Abstract
Celinkapselende werd ontwikkeld om levende cellen te vangen binnen semi-permeabele membranen. De geënte ingekapselde cellen kunnen laagmoleculaire metabolieten wisselen in weefsels van de behandelde gastheer voor overleving op lange termijn realiseren. Het halfdoorlaatbare membraan maakt geënt ingekapselde cellen om afstoting te voorkomen door het immuunsysteem. De inkapselingsprocedure is ontworpen om een gecontroleerde afgifte van bioactieve stoffen, zoals insuline, andere hormonen en cytokinen mogelijk. Hier beschrijven we een werkwijze voor het inkapselen van katabole cellen, welke lipiden om warmte en energiedissipatie (thermogenese) in de intra-abdominale vetweefsel van obese muizen verbruikt. Inkapseling van thermogene katabole cellen kunnen eventueel van toepassing zijn op de preventie en behandeling van obesitas en type 2 diabetes. Een andere mogelijke toepassing van katabole cellen kunnen detoxificatie van alcoholen of andere toxische metabolieten en milieuverontreinigende stoffen.
Introduction
Toenemend aantal chronische ziekten 1 heeft studies gestimuleerde op transplantatie van de therapeutische celpopulaties 2. Syngene of allogene stamcellen zijn de meest gebruikte celtypen voor deze toepassingen 2. Echter, deze behandelingen geen controle van differentiatie en migratie van stamcellen na implantatie mogelijk te maken en zijn niet kostenefficiënt. Transplantatie van genetisch gemodificeerde cellen met voordelige functies anticipeert verbeteren van de behandeling van vele ziekten. Echter, genetische modificaties cel herkend door het immuunsysteem van de gastheer derhalve deze behandelingen vereisen immunosuppressie 3. Het inkapselen van cellen die insuline is ontwikkeld door Dr. Chang 4. De techniek is gebaseerd op het inkapselen van cellen in alginaat druppels die worden ondergedompeld in een calciumchlorideoplossing. Alginaat moleculen omvatten mannuronzuur (M) en guluronzuur (G) en kunnen worden verbonden door Ca 2+. Na gelering worden de korrels gesuspendeerd a poly-L-lysine (PLL) oplossing. Tijdens deze stap, PLL bindt aan G en M in het alginaat moleculen die het membraan van de capsule vaststelt. De porositeit van het membraan van de capsule kan worden gemoduleerd door het variëren van de M en PLL concentraties, de incubatietijd en temperatuur. De binding van de PLL ook afhankelijk van de soort en concentratie van alginaat. Alginaat matrices verknoopt met Ca2 + -ionen zijn instabiel bij fysiologische omgeving of gemeen bufferoplossingen met een hoge concentratie fosfaat en citraat-ionen. Deze buffers kunnen halen Ca 2+ van het alginaat en vloeibaar te maken de kern. Vloeibaar maken van het alginaat kern biedt ruimte binnen de capsules voor cellulaire beweging en groei. Cellen ingekapseld in polyanionische alginaat met polykation poly-L-lysine (APL) impermeabel voor immunoglobulinen maar instroom van nutriënten en efflux van toxines. Deze eigenschappen APL's mogelijk te maken op de lange termijn survival van ingekapselde cellen na transplantatie in genetisch verschillende hosts. Elliott et al. Beschreven de overleving functioneren ingekapselde varkens pancreas cellen in een menselijke patiënt negen jaar na implantatie 5.
Inkapseling technieken kunnen worden ingedeeld in microinkapseling (3-800 urn) en macro-inkapseling (groter dan 1000 urn). Microcapsules zijn duurzamer dan macrocapsules 6. Sinds de ontdekking door Dr. Chang en collega's in 1964, is mikroinkapseling wijd gebruikt voor het inkapselen van anabole cellen produceren insuline, andere hormonen, en bioactieve moleculen 7. Deze behandelingen geconfronteerd met verschillende uitdagingen in de gastheerweefsel inclusief fibrose en immuunrespons 8. Aanvankelijk zijn de bijwerkingen die verband houden met de kwaliteit van biopolymeren opgelost. Echter, transplantatie van anabole cellen initieert steeds neveneffecten, zoals fibrose ten gevolge van hormonale overproductie buiten een gespecialiseerde klier.
