Whole humor vítreo Dissecção de Análise Vitreodynamic

Introduction

O objectivo deste método é a de detalhe uma técnica para isolar todo um corpo vítreo, intacta, com o núcleo vítreo e córtex intacto, a partir de um olho de cadáver, para efeitos de análise vitreodynamic. Como o campo da fisiologia vítreo tem crescido, pesquisadores multidisciplinares, tais como mecânica dos fluidos pesquisadores, estão a investigar as propriedades físicas e biomecânicas do vítreo ^1. Para este fim, é essencial detalhe uma técnica para isolar todo o, corpo vítreo intacta para ajudar os investigadores multidisciplinares.

Sebag et al. ² e ³ outros realizados inteiras elegantes dissecações de cadáveres vítreas em olhos humanos e mostrou ilustrações dos resultados. No entanto, a técnica utilizada não foi descrito em pormenor e não especialistas não seria capaz de se replicar independentemente do método. Outros estudos têm colhido vítreo de cadáveres olhos usando métodos mais simples, como aspiração ou dissecação parcial,ambas as quais não resultam em conjunto um corpo vítreo, intacta. Gisladottis et al. ⁴ e Xu et al. ⁵ investigar permeabilidade no humor vítreo colhida a partir de olhos de cadáveres. No entanto, uma vez que nenhum método de extracção vítreo foi descrito, assumiu-se que eles aspirado do humor vítreo com uma seringa. Watts et al. ⁶ foi um passo adiante, descrevendo um método de isolamento de coelho humor vítreo com uma técnica cirúrgica. No entanto, este método resulta num isolamento de apenas o núcleo vítreo e não no córtex vítreo. Skeie et al. ⁷ posteriormente organizou o vítreo em 4 regiões únicas e elegantemente descrito um método para dissecar cada parte para análise. Esta técnica no entanto, não resultar numa vítreo intacto como um todo.

A técnica actual foi desenvolvido para facilitar experiências biofísicas que actualmente apenas são realizadas em cadáveres olhos. Os métodos anteriores, como descrito umbove, são limitados porque 1) nenhuma isolar completamente todo o corpo vítreo, núcleo e córtex vítreo 2) colhidas são homogeneizados, 3) estrutura anatômica vítreo não é mantido, ou 4) técnicas de dissecação não são adequadamente detalhados para a replicação por pesquisadores em outros campos . Além disso, devido à opacidade da esclera e coróide, visualização do corpo vítreo é limitado no globo ocular intacto. Isto limita a precisão das medições de viabilidade e que podem ser feitas dentro de todo o olho. Além disso, as estruturas anatómicas circundantes do vítreo pode confundir o estudo das propriedades bioquímicas e físicas do vítreo.

Nos últimos anos, o corpo vítreo da ciência tem crescido muito e não há razão para acreditar que todo o corpo vítreo tem propriedades diferentes do que suas partes individuais. Há um crescente interesse em investigar as propriedades físicas, biomecânicos e químicas do vítreo para vitreodynamics research, que tem aplicações na medicina clínica, tais como a entrega de drogas, oxigenação intravítrea ⁸ e vitrectomia. Vitreodynamics farmacológicos, que utiliza agentes farmacológicos para manipular o vítreo, pode ser utilizada para melhorar os resultados de vitrectomia ^9. As propriedades biomecânicas são utilizados para modelar o fluxo de fluido vítreo, que pode ser usado para melhorar as tecnologias de entrega de drogas intravítrea ^10-12. Propriedades físicas de vários segmentos da vítreo são cruciais para a compreensão de transporte de oxigênio vítreo-retiniana ^13. A técnica de dissecção do vítreo proposto pode ser utilizado para estudar diversas propriedades do humor vítreo intacta. Ele permite que os experimentos de bancada a ser feito em, corpos vítreos intactas inteiros com melhor visualização.

Em resumo, os métodos actuais para o estudo do vítreo ou não são adequadamente descritos, ou resultar em um isolamento completo do núcleo vítreo e no córtex. Portanto, existe uma necessidade de executar experiments em um modelo de olho transparente, mantendo a anatomia do vítreo existente no olho cadáver.

