Abstract
Förutom etablerade metoder som Western blot, är nya metoder som behövs för att snabbt och enkelt kvantifiera sjukdomsassocierade α-synuklein (aS D) i experimentella modeller av synucleopathies. En transgen mus linje (M83) som överuttrycker den humana A53T aS och spontant utvecklar en dramatisk klinisk fenotyp mellan åtta och 22 månaders ålder, som kännetecknas av symtom som viktminskning, utmattning, och svår motorisk försämring, användes i denna studie. För molekylära analyser av aS D (sjukdomsassocierade aS) i dessa möss, var en ELISA utformad för att specifikt kvantifiera aS D i sjuka möss. Analys av det centrala nervsystemet i denna musmodell visade närvaron av aS D främst i de kaudala hjärnregioner och ryggmärg. Det fanns inga skillnader i aS D fördelningen mellan olika experimentella förhållanden som leder till klinisk sjukdom, det vill säga i uninoculated och normalt åldrande transgena möss och hos möss ympade med hjärnextrakt från sjuka möss. Den specifik detektion av aS D immunoreaktivitet användning av en antikropp mot Ser129 fosforylerade aS med ELISA väsentligen korrelerade med den som erhålls genom Western blöt och immunohistokemi. Oväntat, erhölls liknande resultat observerades med flera andra antikroppar mot den C-terminala delen av aS. Spridning av aS D, vilket tyder på inblandning av en "prion-liknande" mekanism, därför kan lätt övervakas och kvantifieras i denna musmodell med hjälp av en ELISA metod.
Protocol
Alla förfaranden och protokoll som handlar om djur var i enlighet med EG-direktiv 86/609 / EEG och ratificerats av kommer, det franska nationella kommitté för behandling av etik i djurförsök (protokoll 11 till 0043). Djuren inhystes och vårdas i Anses s godkända experimentanläggningar i Lyon (godkännande B 69387 0801).
1. Framställning av möss
- Euthanize möss genom en intraperitoneal injektion av dödlig dos av natriumpentobarbital.
- Hämta hela hjärnan från mus skallen och placera den i en 35 mm plast petriskål på is tills extraktion.
- Utdrag livmoderhalscancer ryggmärgen.
OBS: Extrahera aS antingen från en av hjärnhalvorna efter sagittal sektione eller från dissekerade mushjärnor, tillgänglig efter experimenten som anges i tabell 1.
| Experiment | Möss Vaccin (hjärn motsvarande) | Överlevnadsperiod (Dpi) | Median / maximal överlevnad (dagar gamla) | aS d detektering genom ELISA / WB / IHC |
| 1 | Oympade möss | 441 ± 166 | 419/736 | 8/8 |
| 2 | Inokulerad möss (0,2 mg) | 150 ± 52 | 140/241 | 9/9 |
Tabell 1. Förteckning över experiment utförda på M83-möss. Vaccinering utfördes vid 6 veckor för experiment 2 i Striato-kortikala område med 20 ul av en hjämhomogenat av en sjuk mus (1% vikt / vol i glukos 5%), efter bedövning av 6 veckor gamla homozygota M83 möss med 3% isofluran inandning. dpi: dagar efter inoculation.
2. aS Extraction från hjärnhalvorna
- Sagittally skära hjärnan för att erhålla två halvor. Väg varje halva i en ribolysis rör innehållande malkulor.
- Förbered Hög Salt (HS) buffert innehållande 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfatas och proteashämmare cocktails. Lägg högsaltbuffert till hjärnhalvorna att erhålla 20% (vikt / volym) homogen.
- Förbered prover från hjärnhalvorna med hjälp av en mekanisk homogenisator vid 6,0 m / s för 23 sekunder två gånger. Efter den första 23 sek homogenisering, placera rören innehållande homogenaten på is under 2 minuter före den andra 23-sek cykel.
- Centrifugera proverna vid 1000 xg under 5 minuter för att eliminera omalda hjärn fragment. Återställa supernatanterna, dela i 200 pl portioner och hålla dem vid -80 ° C för efterföljande ELISA-analys.
3. aS Extraction från dissekerade hjärnregioner
- Dissekera enhela hjärnan i en 35 mm plast petriskål på is med en låg effekt förstoringsglas (8X förstoring) med hjälp av två forcipes vars ändar hålls samman utom när dissekera hippocampus. Överskrid inte 10 minuter att bevara hjärnan integritet. Placera hjärnan rätt sida upp och hämta följande hjärnregioner i denna ordning:
- Separat en av de två luktsinnet lökar använder pincett placeras precis bakom lampan. Ta loss den från hjärnan genom en nedåtgående rörelse. Upprepa denna operation för den andra lampan.