In de afgelopen decennia, obesitas en type 2 diabetes heeft epidemische proporties 9 bereikt. Meer dan 30% van de volwassen mensen wereldwijd zijn overgewicht en obesitas 10. Toegenomen intra-abdominale (IAB) vetvorming verhoogt incidentie van chronische ontsteking en bevordert Type 2 diabetes, hart- en vaatziekten, bepaalde vormen van kanker en andere morbidities 11-13. Verschillende lijnen van bewijs suggereerde dat pathogenese geassocieerd met IAB vet kan worden afgewend door specifieke adipocyten. Recente studies hebben aangetoond dat transplantatie van subcutane adipocyten in IAB gebied kan verbeteren metabolisme en obesitas en insulineresistentie afname van knaagdieren in vivo 14. Effectieve vermindering van obesitas en insuline resistentie is geassocieerd met thermogene adipocyten energie kunnen absorberen in de vorm van warmte 15,16. Thermogene modificatie van adipocyten kan worden bereikt door stabiele transfectiegenen die deelnemen aan de mitochondriële ontkoppeling proton, zoals ontkoppelingseiwit 1 (UCP1) of genen die expressie van UCP1 en andere thermogene genen 15,16. Onze recente studies aangetoond dat tekort aan aldehyde dehydrogenase 1 a1 (Aldh1a1) tot een thermogene verbouwing van lab vet dat obesitas en insulineresistentie vermindert in deze muizen 17,18. Met name, inkapseling van thermogene Aldh1a1 deficiënte (Aldh1a1 - / -) preadipocytes medieert hetzelfde therapeutisch effect bij IAB vet in obese wildtype muizen, wat suggereert nieuwe therapeutische mogelijkheden voor de behandeling van lab vet 18. In experimentele instellingen ingekapselde cellen kunnen de onderzoekers effecten van specifieke celpopulaties te bestuderen op een kosteneffectieve wijze 19. Hier bespreken we de methode van inkapseling van een thermogene katabole cellijn en zijn laboratorium en therapeutische toepassing in een muismodel van obesitas. Het protocol beschrijft trie fasen microcapsule productie (Figuur 1): de vorming van het alginaat microkorrels (figuur 1A), de vorming van polykation poly-L-lysine (PLL) membraan op het oppervlak van de microbolletjes (figuur 1B), en het verwijderen van de alginaat kernen (figuur 1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Ohio State University ethische commissies. Dierproeven werden goedgekeurd door IACUC protocol. Alle procedures werden uitgevoerd onder het niveau 2 bioveiligheid kast met laminaire stroming. We volgden alle standaard veiligheidseisen en procedures. De micro-inkapseling techniek voor bereiding van microcapsules werd uitgevoerd zoals beschreven 17, 18.
1. Voorbereidingen van Materialen
- Maak 10 ml van 2% natriumalginaat-oplossing in een autoclaaf behandeld fysiologische zoutoplossing (0,9% NaCl in water). Bereid 0,05% PLL oplossing in fysiologische zoutoplossing. Bereid deze oplossingen de dag vóór en roer 's nachts. Filtreer de oplossing met 0,22 urn filter vóór gebruik.
- Bereid 50 mM natriumcitraat en 100 mM CaCl 2 in 0,9% NaCl oplossingen autoclaaf hen.
- Autoclaaf alle oplossingen, naalden, elektroden, en bekers. Grondig schone naalden met draden om te voorkomen dat verstopping.
- De geschikte hoeveelheid cellen te gebruiken voor de capsules (102 microcapsules zijn noodzakelijk voor elke cm 2 goed en er ongeveer 500 cellen per capsule 18). Gebruik 1 ml natrium alginaat per twee miljoen cellen.
- Bereid een "Fibroblast Growth Medium" met 10% kalfsserum en 100 U / ml penicilline / streptomycine in een hoge glucose (4500 mg / l glucose) Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM).
- Bereid een 'differentiatiemedium I "met 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml insuline, 1 uM dexamethason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methyl- xanthine, en 100 U / ml penicilline / streptomycine in DMEM.
- Bereid een "differentiatiemedium II 'met 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml insuline en 100 U / ml penicilline / streptomycine in DMEM.
- Bereid lysis buffer die een proteaseremmer tablet per 10 ml Radio-immunoprecipitatie assay buffer (RIPA buffer).