Protocol

Todos os olhos enucleados foram obtidos a partir de um matadouro e todos os experimentos foram realizados de acordo com as leis de biossegurança institucionais.

1. Fixe olho enucleado para baixo em uma superfície. Fazer isso colocando os pinos do tecido através do excesso de tecido em torno do olho e prendendo-o para baixo em uma placa de isopor.
2. Dissecar e retire conjuntiva perilimbal de olho.
   1. Use uma pinça fina (0,3 fórceps) e microtesoura (tesoura Westcott) para inciso conjuntiva no limbo e sem rodeios dissecá-lo fora da esclera. Cortar a conjuntiva ao longo do limbo como a dissecção romba prossegue para permitir posterior dissecação.
   2. Remover conjuntiva a toda a volta do olho (360 graus) para expor tanto quanto possível esclera.
      NOTA: É útil para deixar uma pequena quantidade de conjuntiva para facilitar a fixação do olho com os pinos de uma pinça cirúrgica ou durante o resto do procedimento.
3. Criar um retalho escleral de espessura total ao longo de umlado do olho (lâmina de bisturi 69).
   1. Adicione uma ~ 5 milímetros incisão escleral paralela ao limbo e 3 mm posterior ao limbo cortando suavemente para dentro da esclerótica com um bisturi (lâmina de bisturi 11) até coróide pigmentadas é visível. Tenha cuidado para não inciso a própria coróide.
   2. Cuidadosamente dissecar ao longo do plano entre a esclera e coróide, ou com tesouras (utilizando uma dissecção romba) ou com o bisturi, até que seja possível aumentar o espaço de potencial entre estes tecidos, empurrando suavemente para dentro da coróide.
   3. Fazer uma outra incisão escleral perpendicular à primeira incisão escleral com microtesouras afiadas, criando uma incisão em forma de T.
   4. Em seguida, continuar a dissecar bruscamente de um modo circunferencial para remover o tecido a partir da coróide esclerótica subjacente e empurre o coróide longe da esclera como mencionado acima.
   5. Ampliar a retalho escleral, conforme necessário.
      1. Suavemente sem corte dissecar a coróide longe da escleradurante todo o processo.
      2. Aumentar a aba até que a incisão feita perpendicularmente ao limbo atinge o nervo óptico e a incisão feita paralela ao limbo é, pelo menos, um terço da circunferência do olho (45 °).
      3. Use a retalho escleral como fonte de alavancagem para manipular o olho durante a dissecção romba. O contra-tração na aba torna mais fácil para dissecção romba.
   6. Repita o passo anterior no outro retalho escleral.
4. Cortaram os retalhos esclerais para expor uma grande área de coróide.
5. Continuar a incisão feita no passo 3 em torno da circunferência do olho (360 graus).
6. Remover o tecido coróide-restante retina.
   1. Dentro da região exposta, use um algodão-ponta para escovar suavemente o tecido coróide-retina restante. Alternativamente, agarram delicadamente o tecido com uma pinça e retire-a do corpo vítreo subjacente.
   2. Se for necessário fazer uma incisão na coróide starting do nervo óptico. Em seguida, retire a coróide suavemente para expor a retina eo córtex vítreo.
7. Continuar sem corte dissecar a coróide longe da esclera e, em seguida, retire a coróide obter todo o vítreo intacta.
8. Utilizar o aro escleral fixada na córnea para posicionar todo o vítreo em local desejado. Neste ponto, o vítreo é ligada à esclerótica anterior e lente.
9. Blunt dissecar o vítreo a partir do interior da esclerótica, à volta da lente, a remoção de todos esclera.
10. Use uma ferramenta sem corte para colher a lente de distância do vítreo se for necessário. Use o exemplo para várias experiências vitreodynamic.
    1. Colocar a amostra num copo de vidro com uma área superficial conhecida exposta ao ar. Coloque sonda sensível ao oxigénio no bordo da amostra. Usar um micro-manipulador para mover a sonda para uma distância conhecida (R) na amostra.
    2. Use Lei de Fick para obter a equação de difusão teórico. Com a data recolhidas no passo 10.1, obtenha o termo coeficiente de difusão experimental / reação etc.