- Kila försiktigt tången mellan de två cortexes och flytta den framåt för att underlätta upplösning av de två cortexes. Hålla hjärnan på plats med en pincett, använda en annan för att separera cortex från hippocampus.
- Placera tången 2 mm under cortex. Håll ett lätt tryck på tången tills toppen av hippocampus är synlig. Dra av första delen av hjärnbarken, och upprepa med den andra delen. Använd pincett för att separera de två cortexesbörjar vid hippocampus och rör sig mot den främre delen av hjärnan.
- Placera de öppna pincett runt en av hippocampi. Stäng tången vid botten av hippocampus sedan försiktigt bort den, återställa så mycket som möjligt. Upprepa proceduren för den andra hippocampus.
- Placera de öppna pincett under en av striata och försiktigt separera den från hjärnan. Använd pincett för att undanröja eventuella återstående cortex från striatum. Upprepa proceduren för den andra striatum.
- Använd pincett för att försiktigt pressa med 2 mm konturen av lillhjärnan att underlätta separation av lillhjärnan från hjärnan. Placera tången precis bakom lillhjärnan och ta bort den genom att flytta pincett framåt.
- Använd den breda delen av tången för att höja mesencephalon för att tydligt se där den ansluter till hjärnstammen. Gör en vertikalt snitt vid förbindningen sedan bort hjärnstammen.
- Placera tången bakom mesencephalon, som jags består av fyra rundade strukturer. Incisionsfilm vertikalt tills mesencefalon helt har separerats från den återstående hjärnan.
- Förbered homogenat av variabel% (vikt / volym) i HS-buffert, beroende på mängden tillgängliga vävnader, dvs 5% homogenatet för en vikt mellan 10 och 30 mg, 10% för en vikt mellan 30 och 80 mg, och 20% för en vikt över 80 mg.
- Lägg till en tillräcklig volym av HS-buffert till de dissekerade hjärnregioner för att få den förväntade% av homogenatet.
- Vortex och kontrollera att vävnaderna är helt nedsänkt i HS buffert.
- Homogenisera prover framställda från de dissekerade hjärnregioner eller den cervikala ryggmärgen med en vävnadskvarn bestående av ett borsilikat glasrör och två mortelstötar, A och B.
- Häll varje hjärnregion som skall krossas direkt in i röret. Infoga mortelstöt A i röret och dra den tillbaka. Upprepa denna rörelse ungefär tio gånger för att dissociera vävnaden. Använd sedan mortelstöt B till Continue slipning vävnaden med ytterligare 20 rörelser. Överför homogenaten till ett 1,5 ml rör med en 1 ml överföringspipett.
- Centrifugera proverna vid 1000 xg under 5 min vid 4 ° C för att eliminera eventuella omalda hjärn fragment. Hämta supernatanterna, dela upp dem i 200 pl portioner och hålla dem vid -80 ° C för efterföljande ELISA-analys.
4. Detektion av aS genom ELISA
- Späd beläggnings antikropparna till 0,01 ng / ml. Använd antingen anti-aS kanin polyklonal eller monoklonal klon 42 antikropp i 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCOs 3 buffert (pH 9,6).
- Belägga 96-brunnars mikroplattor med 100 | il per brunn av denna beläggningslösning och lämna vid 4 ° CO / N. Använd anti-aS kanin polyklonal antikropp i beläggningslösningen för Elisa-test med användning av detektionsantikroppar syn514, klon 42, LB509, AS11, 4D6 eller 8A5. Använd anti-aS monoklonal antikropp klon 42 som en beläggningslösningi kombination med anti-pSer129 aS detektionsantikropp.
OBS: Om nödvändigt kan plattorna hållas vid 4 ° C i en vecka innan ELISA utförs. - Använd en plattvättare att tvätta plattorna fem gånger med 300 | il av fosfatbuffrad saltlösning med 0,05% Tween 20 (PBST) per brunn. Från detta steg framåt, är inkubation vid RT.
- Tillsätt 200 pl T20 PBS blockerande buffert per brunn. Skaka i en timme vid 150 varv per minut. Tvätta plattorna fem gånger med PBST.
