Abstract
Encapsulación de células fue desarrollado para atrapar células viables dentro de las membranas semi-permeables. Las células encapsuladas injertadas pueden intercambiar metabolitos de bajo peso molecular en los tejidos del huésped tratado para lograr la supervivencia a largo plazo. La membrana semipermeable permite injertado células encapsuladas para evitar el rechazo por el sistema inmune. El procedimiento de encapsulación fue diseñado para permitir una liberación controlada de compuestos bioactivos, tales como la insulina, otras hormonas y citoquinas. Aquí se describe un método para la encapsulación de células catabólicas, que consumen lípidos para la producción de calor y disipación de energía (termogénesis) en el tejido adiposo intra-abdominal de los ratones obesos. La encapsulación de células catabólicos termogénicos puede ser potencialmente aplicable a la prevención y el tratamiento de la obesidad y la diabetes tipo 2. Otra aplicación potencial de las células catabólicos puede incluir la desintoxicación de alcoholes u otros metabolitos tóxicos y contaminantes ambientales.
Introduction
El aumento de incidencia de enfermedades crónicas 1 ha estimulado estudios sobre el trasplante de las poblaciones de células terapéuticas 2. Células madre singénicos o alogénicos son los tipos de células más comúnmente usados para estas aplicaciones 2. Sin embargo, estos tratamientos no permiten el control de la diferenciación y la migración de las células madre después de la implantación y no son rentables. El trasplante de células modificadas genéticamente con funciones beneficiosas prevé mejorar el tratamiento de muchas enfermedades. Sin embargo, las modificaciones genéticas de células son reconocidos por el sistema inmune del huésped, por lo tanto, estos tratamientos requieren inmunosupresión 3. La encapsulación de células productoras de insulina ha sido desarrollado por el Dr. Chang 4. La técnica se basa en la encapsulación de células en gotas de alginato que se sumergen en una solución de cloruro de calcio. Moléculas de alginato consisten en ácido manurónico (M) y gulurónico (G) y se pueden conectar por Ca 2+. Después de la gelificación, las perlas se suspendieron una solución de poli-L-lisina (PLL). Durante este paso, PLL se une a G y M en las moléculas de alginato que establece la membrana de la cápsula. La porosidad de la membrana de la cápsula puede ser modulada mediante la variación de las concentraciones M y PLL, el tiempo de incubación y la temperatura. La unión de PLL también depende del tipo y la concentración de alginato. Matrices de alginato reticulado con iones de Ca2 +, son inestables en el medio ambiente fisiológico o en soluciones tampón comunes con alta concentración de fosfato y iones citrato. Estos tampones pueden extraer Ca 2+ desde el alginato y licuar el núcleo. La licuefacción del núcleo de alginato proporciona espacio interior de las cápsulas para el movimiento celular y el crecimiento. Células encapsuladas en alginato polianiónico con policatiónico poli-L-lisina (APL) son impermeables para inmunoglobulinas, pero tienen afluencia de nutrientes y de flujo de salida de toxinas. ¡Estas propiedades permiten APL largo plazo Dorvival de células encapsuladas después del trasplante en genéticamente diferentes hosts. Elliott et al. Informó la supervivencia de funcionamiento de las células pancreáticas porcinas encapsuladas en un paciente humano nueve años después de la implantación 5.
Las técnicas de encapsulación se pueden clasificar en microencapsulación (3-800 micras) y macroencapsulación (mayor que 1000 micras). Las microcápsulas son más duraderas que macrocápsulas 6. Desde su descubrimiento por el Dr. Chang y sus colegas en 1964, microencapsulación ha sido ampliamente utilizado para la encapsulación de las células productoras de insulina anabólicos, otras hormonas, y moléculas bioactivas 7. Estos tratamientos enfrentan varios desafíos en el tejido huésped incluyendo la fibrosis y la respuesta inmune 8. Inicialmente, se han resuelto los efectos secundarios relacionados con la calidad de los biopolímeros. Sin embargo, el trasplante de células anabólicos todavía inicia efectos secundarios, tales como la fibrosis, como resultado de la hormona overproducción fuera de una glándula especializada.