2. Alginaat Microbeads Voorbereiding (figuur 1A)
- Verwijder oude medium uit celkweek kolf. Cellen spoelen met 10 ml PBS. Breng cellen in suspensie met 0,25% trypsine-EDTA (2 ml per één samenvloeiing T175 kolf).
- Tellen cellen in celsuspensie met een hemocytometer. Gebruik 10 ml aliquot van de celsuspensie en tel cellen volgens instructies van de fabrikant. Centrifugeer de overige cellen in medium centrifugatie bij 480 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Suspendeer de celpellet in natriumalginaat zoals beschreven in stap 1.4. Breng de natriumalginaat-celoplossing een 5 ml spuit.
- Verwijder luchtbellen uit de oplossing, voeg een 23-gauge naald en keren de injectiespuit een 1 ml luchtzak creëren.
- Plaats een kleine beker (180 ml) met 144 ml van 100 mM CaCl2 oplossing onder de naald uitloop van de encapsulator. Bevestig de elektrode naar de encapsulator met de punt approximdellijk 2,5 cm boven het oppervlak van de 100 mM CaCl 2-oplossing.
- Plaats stevig de spuit met het natriumalginaat-celoplossing in de injectiepomp. De rubberen buis de opening van de spuit. Duw de zuiger totdat de natriumalginaat-cel-oplossing komt halverwege de buis. Stel de spanning 5,4 kV. Stel de 12,06 mm diameter op de injectiepomp. Pas de snelheid tot 3 ml / uur. Start de pomp. Zet de encapsulator en de spanning te handhaven op 5,4 kV.
- Sluit het venster van de motorkap en geen onnodige trillingen tot het einde van de vorming van de alginaat microbolletjes. Immers oplossing gaat door de naald, stollen de alginaat bolvormige microbolletjes in 100 mM CaCl 2-oplossing gedurende nog 20 min voor het bekleden met PLL.
3. Coating Microkralen met PLL (Figuur 1B)
- Verwijder de beker die de natriumalginaat-cell bolvormige microbolletjes en breng deze microbEADS in een 50 ml centrifugebuis. Verwijder CaCl 2-oplossing uit de microkorrel pellet.
- Was de alginaat-cell bolvormige microbolletjes door toevoeging van 30 ml 0,9% NaCl. Schud de buis met de hand voorzichtig. Verwijder 0,9% NaCl met 25 ml pipet nadat de microbolletjes hebben neergeslagen door zwaartekracht. Herhaal nog twee keer voor een totaal van 3 wasbehandelingen.
- Gebruik 10 ml van 0,05% PLL oplossing voor elke 1 ml van natriumalginaat-oplossing. Voeg 0,05% PLL en vortex bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 10 min.
Opmerking: Meestal 10 min is voldoende voor PLL coating. - Na PLL jas is gevormd, verwijdert u de PLL-oplossing en was de capsules 3 keer zoals beschreven in 3.2.
4. Verwijdering van Alginate Core (figuur 1C)
- Voeg 30 ml van 50 mM natriumcitraat-oplossing. Wacht 5 minuten of totdat alle natriumalginaat opgelost. Was capsules driemaal zoals beschreven in stap 3.1.1.
- Verwijder het 0,9% NaCl, voeg 20 ml kweekmedium aan de 50 ml buisgeheel overgaat capsules bevatten de cellen een celkweekkolf. Behandel ingekapselde cellen onder standaard celcultuur omstandigheden 18.
5. In vitro toepassingen voor xenograft en gastheercel interactie of Kinetiek van Afbraakproduct Influx / Efflux tussen cellen te bestuderen (figuur 2)
- Cultuur gastheercellen op 24 well plaat tot samenvloeiing voor co-culturen. Gebruik de 'Fibroblast Growth Medium' te kweken preadipocyten.
- Transfer microcapsules in 24 wells plaat met confluent gastheercellen. Microcapsules met een monolaag te bereiken (102 microcapsules / cm2 goed) toe te voegen.
- Opwekken pre-adipocytdifferentiatie met Differentiatie Medium I. Elke 48 uur, verandering media om Differentiatie Medium II voor zes dagen. Lyse cellen in RIPA-buffer. Gebruik 50 ug eiwit per voorwaarde om eiwitexpressie te analyseren met behulp van Western blot.