- Späd hjämhomogenat (utspädning 1: 100 av homogen 20%, 1:50 av de 10% homogen och 01:25 av de 5% homogen i PBST BSA 1%), och tillsätt 100 pl till varje brunn. Sedan inkubera i 2 h under skakning vid 150 varv per minut. Tvätta plattorna fem gånger med PBST.
- Lägg de olika aS detektionsantikroppar i PBST med BSA 1% vid späd nämns i materiallistan. Inkubera i en timme vid 150 varv per minut. Tvätta plattorna fem gånger med PBST.
- Lägg antingen anti-mouse eller anti-kanin-IgG-HRP-konjugat utspätt 1: 8000 i PBST med tillsats av BSA 1% under 1 h under skakning vid 150 varv per minut. Tvätta plattorna fem gånger med PBST.
- Tillsätt 100 ni 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB) lösning till varje brunn och inkubera under 15 minuter i mörker under skakning vid 150 varv per minut.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 100 pl av 1 N HCl per brunn sedan mäta absorbansen vid 450 nm med mikroplattläsaren.
- För dataanalys, subtrahera OD-värdet som erhölls i en brunn med alla reagenser utom eventuella mus hjärnprover (tom brunn) från de OD-värden som uppmätts för var och en av de analyserade proverna.
5. Epitopkartläggning
- Utför epitopkartläggning enligt metoden beskriven av Osman 16. I korthet, spot peptider av humant α-synuklein sekvens innehållande 12 aminosyror på nitrocellulosa med 10 överlappande aminosyror.
- Blockera med 50 mM Tris / 150 mM NaCl-buffert, pH 10 innehållande 0,05% Tween 20 och 5% mjölkpulver. Inkubera antikropp i blockerande lösning vid en koncentration av 2 | j, g antikropp per ml vid 2 till 10 ° CO / N.
- Tvätta membranet tre gånger med användning av 50 mM Tris / 150 mM NaCl-buffert pH 10 innehållande 0,05% Tween 20. Inkubera med get-anti-mus-IgG-HRP-konjugat. Tvätta membranet ytterligare fem gånger med samma buffert sedan fläcken med hjälp av en Western blöt TMB färgningskit.
6. Statistisk analys
- Använd R programvara och nlme paket för att utföra blandade Effekter regressioner att modellera OD. För varje jämförelse, utföra en blandad effekt regressionsmodell. Använd en fast effekt att skilja symptomatisk från asymtomatiska grupper.
- Använd en slumpmässig effekt för att återspegla variationen repetitioner för en given mus. Kolla homoscedasticity genom att undersöka förbättringarna och om det behövs, använd varians funktioner för att modellera variationen struktur inom grupp fel i linje med Pinheiro och Bates 17. Ställ in 0,05 som betydelsen tröskeln till P.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie, ELISA används specifikt identifierade sjukdomsassocierade aS (aS D) i hjämhomogenat framställda i en buffert med hög salthalt från sjuka M83 möss. Använda en antikropp som specifikt känner igen pSer129 aS (p = 0,0074), ELISA skiljer lätt gamla, sjuka möss (> 8 månader gammal) från unga (2-5 månader gamla), friska M83-möss (Figur 1). Flera andra antikroppar visade liknande höga signaler (> 0,6 OD) endast i hjämhomogenat från sjuka möss. Detta är fallet för 4D6 (p = 0,01), LB509 (p = 0,0047) och 8A5 (p <0,001) mot olika sekvenser av den C-terminala delen av proteinet (124-134, 115-122, och 129-140 respektive) och, i mycket mindre utsträckning, syn514 mot N-terminala änden (2-12) av proteinet (p = 0,0003). Dessutom AS11 monoklonal antikropp som produceras i vårt laboratorium mot humana fibrillära rekombinanta aS 18 efter immunisering av C57BL / 6S (B6 aS-null) 19möss med en deletion av α-syn locus, visade liknande höga signaler (p <0,01) endast i hjärnhomogenater från sjuka möss. Denna antikropp har nu visat sig känna igen den aminosyrasekvens (P) VDPDNEAY (E) aS, motsvarande den 118-125-sekvensen av humant α-synuklein.