En las últimas décadas, la obesidad y la diabetes tipo 2 ha alcanzado proporciones epidémicas 9. Más del 30% de las personas adultas en todo el mundo tienen sobrepeso y obesidad 10. Aumento (IAB) la formación de grasa intra-abdominal aumenta la incidencia de la inflamación crónica y promueve la diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares, ciertos tipos de cáncer y otras morbilidades 11-13. Varias líneas de evidencia sugieren que la patogénesis asociada con la grasa IAB puede ser evitado por los adipocitos específicos. Estudios recientes han demostrado que el trasplante de adipocitos subcutáneos en la región IAB puede mejorar el metabolismo y disminuir la obesidad y la resistencia a la insulina en roedores in vivo 14. Reducción efectiva de la obesidad y la resistencia a la insulina se ha asociado con adipocitos termogénicos capaz de disipar energía en forma de calor 15,16. Modificación termogénico de los adipocitos se puede lograr mediante la transfección establede genes que participan en el desacoplamiento de protones mitocondrial, tales como proteína de desacoplamiento 1 (UCP1) o de genes que regulan la expresión de UCP1 y otros genes termogénicos 15,16. Nuestros estudios recientes mostraron que la deficiencia en aldehído deshidrogenasa 1 a1 (ALDH1A1) conduce a la remodelación termogénico de grasa IAB que reduce la obesidad y la resistencia a la insulina en estos ratones 17,18. Notablemente, la encapsulación de termogénico ALDH1A1 deficiente (ALDH1A1 - / -) preadipocitos media mismo efecto terapéutico en grasa IAB en ratones de tipo salvaje obesos, lo que sugiere nuevas oportunidades terapéuticas para el tratamiento de la grasa IAB 18. En los entornos experimentales, las células encapsuladas permiten a los investigadores estudiar los efectos de las poblaciones de células específicas en una manera rentable 19. Aquí hablamos del método de encapsulación de una línea celular catabólico termogénico y su laboratorio y su aplicación terapéutica en un modelo de ratón de la obesidad. El protocolo describe tres fases para la producción de microcápsulas (Figura 1): la formación de las microesferas de alginato (Figura 1A), la formación de la policatiónico poli-L-lisina (PLL) membranas sobre la superficie de microperlas (Figura 1B), y la eliminación de la núcleos de alginato (Figura 1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo de estudio fue aprobado por los Comités de Ética de la Universidad del Estado de Ohio. Los experimentos con animales fueron aprobados por protocolo de IACUC. Todos los procedimientos se realizaron bajo el gabinete de bioseguridad de nivel 2 con flujo laminar. Hemos seguido todos los requisitos y procedimientos de seguridad estándar. La técnica de microencapsulación para la preparación de microcápsulas se ha realizado como se ha descrito 17, 18.
1. Preparación de Materiales
- Preparar 10 ml de solución de alginato de sodio al 2% en solución salina fisiológica en autoclave (0,9% de NaCl en agua). Preparar la solución de PLL 0,05% en solución salina fisiológica. Prepare estas soluciones el día anterior y agitar durante la noche. Filtrar las soluciones con 0,22 micras filtro antes de su uso.
- Preparar citrato de sodio 50 mM y 100 mM CaCl 2 0,9% en soluciones de NaCl y autoclave ellos.
- Autoclave todas las soluciones, agujas, electrodos, y vasos. A fondo agujas limpias con alambres para evitar la obstrucción.
- Determinar la cantidad apropiada de las células a utilizar para las cápsulas (se necesitan 102 microcápsulas por cada cm 2 de bien y hay aproximadamente 500 células por cápsula 18). Usar 1 ml de alginato de sodio por dos millones de células.
- Preparar un 'Medio de Crecimiento de Fibroblastos' que contenía suero de ternero al 10%, y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina en una alta concentración de glucosa (4500 mg / l de glucosa) medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).
- Preparar un 'Diferenciación Medium I' que contiene 10% de suero bovino fetal, 10 mg / ml de insulina, dexametasona 1 mM, 0,5 mM xantina 3-isobutil-1-metilo, y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina en DMEM.
- Preparar un suero 'Diferenciación Medium II' que contiene 10% de bovino fetal, 10 mg / ml de insulina, y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina en DMEM.
- Preparar tampón de lisis que contiene una proteasa tableta inhibidor por Radio-inmunoprecipitación tampón 10 ml Ensayo (RITampón PA).