6. In vivo toepassing voor treatment of Obesity (figuur 3)
- Meng 4% isofluraan met zuurstof voor anesthesie en 2% isofluraan met zuurstof onderhoud van anesthesie. Bevestig adequate verdoving diepte door teen knijpen.
- Breng anti-jeuk zalf op de ogen van de hoornvliezen beschermen tegen uitdrogen.
- Gebruik ingekapselde cellen die permanent zijn gelabeld met kunstmatige fluorescentie-eiwit, zoals groene fluorescentie eiwit (GFP).
- Gebruik een 3 ml spuit en een 20 gauge naald om ingekapselde cellen te injecteren.
- Injecteer 0,5 x 10 6 cellen gesuspendeerd in 0,2 ml PBS in elk IAB depot vet dat zich in het gebied tussen een intraperitoneale gonaden en nieren zoals getoond in figuur 3. Met dit volume PBS en aantal cellen voor muizen met een gemiddeld gewicht van 40 g. Stel celaantal en het volume in muizen die een ander gewicht of voor de bepaling van de dosis-afhankelijke effecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 laat zien dat elke stap van microbeads productie onder de microscoop kan worden gecontroleerd. Figuur 2A laat zien hoe co-cultuur adipocyten met een monolaag van ingekapselde cellen. Figuur 2B is een representatief voorbeeld van een kwantitatief onderzoek met adipocyte / microcapsules co-culturen die werden in hoofdstuk 5. Lysaten beschreven van adipocyten werden geanalyseerd met behulp van Western blot. Ingekapselde cellen werden niet geanalyseerd in dit experiment. Primaire ATGL en β-actine antilichamen werden gebruikt bij een 1: 1000 verdunning. De verhouding van ATGL naar β actine worden getoond als gemiddelde ± SD voor van drie onafhankelijke experimenten. Soortgelijke co-kweek benaderingen kunnen worden gebruikt om mRNA te analyseren en bestuderen effecten van ingekapselde cellen en adipocyten interacties in co-culturen. Gegevens blijkt dat ingekapseld thermogene Aldh1a1 - / - adipocyten veroorzaken beduidend hoger niveau van ATGL lipase en lipolyse 18 in adipocyten vergelijking met encapsulated WT adipocyten.
Figuur 3 toont dat GFP aangeeft locatie en de integriteit van capsules in de ontvangende vetweefsel. De expressie van GFP is een indicator van de levensvatbaarheid van de cellen.
Kwalitatieve evaluatie
De kwaliteit van de inkapseling of implantatie van ingekapselde cellen kunnen worden geëvalueerd door microscopie, MRI en immunohistochemische analyse van behandelde vetweefsels 18.
Kwantitatieve benadering
Gezien de unieke expressie van GFP in overlevende getransplanteerde cellen, de meting van GFP expressie toestaan ingekapselde cellen worden gekwantificeerd in weefselkweek beschreven 18 .GFP en andere eiwitten kunnen worden gedetecteerd met behulp van specifieke anti-GFP antilichamen in een homogenaat van een geheel vetweefsel depot. De GFP eiwitgehalte in deze homogenaat geven informatie over het aantal levensvatbare cellen geïmplanteerd.