Däremot under dessa experimentella betingelser, analyser av hjärnhomogenat med klon 42 detektionsantikropp riktad mot ett centralt område av α-synuklein (91-96-sekvensen), visade en mycket låg signal för både sjuka och friska M83-möss. Det kunde inte skilja mellan de två populationer av möss (p = 0,1158). Unga M83 möss visade ändå en högre immunreaktivitet än gjorde icke transgena B6C3H möss (M83 genetisk bakgrund linje). Kontrasten var ännu större med C57BL / 6S (B6 aS-null) möss, som har en borttagen α-syn locus. Detta tyder på att den ringa immunoreaktivitet i M83-möss motsvarar låg signaldetektering av normala aS. A-etnalytical känsligheten hos denna ELISA bedömdes i jämförelse med en tidigare beskriven Western blöt metod 4 för detektering av olösligt Ser129 fosforylerade α-synuklein, genom att undersöka, med användning av både ELISA och Western blöt metoder, seriespädningar av hjärnhomogenat framställda från samma sjuka M83 mushjärna (Figur 2). Ungefärliga 10 mikrogram hjärn medel var tillräcklig för att erhålla en positiv ELISA-signal för hjämhomogenat från denna sjuka mus, med både LB509 och PSer129 antikroppar. Tvärtom, var minst 200 mikrogram hjärnan medel som behövs för att upptäcka pSer129 aS i sarkosyl-olöslig fraktion analyserades med Western blöt med användning av samma PSer129 antikropp 15. Detta tyder på att ELISA har en analytisk känslighet cirka 20 gånger större än den västerländska blot-metoden.
I sjuka och gamla M83-möss (Figur 3A), hjämhomogenat från mesencephalon, hjärnstammen och ryggmärgen sho wed märkt immunoreaktivitet med både LB509 och PSer129 antikroppar i ELISA. Men ingen påvisbar immunoreaktivitet observerades i andra delar av hjärnan, inklusive luktbulben, hjärnbark, striatum, hippocampus, talamus och hypotalamus. ELISA gav en svag signal för lillhjärnan. Immunoreaktiviteten i olika hjärnregioner i M83-möss utvecklar en accelererad klinisk sjukdom efter injektion av en hjärna utdrag ur en sjuk M83 mus 4 (Figur 3B) var omöjlig att skilja från den som setts hos äldre (> 8 månader gammal) Ej inokulerad M83 möss. Dessa resultat är helt i linje med de som erhålls genom Western blöt (figur 3C) och immunhistokemi 15, som visar en mycket större avsättning av Ser129 α-synuklein i den bakre regioner i hjärnan och ryggmärgen.
/52752/52752fig1highres.jpg "Width =" 700 "/>
Figur 1. ELISA upptäckt av sjukdomsassocierade α-synuklein (aS D) i hela hjärnhomogenater från M83-möss. ELISA kombinera kanin anti-aS polyklonal (beläggning) med syn514, LB509, AS11, 4D6, 8A5 (detektion) eller klon 42 (beläggning) med anti-pSer129 aS (PSer129) (detektions) antikroppar skilja sjuka möss från friska M83-möss, medan ELISA med anti-aS kaninpolyklonal (beläggning) / clone42 (detektion) inte. De sex sjuka, gamla M83 möss i åldrarna mellan 11 och 16 månader visade tecken på immunoreaktivitet med anti α-syn antikroppar (utom klon 42-antikropp). Detta var inte fallet för vare sig de sex unga, friska möss i åldrarna från 2 till 5 månader gamla, eller med de ytterligare kontroller inklusive B6C3H (genetisk bakgrund av M83-möss) eller B6 aS-null möss. Felstaplarna representerar SD Modifierad från Bétemps 15.
Figur 2. Jämförelse av den analytiska känsligheten hos detekteringen av aS D genom ELISA och Western blöt. A. En positiv signal erhölls med ELISA för 12,5 ^ g hjärn ekvivalenter med både LB509 och PSer129 antikroppar från två-faldiga utspädningar av hjärnhomogenat från en sjuk mus. Den beräknade cut-off nivå för diskriminering av sjuka och friska möss, motsvarande de medel som erhålls från prover från friska M83 möss under 5:57 upprepningar av ELISA mäter + 3 standardavvikelser, var 0,030 och 0,020 för LB509 och PSer129 antikroppar detektions respektive . De visas som en linje i samma färg som den som användes för var och en av antikropparna. B. Genom Western blot-analys av de olösliga fraktionerna som erhållits efter ultracentrifugering i prece av sarkosyl, var 200 mikrogram hjärn medel som behövs för att upptäcka aS D med samma PSer129 antikropp. Molekylviktsmarkörer (i kDa) indikeras till vänster av blotten. Omtryckt med tillåtelse från Bétemps 15.