2. Preparación microperlas de alginato (Figura 1A)
- Retire medio edad, de frasco de cultivo celular. Enjuagar las células con 10 ml de PBS. Llevar las células en suspensión con 0,25% de tripsina-EDTA (2 ml por matraz T175 confluente).
- Contar las células en suspensión de células utilizando un hemocitómetro. Usar 10 ml de alícuota de la suspensión celular y contar las células de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Centrifugar las células restantes en medio de centrifugación a 480 xg a temperatura ambiente durante 5 min.
- Suspender el sedimento de células en alginato de sodio como se describe en el paso 1.4. Transferir la solución de sodio-célula alginato a una jeringa de 5 ml.
- Eliminar las burbujas de aire en la solución, agregue una aguja de calibre 23 e invierta la jeringa para crear un bolsillo 1 ml de aire.
- Coloque un pequeño vaso (180 ml) que contiene 144 ml de 100 mM de solución de CaCl2 debajo de la salida de la aguja del encapsulador. Conecte el electrodo al encapsulador con el aproxim puntaadam ente 2,5 cm por encima de la superficie de la solución 100 mM CaCl 2.
- Coloque firmemente la jeringa que contiene la solución de células de alginato de sodio en la bomba de jeringa. Conecte el tubo de goma a la apertura de la jeringa. Empuje el émbolo hasta que la solución de células alginato de sodio entra a mitad de camino a través del tubo. Ajuste la tensión de 5,4 kV. Ajuste el diámetro de 12,06 mm en la bomba de jeringa. Ajustar la velocidad a 3 ml / hr. Encienda la bomba. Encienda el encapsulador y mantener la tensión en 5,4 kV.
- Cierre la ventana de la campana y evitar cualquier vibración innecesaria hasta el final de la formación de las microesferas de alginato. Después de toda la solución pasa a través de la aguja, solidificar las microperlas en forma de bola de alginato en la solución 100 mM CaCl 2 para 20 min adicionales antes de recubrir con PLL.
3. microperlas recubrimiento con PLL (Figura 1B)
- Retire el vaso que contiene las microperlas en forma de bola de células de alginato de sodio y transferir estos microbEADS en un tubo de centrifugación de 50 ml. Retire solución de CaCl2 a partir del sedimento de microperlas.
- Lavar las microperlas en forma de bola de células de alginato mediante la adición de 30 ml de NaCl al 0,9%. Agitar el tubo con la mano suavemente. Retirar 0,9% NaCl con 25 ml pipeta después de las microperlas han precipitado por gravitación. Repetir dos veces más para un total de 3 lavados.
- Usar 10 ml de solución de PLL 0,05% por cada 1 ml de solución de alginato de sodio. Añadir el PLL 0,05% y el vórtice en 1000 revoluciones por min durante 10 min.
Nota: Por lo general, 10 minutos es suficiente para el recubrimiento de PLL. - Después se forma la capa PLL, retire la solución de PLL y lavar las cápsulas 3 veces como se describe en 3.2.
4. La eliminación de alginato Core (Figura 1C)
- Añadir 30 ml de solución de citrato de sodio 50 mM. Espere 5 minutos o hasta que se disuelva todo el alginato de sodio. Lavar cápsulas tres veces como se describe en el paso 3.1.1.
- Retire el NaCl 0,9%, añadir 20 ml de medio de cultivo al tubo de 50 mly transferir todas las cápsulas que contienen las células a un matraz de cultivo celular. Maneje células encapsuladas en condiciones estándar de cultivo celular 18.
5. En Aplicaciones Vitro para Estudiar xenoinjerto y Host Cell Interacciones o Cinética de metabolitos Afluencia / Eflujo entre células (Figura 2)
- Células huésped Cultura el 24 de placa de hasta confluencia de co-cultivos. Utilice el 'medio de crecimiento de fibroblastos' para preadipocitos de cultivo.
- Microcápsulas de transferencia en 24 placa que contiene células huésped confluente así. Añadir microcápsulas para lograr una monocapa (102 microcápsulas / cm 2 de bien).
- Inducir la diferenciación de pre-adipocitos con Diferenciación Medio I. Cada 48 horas, los medios de comunicación de cambio de Diferenciación Medio II durante seis días. Lisar las células en tampón RIPA. Utilice 50 g de proteína por condición para analizar la expresión de proteína mediante Western blot.