Representative Results

Seguindo o protocolo irá levar a uma dissecção do vítreo bem sucedida com o núcleo e o córtex (Figura 3) intactos. Isto é evidente a partir dos pedaços residuais de retina aderiram ao córtex vítreo. Todo intacta humor vítreo pode ser usado de várias maneiras para experiências vitreodynamic específicos. No nosso caso, a taxa de difusão do oxigénio no humor vítreo intacto e é constante de tempo correspondente foi estudada (Figura 2). Vítreo que foi dissecado (núcleo e córtex), usando o nosso método foi colocada numa proveta de vidro com uma área de superfície exposta conhecido. Isto foi comparado com vítreo que foi colhido utilizando um método previamente publicado que apenas isola núcleo vítreo ^6. Todos os outros fatores foram mantidos consistentes entre os grupos experimentais e controle. A superfície vítrea foi exposta ao ar, que tem uma tensão de oxigénio conhecido (~ 160 mmHg). A tensão de oxigénio no vítreo era baixa (<10 mmHg). Com base na taxa de vitrconsumo EOUS oxigênio determinada pela Shui et al. ¹⁴ para vítrea no estado gel, podemos usar a equação para um transporte de oxigênio dimensional (em formas de estado estacionário ou instáveis). Através da medição da tensão de oxigénio dentro de uma distância conhecida a superfície vítrea, pode-se experimentalmente validar o coeficiente de difusão. A tensão de oxigénio foi gravado com uma sonda de oxigénio, tais como Oxford, e a taxa de erro foi de ± 10%. A amostra foi coletada a cada 30 seg. A presença de córtex vítreo afeta a taxa de difusão de oxigênio no vítreo médio. Na presença de córtex vítreo, a difusão de oxigénio ocorre ao longo de um intervalo de tempo mais longo.

As propriedades físicas do núcleo vítreo e córtex ter um impacto na saúde e na doença. Por exemplo, localizada, oxigenação intra-ocular suplementar tem sido proposta como um tratamento para a isquemia retiniana ^8. Compreender os diferentes coeficientes de difusão para oxigênio através córtex vítreonúcleo irá permitir aos pesquisadores prever a taxa real de fornecimento de oxigênio na retina.

Figura 1:. Vista em corte transversal do olho exibindo estruturas anatômicas relevantes (modificado a partir do National Eye Institute, National Institutes of Health) A córnea é o tecido transparente que forma o anterior mais parte do olho e fornece uma porção significativa do olho de óptica poder. O limbo é a junção da córnea, conjuntiva e esclera. A esclerótica se estende a partir do limbo para posterior mais alargamento do olho onde se encontra o nervo óptico. A conjuntiva é uma fina epitélio que reveste o muito fora do olho e forma o limite entre o ambiente externo e a esclerótica. Os componentes internos do olho consistem na câmara anterior, lente, íris, corpo ciliar, câmara posterior, cavidade posterior, retina e coróide. O vitreous núcleo compreende a região central do corpo vítreo, no interior da cavidade posterior do olho. O córtex vítreo está localizado ao redor do corpo vítreo e está ligado à retina em vários pontos, incluindo a pars plana, vasos retinianos, disco óptico e mácula. A base do vítreo representa uma zona tridimensional que se estende a partir de ~ 2 milímetros anterior para a ora serrata até 3 mm posterior ao ora serrata. A coróide é uma camada de tecido vascular, que está localizado entre a esclera e da retina e proporciona o fornecimento de sangue à retina externa. A retina é a camada neurossensorial do olho que subserves a capacidade de enviar luz do olho. A esclera é a camada branca opaca que fornece grandes quantidades do suporte estrutural à parede do olho.