Figur 3. Detektion av sjukdomsassocierad α-synuklein (aS D) i olika områden i hjärnan av M83 möss genom ELISA och Western blöt. ELISA identifierade aS D med PSer129 eller LB509 antikroppar upptäckt i M83-möss under normalt åldrande (A) (n = 1, 4 upprepningar, medelvärde ± SD) eller efter ympning av 6 veckor gamla M83-möss med en hjämhomogenat från en sjuk M83 ( B) (n = 1, 4 upprepningar, medelvärde ± SD). (C) aS D identifierades av Western blot med PSer129 detektionsantikropp EP1536Y i samma neuro anatomiska regioner i möss ympade med en hjämhomogenat från en sjuk M83 mus. Molekylviktsmarkörer (i kDa) indikeras till vänster på panelen C. Lika stora mängder av den totala proteiner användes i varje rad för motsvarande belastning på gel. Följande åtta neuro anatomiska regioner från sjuka M83 möss testades: OB: olfactive glödlampa, Cx: hjärnbarken, Hi: hippocampus, St: striatum, Me: mesencefalon, Cb: lillhjärnan, BS: hjärnstammen, SC: cervikal ryggmärg . Modifierad från Bétemps 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av en ELISA visade sig specifikt detektera aS D direkt från mus hjärnhomogenater under sjukdomen i M83 transgen musmodell. I själva verket kan detta ELISA lätt skilja sjuka M83 möss från friska M83 möss med enbart hela hjärnhomogenater i buffert med hög salthalt.
De mest kritiska stegen för framgångsrika resultat genom att använda denna ELISA är: korrekt dissekera de olika regionerna i mushjärnorna genom att utveckla den nödvändiga fingerfärdighet för att förhindra skador under dissektion; utföra provspäd uteslutande i HS buffert; och valet av antikroppar, eftersom inte alla antikroppar kommer att fungera i ett ELISA-format.
Vissa variationer i aS D nivåerna var ändå uppenbart mellan olika möss. Dessa resultat är ekvivalenta med Western blot upptäckt av den typiska aS D mönster endast upptäckts i sjuka M83 möss genom undersökning av sarkosyl olösliga fraktioner efter detektering med en antikropp mot Ser129 fosforylerade aS 15. Detta visar att ELISA immunoreaktivitet motsvarar specifik detektion av aS D.
I överensstämmelse med tidigare Western blot-analyser 15, denna ELISA detekterade immunoreaktivitet efter dissektion av hjärnan hos sjuka M83-möss i de kaudala delarna av hjärnan, dvs mesencefalon och hjärnstammen, såväl som i den cervikala ryggmärgen. Ingen immunreaktivitet påvisades i luktloben, hjärnbark, striatum eller hippocampus, överensstämmer med tidigare data som visar att hippocampus var skonas genom den patologiska processen 6, om inte vid mycket låga nivåer i fallet med möss som hade inokulerats med fibrillärt alfa -synuclein in hippocampus 15. Fördelningen av aS D verkade således anmärkningsvärt enhetligt, oavsett de experimentella betingelser som included antingen normalt åldrande hos möss eller snabbare utveckling av sjukdomen efter intra-cerebral ympning av hjärnhomogenater från sjuka M83 möss.
Vidare är analysprestandan bättre än den tidigare beskrivna Western-blot-metoden. Den analytiska känsligheten hos ELISA verkade högre, vilket framgår av de detektionsgränser som erhållits i detta test med hjälp av serieutspädningar av en hjämhomogenat från en sjuk M83 mus (12,5 mikrogram för ELISA vs 200 mikrogram för Western blot-analys). Känsligheten hos ELISA förblev dock lägre än för immunhistokemisk detektion, som detekterar aS D i enskilda celler och i främre hjärnregioner såsom hjärnbarken 15. Känsligheten av testet skulle dock kunna förbättras ytterligare genom att använda olika antikroppar och / eller optimerade detektionssystem, såsom kemiluminiscerande detektering som tidigare beskrivits 13.