Figuur 1: Een schematische weergave van de procedure voor microcapsule productie. (A) alginaat microbolletjes onder een microscoop (20x). (B) de buitenste laag na bekleden met PLL (20X). (C) de uiteindelijke microcapsule na het oplossen van de alginaat kern (20X). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Microcapsule co-culturen met aanhangend cellijnkweken (A) Schematische (onderste paneel) van een co-cultuur van microcapsules (cirkels drijvend in media) met aanhangend adipocyten.. (B) Vergelijking van de expressie van ATGL uit3T3-L1 adipocyten co-gekweekt met acellulair, WT of Aldh1a1 - / - adipocyte met microcapsules. Significantie p-waarde werd bepaald met Mann-Whitney U test. Upper inserts toont één vertegenwoordiger Western blot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Schema van een intra-abdominale (IAB, visceraal vet) injectie met ingekapselde cellen Het fotografische beeld van de geïnjecteerde REb vetkussentje toont verkleurde clusters van ingekapselde cellen 80 dagen na transplantatie (driehoek). Deze IAB rage pad werden ingebed in paraffine en geanalyseerd. Hematoxyline en eosine (H & E) kleuring toont clusters van ingekapselde cellen (pijlen), geïmplanteerde microcapsules (C), ingekapseldcellen (CC) talrijke adipocyten (A). Hetzelfde beeld onder tl-licht geanalyseerd toont-GFP gelabelde getransplanteerde cellen aan de binnenkant van round intacte capsules. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende werkwijzen zijn gebruikt om cellen, met inbegrip van drogen, extrusie en emulsie 19 te kapselen. In deze werkwijze worden de alginaatparels geëxtrudeerd door een naald, vervolgens met PLL en het alginaat kern wordt ontbonden de inkapseling te voltooien. Hoewel deze methode is gebruikt voor jaren, de vorming van de bolletjes met de gewenste grootte en bolvorm blijft een uitdaging. De grootte van de capsules is sterk afhankelijk van de viscositeit van natriumalginaat-oplossing, de extruder diameter en de afstand tussen de naaldpunt en de CaCl 2-oplossing 20. Hoe kleiner de afstand tussen de naaldpunt en het oppervlak van CaCl 2-oplossing is, hoe kleiner korrels geproduceerd. De beschreven protocol leidt tot de productie van APL met poriën (<32 kD). De poriegrootte kan experimenteel getest worden met fluorescerende immunoglobulinen (> 32 kD) en fluorescent kleine peptiden zoals hiervoor beschreven 18. Deze size van de porie genoeg om overleving van cellen ondersteunen in vitro kweken gedurende 2 weken en na in vivo implantatie in vetweefsel gedurende ten minste 80 dagen 18. The microbeads vorm een belangrijke factor het overleven van ingekapselde cellen beïnvloeden. Gebarsten kralen met vele satelliet microbeads verhogen uitsteeksel van de cellen 21. Satelliet vorming gebeurde toen lagere concentratie en een lage viscositeit intermediaire-G alginaat oplossingen worden toegepast 22, terwijl de vorming van de staart is te wijten aan high-G alginaat 23. Aangezien de afschuifkracht kan ook bijdragen aan gekraakte bolletjes aanbevolen een zachte wasprocedure voor microkralen en stelt geoptimaliseerd productievoorwaarden robuuste capsules die geschikt zijn voor in vitro co-kweken en geënt in weefsels in vivo.
Microcapsulation heeft bewezen een effectieve methode voor implantatie voor het beschermen van biologische stoffen zoals cellen, cytokines, enzymen, hormonen, en bioabsorbents uit de omgeving en 24 immuunrespons. De gecontroleerde afgifte van hormonen of cytokines van ingekapselde cellen werd getest op de therapeutische effecten bij een groot aantal ziekten, waaronder obesitas 18, diabetes mellitus 5, leverfalen 25 en 26 anemie. Echter, de effectiviteit van geënte anabole ingekapselde cellen vaak verminderd als gevolg van fibrose. De nieuwe toepassing van thermogene katabole cellen Hier beschrijven we voor de behandeling van obesitas en insulineresistentie 18. Inkapseling van Aldh1a1 - / - adipocyten, en eventueel andere katabolische cellen, hebben verschillende voordelen ten opzichte van inkapselen van anabole cellen Aldh1a1 -. / - Preadipocyten spontaan hechten aan het binnenoppervlak van de APL membraan 18 en differentiëren in de adipogene omgeving van lab vet voorkomt hun buitensporige proliferatie in capsules en snelle breuk van capsules. In addition, zijn deze cellen ontstekingsreacties en katabole eigenschappen 27 verminderd. Immunohistochemische gegevens blijkt dat de implantatie van ingekapselde Aldh1a1 APL - / - adipocyten in IAB vet 80 dagen ging niet gepaard met uitgesproken immuunrespons en fibrose bij muizen 18; moeten echter meer onderzoek in de toekomst potentiële inflammatoire effecten te evalueren worden uitgevoerd. Voornamelijk, Aldh1a1 tekort verhoogt uitdrukking van thermogene UCP1 in adipocyten. Aldh1a1 tekort vermindert autocriene productie van retinoïnezuur toenemende retinaldehyde 28. Deze route beïnvloedt tal transcriptionele paden 28,29, die kunnen worden bij de productie van intrinsieke en paracriene thermogene factoren. Met name, ingekapseld Aldh1a1 - / - adipocyten cellen produceren vergelijkbaar thermogene respons in gastheer obese WT muizen. Ingekapselde Aldh1a1 - / - adipocyten blijken paracriene factor (en) produceren increasing aantal UCP1 -positieve cellen in de gastheer WT vetweefsel 18. Samen vormen deze thermogene reacties resulteerde in een preferentiële verlaging van de geïnjecteerde IAB vet. Een fenotype van vereeuwigd Aldh1a1 - / - preadipocyten oefent vele eigenschappen die dit gen modificatie een veelbelovende kandidaat voor de inkapseling technologie verminderen dieet-geïnduceerde obesitas te maken.