6. En la solicitud de Vivo para Tratamento de la Obesidad (Figura 3)
- Mezclar 4% de isoflurano con el oxígeno para la inducción de la anestesia y 2% de isoflurano con el oxígeno para el mantenimiento de la anestesia. Confirme la profundidad anestésica adecuada por pizca dedo del pie.
- Aplique un ungüento contra la picazón en los ojos para proteger las córneas se sequen.
- Utilice células encapsuladas que están etiquetados de forma permanente con la proteína de fluorescencia artificial, tales como la proteína de fluorescencia verde (GFP).
- Utilice una jeringa de 3 ml y una aguja de calibre 20 para inyectar células encapsuladas.
- Inyectan 0,5 x 10 6 células suspendidas en 0,2 ml de PBS en cada depósito de grasa IAB que se encuentra en la zona intraperitoneal entre una gónada y el riñón como se muestra en la Figura 3. Utilice este volumen de PBS y el número de células para los ratones con un peso medio de 40 g. Ajustar el número de células y el volumen en ratones que tienen diferente peso o para la determinación de los efectos dependientes de la dosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1 muestra que cada paso de la producción de microperlas podría ser controlada bajo el microscopio. La Figura 2A muestra cómo co-cultivo adipocitos con una monocapa de células encapsuladas. La Figura 2B es un ejemplo representativo de un estudio cuantitativo usando adipocitos / microcápsulas co-cultivos que se describe en el capítulo 5. Los lisados de adipocitos se analizaron mediante Western blot. Células encapsuladas no fueron analizados en este experimento. ATGL primaria y anticuerpos β-actina se utilizaron a una dilución de 1: 1000. La relación de ATGL a β-actina se muestran como la media SD de tres experimentos independientes. Enfoques de co-cultivo similares podrían utilizarse para analizar ARNm y estudiar los efectos de las interacciones celulares y adipocitos encapsulados en co-cultivos. Muestra los datos que encapsula ALDH1A1 termogénico - / - adipocitos induce niveles significativamente más altos de ATGL lipasa y la lipólisis en los adipocitos 18 en comparación con encapsulaadipocitos ted WT.
La Figura 3 muestra que GFP indica la ubicación y la integridad de las cápsulas en el tejido adiposo host. La expresión de GFP es también un indicador de la viabilidad celular.
Evaluación cualitativa
La calidad de la encapsulación o la implantación de células encapsuladas podría ser evaluado por microscopía, MRI, y el uso de análisis inmunohistoquímico de tejidos adiposos tratados 18.
Enfoque cuantitativo
Dada la expresión única de GFP en células supervivientes trasplantadas, la medición de los niveles de expresión de GFP permitir que las células encapsuladas para ser cuantificados en el tejido como se describe 18 .GFP y otras proteínas puede detectarse utilizando anticuerpos específicos anti-GFP en un homogeneizado de un tejido adiposo conjunto depot. Los niveles de proteína GFP en este homogeneizado proporcionan información sobre el número de células implantadas viables.