Det är viktigtatt notera att flera andra antikroppar som känner igen andra former av proteinet, och i synnerhet en icke-fosforylerade formen (detekterad med 4D6 monoklonal antikropp 20) gav liknande resultat med användning av denna ELISA, förutom den monoklonala antikroppen som specifikt igenkänner pSer129 aS. Denna ELISA metod visade också immunreaktivitet med antikroppar som känner igen specifikt mänskliga aS (LB509) och, i mycket lägre grad, mus aS (D37A6) i samma sjuka djur och / eller områden i hjärnan av sjuka möss 15. Å andra sidan ades ingen immunoreaktivitet observerades genom ELISA-analys av sjuka M83 möss med användning av klon 42 antikropp mot ett centralt område av aS (91-96) 21,22, vilket motsvarar en epitop som kan vara kryptisk under dessa ELISA-betingelser. Denna ELISA-format kan upptäcka i M83 mushjärnorna både Ser129 fosforylerade aS, som observerades av Foulds 11 i human plasma, och icke-fosforylerade, möjligen oligomera former, som beskrivs i humen plasma och cerebrospinalvätska 12,14. Till skillnad från tidigare publicerade ELISA, vår ELISA-format varken har använt samma antikropp i infångning och detektion för att upptäcka den oligomera form av aS, eller antikroppar som är kända för att vara konforma, liksom 5G4 antikropp som används i Unterberger studier.
Till skillnad från Western blot metod som tidigare använts för att detektera aS D i hjämhomogenat från M83-möss 4, gjorde ELISA inte kräver ett koncentrationssteg såsom genom ultracentrifugering med sarkosyl att upptäcka sjukdomsassocierade proteinet 23. Sjukdomsassocierade aS har tidigare identifierats i M83-möss genom sekventiell extraktion med buffertar med ökande styrka 2,6. Ur praktisk synvinkel, sparar mycket tid och reagens jämfört med Western blot förfarandet denna kvantitativ analys.
I denna studie, detaljerade aS molekylära analyser med användning av en ELISA-metod gjorde det möjligt attlätt kvantifiera immunreaktivitet med olika antikroppar i sjuka M83 möss. Det kan kasta ljus över de molekylära mekanismer som är involverade i aS aggregering under synukleinopatier från en kvantitativ synpunkt. Denna ELISA tillvägagångssätt skulle därför ligga till grund för en snabb och enkelt verktyg för att upptäcka aS D i olika biologiska prover med en tillförlitlig markör för patologi såsom Ser129 fosforylerade aS som Foulds 11 anser visar mer lovande som en diagnostisk markör än den icke-fosforylerade proteinet. Nyligen påpekade han det faktum att åtgärder av den totala aS eller möjligen icke-fosforylerade aS skulle kunna användas som en surrogatmarkör för sjukdomsprogression i PD, som nivån på den totala aS tenderar att öka med tiden efter uppkomsten av första symptomen 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Damien Gaillard för vaccinationer och uppföljning av djurförsök. Detta arbete stöddes av ANSES (franska byrån för livsmedel, miljö och hälsa och säkerhet) och genom ett bidrag från stiftelsen Frankrike Parkinson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB509 | Abcam | ab27766 | Detection antibody 1/2,000 |
| AS11 | Produced at Anses | Detection antibody 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Detection antibody 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Detection antibody 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Detection antibody 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Detection antibody 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Coating and detection antibody (1/2,000) |
| 8A5 | Provided by Dr. Anderson | Detection antibody 1/2,000 | |
| polyclonal anti-αsyn antibody | Millipore | AB5038P | Coating antibody |
| Anti-mouse IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Anti-rabbit IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Goat anti-mouse IgG HRP conjugate | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C | ||
|
Euromedex | 26-128-3094-B | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | EU0007-B | |
|
Sigma | 43815 | |
| PBS | Adjust at pH 7.5 | ||
|
Euromedex | 1309 | |
|
Euromedex | 2018 | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Stock solution 100 mM, toxic |
| 1% phosphatase cocktail | Pierce | 78428 | |
| 1% protease inhibitor cocktail | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrated |
| Microplate MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonate 50 mM pH 9.6 | |||
|
Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
|
Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Superblock T20 PBS blocking buffer | Pierce | E6423H | 10x concentrated |
| TMB | Sigma | T0440 | Used for ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Used for epitope mapping |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | keep on ice at this step |
| Grinding tubes | Biorad | 355-1197 | |
| Plate washer | Tecan | Columbus Pro | |
| Plate reader | Biorad | Model 680 | |
| Low power magnifier | VWR | 630-1062 | 8X magnification |
| Forceps Dumont#7 | WPI | 14097 | For dissection steps |
| Transfer pipette 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| 1.5 ml tubes | Dutscher | 033290 | |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H.
- Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Masuda-Suzukake, M., et al.
- Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
- Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
- El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
- Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
- Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
- Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29 (2014).
- Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
- Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
- Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
- Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11 (2001).
- Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
- Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225 (2011).
- Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
- Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540 (2013).