Figura 2:. Lote de tensão de oxigênio de humor vítreo contra o tempo Lote de tensão de oxigênio no núcleo vítreo (linha verde) em comparação com todo intacto vitreous (linha azul). Uma sonda de detecção de oxigénio foi colocado no meio da amostra e a amostra foi exposta a ar que tem uma tensão de oxigénio de 160 mmHg.

Figura 3: Exemplos de todo isolado corpo vítreo. Imagem de topo é um exemplo de todo o corpo vítreo intacta ainda ligado ao aro escleral. Imagem secundária é um exemplo de todo o corpo vítreo intacto sem esclera mas com algum tecido da retina restante. Fundo é um exemplo de todo corpo vítreo, intacta.

Discussion

Existem dois passos críticos que devem ser cuidadosamente realizados durante a dissecção vítreo. Passo 3, a criação de uma aba escleral de espessura total, é crucial para toda a dissecção. Cuidados devem ser tomados para não cortar na coróide ao criar a espessura total retalho escleral. O outro passo crítico é dissecar afastado da esclera da coróide. Esta etapa deve ser feito com cuidado para evitar a criação de vários buracos na coróide de que o vítreo pode derramar. Existe uma maneira de modificar o protocolo e ainda dissecar todo intacto humor vítreo. Passo 6 pode ser atrasada até que o passo 8. O coróide pode ser removido no final, após o tecido vítreo é posicionada na localização desejada.

A limitação deste procedimento é que durante a dissecção, há somente pistas visuais para sugerir o sucesso ea precisão da dissecção vítreo intacta. Uma vez que o núcleo vítreo e córtex são ambas transparentes e indistinto a olho nu, istopode ser um desafio. Ao perceber a adesão da retina para o vítreo, é possível determinar se a dissecção de sucesso do córtex vítreo ocorreu. Caso contrário, as substâncias farmacológicas, tais como Kenalog, pode ser utilizado para melhorar a visualização ¹⁵ do vítreo mas não pode prontamente permitem distinguir entre córtex vítreo e o núcleo vítreo. Outra limitação desta técnica é que é mais eficaz para a dissecção do vítreo gel. Gel vítreo humano é um tecido não-regenerativo que sofre de liquefacção com a idade. Este liquefacção nos impede de dissecar completamente todo o vítreo, intacta do olho. Assim, a nossa técnica estende-se apenas ao vítreo de animais, tais como vacas, porcos ou coelhos, ou olhos de humanos jovens que não têm quantidades significativas de liquefacção. O humor vítreo nestes animais tende a ser completamente num estado de gel.

No entanto, atualmente, não há nenhum método estabelecido, que tem sido descRiBED em detalhe, para dissecar todo vítreo intacto de olhos de cadáveres. Atualmente, as únicas técnicas de dissecação vítreos que foram bem detalhados envolvem a dissecção das regiões únicas, mas separadas do vítreo ⁷ ou a dissecação de apenas o núcleo vítreo ^6.

As aplicações da dissecados humor vítreo intacta estão sob apreciado e subutilizadas. A experiência cirúrgica com o vítreo, bem como estudos clínicos, bioquímicos e histopatológicos sugere que as propriedades químicas e estruturais do vítreo podem variar significativamente ^16,17. Portanto, é necessário para preservar a estrutura de todo o corpo vítreo para estudar a função do vítreo na fisiologia ocular e anatomia. Vítreo intacta pode ser explantado a um globo transparente para melhor visualização durante as experiências. Eles podem, então, ser usado para uma variedade de testes e / ou químico-mecânico para melhorar as medições de suporte físico / biomecânicoerties do humor vítreo. Por exemplo, sugere-se que todo o vítreo intacta dissecados pode ser usado em vez de solução salina, substitutos viscosos, ou núcleo vítreo nas experiências citadas reologia ^6,18.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 forceps	Storz Opthalmics	E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right	Storz Opthalmics	E3320 R
Scalpel Handle No. 3	VWR	25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle	VWR	470174-844