Figura 1: Un diagrama esquemático del procedimiento para la producción de microcápsulas. microperlas (A) de alginato bajo un microscopio (20X). (B) la capa exterior después del recubrimiento con PLL (20X). (C) la microcápsula final después de la disolución del núcleo de alginato (20X). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: co-cultivos de microcápsulas con cultivos de líneas de células adherentes (A) Esquema (panel inferior) de un co-cultivo de microcápsulas (círculos flotando en los medios de comunicación) con adipocitos adherentes.. (B) Comparación de la expresión de ATGL desde3T3-L1 adipocitos co-cultivadas con acelular, WT o ALDH1A1 - / - microcápsulas que contiene adipocitos. Valor P Importancia se determinó mediante la prueba de Mann-Whitney. Inserciones superior muestra un Western blot representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Esquemática de un intra-abdominal (IAB, visceral) inyección de grasa con células encapsuladas La imagen fotográfica de la almohadilla de grasa inyectada IAB muestra racimos descoloridos de células encapsuladas 80 días después del trasplante (triángulo). Estos almohadilla capricho IAB se incrusta en parafina y se analizó. Hematoxilina y eosina (H & E) tinción muestra racimos de células encapsuladas (flechas), microcápsulas implantados (C), encapsuladoscélulas (CC), adipocitos host (A). La misma imagen analizada bajo una luz fluorescente muestra células trasplantadas GFP-etiquetados en el interior de las cápsulas intactas redondas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Varios métodos han sido utilizados para encapsular células, incluyendo secado, extrusión, y la emulsión 19. En este método, las perlas de alginato se extruyen a través de una aguja, a continuación, recubierto con PLL y el núcleo de alginato se disuelve para completar la encapsulación. Aunque este método se ha utilizado durante años, la formación de las perlas con el tamaño deseado y la forma esférica es todavía difícil. El tamaño de las cápsulas es altamente dependiente de la viscosidad de la solución de alginato de sodio, el diámetro del extrusor y la distancia entre la punta de la aguja y la solución de CaCl 2 20. Cuanto más corta sea la distancia entre la punta de la aguja y la superficie de la solución de CaCl2 se, se producen los granos más pequeños. El protocolo descrito conduce a la producción de APL con poros (<32 kD). El tamaño de poro puede ser probado experimentalmente usando inmunoglobulinas fluorescentes (> 32 kD) y pequeños péptidos fluorescentes como se ha descrito previamente 18. Esta esize del poro es suficiente para apoyar la supervivencia de las células en cultivos in vitro durante 2 semanas y después de la implantación in vivo en el tejido adiposo durante al menos 80 días 18. La forma de microperlas es un factor importante que influye en la supervivencia de las células encapsuladas. Granos agrietados con muchos microperlas satélite aumentan protrusión de las células 21. Formación de satélite se produjo cuando la concentración más baja y de baja viscosidad intermedia-G soluciones de alginato se aplican 22, mientras que la formación de la cola es debido a la alta-G 23 alginato. A medida que la fuerza de corte también puede contribuir a los granos rotos, se recomienda un procedimiento de lavado suave para microperlas y proponemos condiciones optimizadas para la producción de cápsulas sólidas adecuadas para in vitro co-cultivos y injerto en los tejidos in vivo.
Microencapsulación se ha demostrado ser un método eficaz para la implantación para la protección de productos biológicos tales como células, citoquinass, enzimas, hormonas, y bioabsorbents desde el medio ambiente y la respuesta inmune 24. La liberación controlada de hormonas o citoquinas de células encapsuladas se ensayó para determinar sus efectos terapéuticos en una amplia variedad de enfermedades, incluyendo la obesidad 18, la diabetes mellitus 5, insuficiencia hepática 25 y anemia 26. Sin embargo, la eficacia de las células encapsuladas anabólicos injertadas es a menudo disminuida debido a la fibrosis. Aquí se describe la nueva aplicación de células catabólicas termogénicos para el tratamiento de la obesidad y la resistencia a la insulina 18. La encapsulación de ALDH1A1 - / - adipocitos, y posiblemente otras células catabólicos, tienen varias ventajas en comparación con la encapsulación de células anabólicos ALDH1A1 -. / - Preadipocitos se adhieren espontáneamente a la superficie interna de la membrana APL 18 y se diferencian en el entorno adipogénica de grasa que IAB impide su proliferación excesiva en cápsulas y rotura rápida de cápsulas. En addition, estas células han disminuido las respuestas inflamatorias y propiedades catabólicas 27. Datos de inmunohistoquímica muestra que la implantación de APL encapsulado ALDH1A1 - / - adipocitos en grasa IAB durante 80 días no fue acompañada por la respuesta inmune pronunciada y fibrosis en ratones 18; Sin embargo, se necesitan más estudios que se realicen en el futuro para evaluar los posibles efectos inflamatorios. En primer lugar, la deficiencia ALDH1A1 aumenta la expresión de UCP1 termogénico en los adipocitos. Deficiencia ALDH1A1 reduce la producción autocrina de ácido retinoico niveles crecientes de retinaldehído 28. Esta vía influye en numerosas rutas de transcripción 28,29, que podrían estar involucradas en la producción de factores intrínsecos termogénicos y paracrinos. Cabe destacar que encapsula ALDH1A1 - / - células adipocitos producen respuesta termogénica similar en anfitrionas obesos ratones WT. Encapsulado ALDH1A1 - / - adipocitos parecen producir el factor paracrino (s) increasing número de células positivas UCP1 en el tejido adiposo WT anfitrión 18. En conjunto, estas respuestas termogénicos resultaron en una reducción preferencial de la grasa inyectada IAB. Un fenotipo de inmortalizado ALDH1A1 - / - preadipocitos ejerce muchas propiedades que hacen de esta modificación genética un candidato prometedor para la tecnología de encapsulación reducir la obesidad inducida por la dieta.