Onlangs veel andere biologicals waaronder cytokine irisin, miR-133a 30, meteorin zoals hormoon 31, parathyroid-hormoon-gerelateerde eiwit 32 werd gemeld dat thermogene verbouwing van onderhuids wit vetweefsel uit te oefenen. Meer onderzoek is nodig om te bepalen of deze thermogene factoren geschikt zijn voor inkapseling technologieën en therapieën tegen obesitas in subcutane en / of IAB vet. Microcapsules die katabole cellen kan eventueel geschikt zijn om een overmaat schadelijke metabolieten in een giftige omgeving te verwijderen. Bijvoorbeeld, de patiënts kunnen profiteren van vergemakkelijkt afbraak van alcohol of deoxyglucosone, een eerste reactieve metaboliet bij patiënten met diabetes. Echter, zijn toekomstige studies nodig om te bepalen of deze aanvragen therapeutische voordelen kan hebben.
Samengevat, deze studies geven een proof-of-concept dat versterking van de thermogene respons in IAB vet kan worden gestart door een klein deel van ingekapseld Aldh1a1 - / - preadipocyten. Bovendien hebben deze studies haalbaarheid van weefsel-specifieke behandeling aangetoond geïnjecteerd implantaten van ingekapselde katabole thermogene cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Jennifer Petrosino en David DiSilvestro bedanken voor redactionele hulp. Dit onderzoek werd gesteund door Award nummer 20020728 van de Amerikaanse Raad van het Ei en Award nummer 10040042 van Novo Nordisk Pharmaceuticals, alsmede door de Food Innovation Center, Bureau voor Internationale Zaken, Center for Advanced Functional Foods Research en Ondernemen op OSU evenals de National Science Foundation verleent de EEG-0914790 (LJL). De beschreven werd ondersteund door Award Number R21OD017244 (OZ) en UL1RR025755 (OSUCCC) van het National Center for Research Resources project, gefinancierd door het Bureau van de directeur, National Institutes of Health (OD) en ondersteund door de NIH Roadmap for Medical Research en NCI P30CA16058. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Center for Research Resources of de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Encapsulation device (VAR V1) | Nisco | LIN-0042 | None |
| KD scientific syringe pump | KD scientific | 780100Y | None |
| Olympus microscope | Olympus Optical | IX70-S8F2 | None |
| Sodium alginate | Sigma | MKBP8122V | None |
| Poly-L-lysine hydrobromide (PLL) | Sigma | 020M5006V | None |
| Calcium chloride | Sigma | SLBJ2662V | None |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 030M0200 | None |
| Sodium chloride | Sigma | SLBD2595V | None |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | Bio-Rad | 456-1093 | None |
| ATGL primary antibody (from rabbit) | Cell Signaling | 2138S | None |
| Secondary anti body (anti rabbit) | LI-COR | 926-68071 | None |
| Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer | Boston BioProducts | D25Y6Z | None |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | RNBD2893 | None |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | None |
| Cortizone 10 anti-itch ointment | Cortizone 10 | C4029138 | None |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | None |
| Newborn calf serum (CS) | Sigma | N4762 | None |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | None |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I0516 | None |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | None |
| Insulin (bovine) | Sigma | I5879 | None |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693159001 | None |
References
- Vogeli, C., et al. Multiple chronic conditions: prevalence, health consequences, and implications for quality, care management, and costs. Journal of general internal medicine. 22, Suppl 3. 391-395 (2007).
- Vija, L., et al. Mesenchymal stem cells: Stem cell therapy perspectives for type 1 diabetes. Diabetes & metabolism. 35, 85-93 (2009).
- Acarregui, A., Orive, G., Pedraz, J. L., Hernandez, R. M.
- Chang, T. M.
- Elliott, R. B., et al. Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation. Xenotransplantation. 14, 157-161 (2007).
- Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210, 908-910 (1980).
- Vos, P., Spasojevic, M., Faas, M. M. Treatment of diabetes with encapsulated islets. Advances in experimental medicine and biology. 670, 38-53 (2010).
- Cotton, C. K.
- Yach, D., Stuckler, D., Brownell, K. D. Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes. Nature medicine. 12, 62-66 (2006).
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Kissebah, A. H., et al. Relation of body fat distribution to metabolic complications of obesity. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 54, 254-260 (1982).
- Bray, G. A., et al. Relation of central adiposity and body mass index to the development of diabetes in the Diabetes Prevention Program. The American journal of clinical nutrition. 87, 1212-1218 (2008).
- Klein, J., et al. What are subcutaneous adipocytes really good for. Experimental dermatology. 16, 45-70 (2007).
- Tran, T. T., Yamamoto, Y., Gesta, S., Kahn, C. R. Beneficial effects of subcutaneous fat transplantation on metabolism. Cell metabolism. 7, 410-420 (2008).
- Seale, P., Kajimura, S., Spiegelman, B. M. Transcriptional control of brown adipocyte development and physiological function--of mice and men. Genes & development. 23, 788-797 (2009).
- Kozak, L. P. Genetic variation in brown fat activity and body weight regulation in mice: lessons for human studies. Biochimica et biophysica acta. 1842, 370-376 (2014).
- Zhang, X., He, H., Yen, C., Ho, W., Lee, L. J. A biodegradable, immunoprotective, dual nanoporous capsule for cell-based therapies. Biomaterials. 29, 4253-4259 (2008).
- Yang, F., et al. The prolonged survival of fibroblasts with forced lipid catabolism in visceral fat following encapsulation in alginate-poly-L-lysine. Biomaterials. 33, 5638-5649 (2012).
- Chang, T. M. Artificial cells with emphasis on bioencapsulation in biotechnology. Biotechnology annual review. 1, 267-295 (1995).
- Chang, T. M. Hybrid artificial cells: microencapsulation of living cells. ASAIO journal. 38, 128-130 (1992).
- Koo, J., Chang, T. M. Secretion of erythropoietin from microencapsulated rat kidney cells: preliminary results. The International journal of artificial organs. 16, 557-560 (1993).
- Weidenauer, U., Bodmer, D., Kissel, T. Microencapsulation of hydrophilic drug substances using biodegradable polyesters. Part I: evaluation of different techniques for the encapsulation of pamidronate di-sodium salt. Journal of microencapsulation. 20, 509-524 (2003).
- Smidsrod, O., Skjak-Braek, G. Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in biotechnology. 8, 71-78 (1990).
- Lewinska, D., Rosinski, S., Werynski, A. Influence of process conditions during impulsed electrostatic droplet formation on size distribution of hydrogel beads. Artificial cells, blood substitutes, and immobilization biotechnology. 32, 41-53 (2004).
- Chan, E. S., Lee, B. B., Ravindra, P., Poncelet, D. Prediction models for shape and size of ca-alginate macrobeads produced through extrusion-dripping method. Journal of colloid and interface science. 338, 62-72 (2009).
- Bhujbal, S. V., Paredes-Juarez, G. A., Niclou, S. P., de Vos, P. Factors influencing the mechanical stability of alginate beads applicable for immunoisolation of mammalian cells. Journal of the behavior of biomedical materials. 37, 196-208 (2014).
- Gushchina, L. V., Yasmeen, R., Ziouzenkova, O. Moderate vitamin A supplementation in obese mice regulates tissue factor and cytokine production in a sex-specific manner. Archives of biochemistry and biophysics. 539, 239-247 (2013).
- Ziouzenkova, O., et al. Retinaldehyde represses adipogenesis and diet-induced obesity. Nature. 13, 695-702 (2007).
- Yasmeen, R., Jeyakumar, S. M., Reichert, B., Yang, F., Ziouzenkova, O. The contribution of vitamin A to autocrine regulation of fat depots. Biochimica et biophysica acta. 1821, 190-197 (2012).
- Liu, W., et al. miR-133a regulates adipocyte browning in vivo. PLoS genetics. 9, e1003626 (2013).
- Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157, 1279-1291 (2014).
- Kir, S., et al. Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia. Nature. 513, 100-104 (2014).
