSer129) (afsløring) antistoffer skelne syge mus fra sunde M83 mus mens ELISA med anti-aS kanin polyklonale (coating) / clone42 (påvisning) ikke. De seks syge, gamle M83 mus i alderen fra 11 til 16 måneder viste tegn på immunreaktivitet med anti α-syn antistoffer (undtagen klon 42 antistof). Dette var ikke tilfældet for enten seks unge, raske mus i alderen fra 2 til 5 måneder gammel, eller med de yderligere kontrol, herunder B6C3H (genetiske baggrund af M83 mus) eller B6 aS-null mus. Fejlbjælkerne viser SD Modificeret fra Bétemps 15.
Figur 2. Sammenligning af den analytiske følsomhed påvisning af aS D ved ELISA og Western blot. A. Et positivt signal blev opnået med ELISA for 12,5 ug hjernen ækvivalenter med både LB509 og PSer129 antistoffer fra to-folds fortyndinger af hjernehomogenater fra en syg mus. Den anslåede cut-off-niveau for diskrimination af syge og sunde mus, der svarer til de midler opnået fra prøver af sunde M83 mus under 3-6 gentagelser af ELISA måler + 3 standardafvigelser, var 0,030 og 0,020 for LB509 og PSer129 antistoffer afsløring henholdsvis . De er vist som en linie i samme farve som den, der anvendes for hvert af antistofferne. B. Ved Western blot-analyse af de uopløselige fraktioner opnået efter ultracentrifugering i Presence af Sarkosyl blev 200 ug hjernen ækvivalenter nødvendige for at detektere aS D med samme PSer129 antistof. Molekylvægtmarkører (i kDa) er angivet til venstre på blottet. Genoptrykt med tilladelse fra Bétemps 15.
Figur 3. Påvisning af sygdom-associeret α-synuclein (aS D) i forskellige hjerneområder af M83 mus ved ELISA og Western blot. ELISA identificerede aS D med PSer129 eller LB509 detektionsantistoffer i M83 mus under normal aldring (A) (n = 1, 4 gentagelser, betyder ± SD) eller efter podning på 6 uger gamle M83 mus med en hjernehomogenat fra en syg M83 ( B) (n = 1, 4 gentagelser, middelværdi ± SD). (C) aS D blev identificeret ved Western duppes med PSer129 detektionsantistoffet EP1536Y i de samme neuro-anatomiske regioner i mus inokuleret med en hjernehomogenat fra en syg M83 mus. Molekylvægtmarkører (i kDa) er angivet i venstre side af panelet C. Lige mængder af totale proteiner blev anvendt i hver linje for tilsvarende belastning på gel. De følgende otte neuro-anatomiske regioner fra syge M83 mus blev testet: OB: olfactive pære, Cx: hjernebarken, Hi: hippocampus, St: striatum, Me: mesencephalon, Cb: lillehjernen, BS: hjernestammen, SC: cervikal rygmarv . Modificeret fra Bétemps 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen af en ELISA blev vist at specifikt at påvise aS D direkte fra muse hjernehomogenater under sygdom i M83 transgen musemodel. Faktisk kunne dette ELISA let skelne syge M83 mus fra sunde M83 mus kun bruger hele hjernehomogenater i High Salt buffer.
De mest kritiske trin for vellykkede resultater ved hjælp af denne ELISA er: korrekt dissekere de forskellige regioner i musen hjerner ved at udvikle den nødvendige håndelag for at forhindre skader under dissektion; udfører prøvefortyndinger udelukkende HS buffer; og valget af antistoffer, fordi ikke alle antistoffer vil virke i et ELISA-format.
Nogle variation i aS D niveauer var alligevel tydeligt mellem forskellige mus. Disse resultater svarer til den Western blot påvisning af typiske aS D mønster kun fundet i syge M83 mus ved undersøgelse af Sarkosyl uopløselige fraktioner efter påvisning med et antistof mod Ser129 phosphoryleret aS 15. Dette viser, at ELISA immunoreaktivitet svarer til den specifikke påvisning af aS D.
I overensstemmelse med tidligere Western blot-analyser 15, denne ELISA detekterede immunreaktivitet efter dissektion af hjernen hos syge M83 mus i de caudale dele af hjernen, dvs. mesencephalon og hjernestammen, samt i den cervikale rygmarv. Ingen immunreaktivitet blev påvist i lugtekolben, cerebral cortex, striatum eller hippocampus, i overensstemmelse med tidligere data, som indikerer, at hippocampus blev skånet af den patologiske proces 6, medmindre i meget lave niveauer i tilfælde af mus, som var blevet podet ved fibrillært alpha synuclein i hippocampus 15. Fordelingen af aS D fremgik således bemærkelsesværdigt ensartede overordnede, uanset de eksperimentelle betingelser, som included enten normal ældning af mus eller fremskyndet udvikling af sygdommen efter intracerebral podning af hjernehomogenater fra syge M83 mus.