Recientemente muchos otros productos biológicos incluyendo irisina citoquinas, miR-133a 30, meteorin como la hormona 31, proteína relacionada con la hormona paratiroidea--32 fueron reportados ejercer remodelación termogénica del tejido adiposo blanco subcutánea. Se necesitan más estudios para determinar si estos factores termogénicos son adecuados para las tecnologías de encapsulación y terapias contra la obesidad en la grasa subcutánea y / o IAB. Las microcápsulas que contienen células catabólicos pueden ser potencialmente adecuado para eliminar un exceso de metabolitos nocivos en un ambiente tóxico. Por ejemplo, pacientes pueden beneficiarse de catabolismo facilitado de alcohol o desoxiglucosona, una primera metabolito reactivo en pacientes con diabetes. Sin embargo, se necesitan estudios futuros para determinar si estas aplicaciones podrían tener beneficios terapéuticos.
En resumen, estos estudios proporcionan una prueba de concepto que la amplificación de la respuesta termogénica en grasas IAB podría ser iniciado por un pequeño subconjunto de encapsulado ALDH1A1 - / - preadipocitos. Además, estos estudios han demostrado la viabilidad del tratamiento específico de tejido con implantes de células inyectadas termogénicos catabólicos encapsulados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Jennifer Petrosino y David DiSilvestro ayuda editorial. Esta investigación fue apoyada por el premio número 20020728 de la American Egg Board y el Premio número 10040042 de Novo Nordisk Farmacia, así como por el Centro de Innovación de Alimentos, Oficina de Asuntos Internacionales, Centro de Investigación Avanzada Alimentos Funcionales y Emprendimiento en OSU, así como la National Science Foundation concede CEE-0914790 (LJL). El proyecto descrito fue apoyada por el premio número R21OD017244 (OZ) y UL1RR025755 (OSUCCC) desde el Centro Nacional de Recursos para la Investigación, financiado por la Oficina del Director de los Institutos Nacionales de Salud (OD) y apoyado por el NIH Roadmap para la Investigación Médica y NCI P30CA16058. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial del Centro Nacional de Recursos para investigación o de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Encapsulation device (VAR V1) | Nisco | LIN-0042 | None |
| KD scientific syringe pump | KD scientific | 780100Y | None |
| Olympus microscope | Olympus Optical | IX70-S8F2 | None |
| Sodium alginate | Sigma | MKBP8122V | None |
| Poly-L-lysine hydrobromide (PLL) | Sigma | 020M5006V | None |
| Calcium chloride | Sigma | SLBJ2662V | None |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 030M0200 | None |
| Sodium chloride | Sigma | SLBD2595V | None |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | Bio-Rad | 456-1093 | None |
| ATGL primary antibody (from rabbit) | Cell Signaling | 2138S | None |
| Secondary anti body (anti rabbit) | LI-COR | 926-68071 | None |
| Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer | Boston BioProducts | D25Y6Z | None |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | RNBD2893 | None |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | None |
| Cortizone 10 anti-itch ointment | Cortizone 10 | C4029138 | None |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | None |
| Newborn calf serum (CS) | Sigma | N4762 | None |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | None |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I0516 | None |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | None |
| Insulin (bovine) | Sigma | I5879 | None |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693159001 | None |
References
- Vogeli, C., et al. Multiple chronic conditions: prevalence, health consequences, and implications for quality, care management, and costs. Journal of general internal medicine. 22, Suppl 3. 391-395 (2007).
- Vija, L., et al. Mesenchymal stem cells: Stem cell therapy perspectives for type 1 diabetes. Diabetes & metabolism. 35, 85-93 (2009).
- Acarregui, A., Orive, G., Pedraz, J. L., Hernandez, R. M.
- Chang, T. M.
- Elliott, R. B., et al. Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation. Xenotransplantation. 14, 157-161 (2007).
- Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210, 908-910 (1980).
- Vos, P., Spasojevic, M., Faas, M. M. Treatment of diabetes with encapsulated islets. Advances in experimental medicine and biology. 670, 38-53 (2010).
- Cotton, C. K.
- Yach, D., Stuckler, D., Brownell, K. D. Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes. Nature medicine. 12, 62-66 (2006).
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Kissebah, A. H., et al. Relation of body fat distribution to metabolic complications of obesity. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 54, 254-260 (1982).
- Bray, G. A., et al. Relation of central adiposity and body mass index to the development of diabetes in the Diabetes Prevention Program. The American journal of clinical nutrition. 87, 1212-1218 (2008).
- Klein, J., et al. What are subcutaneous adipocytes really good for. Experimental dermatology. 16, 45-70 (2007).
- Tran, T. T., Yamamoto, Y., Gesta, S., Kahn, C. R. Beneficial effects of subcutaneous fat transplantation on metabolism. Cell metabolism. 7, 410-420 (2008).
- Seale, P., Kajimura, S., Spiegelman, B. M. Transcriptional control of brown adipocyte development and physiological function--of mice and men. Genes & development. 23, 788-797 (2009).
- Kozak, L. P. Genetic variation in brown fat activity and body weight regulation in mice: lessons for human studies. Biochimica et biophysica acta. 1842, 370-376 (2014).
- Zhang, X., He, H., Yen, C., Ho, W., Lee, L. J. A biodegradable, immunoprotective, dual nanoporous capsule for cell-based therapies. Biomaterials. 29, 4253-4259 (2008).
- Yang, F., et al. The prolonged survival of fibroblasts with forced lipid catabolism in visceral fat following encapsulation in alginate-poly-L-lysine. Biomaterials. 33, 5638-5649 (2012).
- Chang, T. M. Artificial cells with emphasis on bioencapsulation in biotechnology. Biotechnology annual review. 1, 267-295 (1995).
- Chang, T. M. Hybrid artificial cells: microencapsulation of living cells. ASAIO journal. 38, 128-130 (1992).
- Koo, J., Chang, T. M. Secretion of erythropoietin from microencapsulated rat kidney cells: preliminary results. The International journal of artificial organs. 16, 557-560 (1993).
- Weidenauer, U., Bodmer, D., Kissel, T. Microencapsulation of hydrophilic drug substances using biodegradable polyesters. Part I: evaluation of different techniques for the encapsulation of pamidronate di-sodium salt. Journal of microencapsulation. 20, 509-524 (2003).
- Smidsrod, O., Skjak-Braek, G. Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in biotechnology. 8, 71-78 (1990).
- Lewinska, D., Rosinski, S., Werynski, A. Influence of process conditions during impulsed electrostatic droplet formation on size distribution of hydrogel beads. Artificial cells, blood substitutes, and immobilization biotechnology. 32, 41-53 (2004).
- Chan, E. S., Lee, B. B., Ravindra, P., Poncelet, D. Prediction models for shape and size of ca-alginate macrobeads produced through extrusion-dripping method. Journal of colloid and interface science. 338, 62-72 (2009).
- Bhujbal, S. V., Paredes-Juarez, G. A., Niclou, S. P., de Vos, P. Factors influencing the mechanical stability of alginate beads applicable for immunoisolation of mammalian cells. Journal of the behavior of biomedical materials. 37, 196-208 (2014).
- Gushchina, L. V., Yasmeen, R., Ziouzenkova, O. Moderate vitamin A supplementation in obese mice regulates tissue factor and cytokine production in a sex-specific manner. Archives of biochemistry and biophysics. 539, 239-247 (2013).
- Ziouzenkova, O., et al. Retinaldehyde represses adipogenesis and diet-induced obesity. Nature. 13, 695-702 (2007).
- Yasmeen, R., Jeyakumar, S. M., Reichert, B., Yang, F., Ziouzenkova, O. The contribution of vitamin A to autocrine regulation of fat depots. Biochimica et biophysica acta. 1821, 190-197 (2012).
- Liu, W., et al. miR-133a regulates adipocyte browning in vivo. PLoS genetics. 9, e1003626 (2013).
- Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157, 1279-1291 (2014).
- Kir, S., et al. Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia. Nature. 513, 100-104 (2014).