Endvidere analysens ydeevne er bedre end den tidligere beskrevne Western blot-metode. Den analytiske sensitivitet af ELISA optrådte højere, hvilket fremgår af detektionsgrænserne opnået i denne test under anvendelse seriefortyndinger af et hjernehomogenat fra en syg M83 mus (12,5 ug til ELISA vs 200 ug til Western blot-assay). Følsomheden af ELISA forblev imidlertid lavere end den for immunhistokemisk påvisning, som påviser aS D i individuelle celler og i frontal hjerneregioner såsom hjernebarken 15. Følsomheden af testen ikke desto mindre kunne forbedres yderligere ved anvendelse af forskellige antistoffer og / eller optimerede detektionssystemer, såsom kemiluminescerende detektion som tidligere beskrevet 13.
Det er vigtigtat bemærke, at flere andre antistoffer, der genkender andre former af proteinet, og navnlig en ikke-phosphorylerede form (detekteret med det monoklonale antistof 4D6 20) gav lignende resultater ved hjælp af denne ELISA, ud over det monoklonale antistof specifikt genkender pSer129 aS. Dette ELISA metode afslørede også immunoreaktivitet med antistoffer, der genkender specifikt menneskelige aS (LB509) og, til en meget lavere grad, mus aS (D37A6) i de samme syge dyr og / eller hjerne regioner af syge mus 15. På den anden side blev der ikke immunreaktivitet observeret ved ELISA-analyse af syge M83 mus under anvendelse af klon 42 antistof mod et centralt område af aS (91-96) 21,22, svarende til en epitop, som kunne være kryptiske under disse ELISA betingelser. Dette ELISA format kunne registrere i M83 mus hjerner både Ser129 phosphorylerede aS, som observeret af Foulds 11 i humant plasma, og ikke-phosphoryleret, muligvis oligomere former, som beskrevet i brummenen plasma og cerebrospinalvæske 12,14. Modsætning tidligere offentliggjorte ELISA'er, hverken vores ELISA-format anvendes det samme antistof i indfangning og detektion til at detektere den oligomere form af aS, eller antistoffer, der vides at være konformationel, ligesom 5G4 antistof, der anvendes i Unterberger studier.
I modsætning til Western blot-metoden, der tidligere anvendt til at påvise aS D i hjernehomogenater fra M83 mus 4, har ELISA ikke kræve en koncentration trin såsom ved ultracentrifugering med sarkosyl at påvise sygdommen-associerede protein 23. Sygdomsassocierede aS er tidligere identificeret i M83 mus ved sekventiel ekstraktion hjælp buffere med stigende styrke 2,6. Fra et praktisk synspunkt, sparer denne kvantitative analyse betydelig tid og reagenser i forhold til Western blot procedure.
I denne undersøgelse detaljerede aS molekylære analyser under anvendelse af en ELISA-metode gjorde det muligt atlet kvantificere immunoreaktivitet med forskellige antistoffer i syge M83 mus. Det kunne belyse de molekylære mekanismer, der er involveret i aS sammenlægning under synucleinopatier fra et kvantitativt synspunkt. Dette ELISA tilgang kunne derfor danne grundlag for en hurtig og nemt værktøj til at opdage aS D i forskellige biologiske prøver med en pålidelig markør af patologi, såsom Ser129 phosphorylerede aS som Foulds 11 mener shows mere lovende som en diagnostisk markør end den ikke-phosphorylerede protein. For nylig, påpegede han, at foranstaltninger af den samlede aS eller muligvis ikke-phosphorylerede aS kunne bruges som et surrogat markør for sygdomsprogression i PD, som niveauet af totale aS tendens til at stige over tid efter fremkomsten af de første symptomer 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Damien Gaillard for vaccinationer og opfølgning af dyreforsøg. Dette arbejde blev støttet af ANSES (franske agentur for fødevarer, miljø og Occupational Health & Safety), og af en bevilling fra Fonden France Parkinson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB509 | Abcam | ab27766 | Detection antibody 1/2,000 |
| AS11 | Produced at Anses | Detection antibody 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Detection antibody 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Detection antibody 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Detection antibody 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Detection antibody 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Coating and detection antibody (1/2,000) |
| 8A5 | Provided by Dr. Anderson | Detection antibody 1/2,000 | |
| polyclonal anti-αsyn antibody | Millipore | AB5038P | Coating antibody |
| Anti-mouse IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Anti-rabbit IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Goat anti-mouse IgG HRP conjugate | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C | ||
|
Euromedex | 26-128-3094-B | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | EU0007-B | |
|
Sigma | 43815 | |
| PBS | Adjust at pH 7.5 | ||
|
Euromedex | 1309 | |
|
Euromedex | 2018 | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Stock solution 100 mM, toxic |
| 1% phosphatase cocktail | Pierce | 78428 | |
| 1% protease inhibitor cocktail | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrated |
| Microplate MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonate 50 mM pH 9.6 | |||
|
Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
|
Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Superblock T20 PBS blocking buffer | Pierce | E6423H | 10x concentrated |
| TMB | Sigma | T0440 | Used for ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Used for epitope mapping |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | keep on ice at this step |
| Grinding tubes | Biorad | 355-1197 | |
| Plate washer | Tecan | Columbus Pro | |
| Plate reader | Biorad | Model 680 | |
| Low power magnifier | VWR | 630-1062 | 8X magnification |
| Forceps Dumont#7 | WPI | 14097 | For dissection steps |
| Transfer pipette 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| 1.5 ml tubes | Dutscher | 033290 | |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
- Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
- El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
- Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
- Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
- Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29 (2014).
- Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
- Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
- Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
- Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11 (2001).
- Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
- Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225 (2011).
- Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
- Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540 (2013).
