Introduction
الكائنات الحية الدقيقة في كل مكان وتلعب أدوارا أساسية في دورات الأرض البيولوجية الكيميائية 1. حاليا، هناك العديد من المناهج الجزيئية المتاحة لتحديد خصائص بنية المجتمع الميكروبي والوظيفة. الأكثر شيوعا هو تحليل 16S الريباسي الجينات تسلسل PCR تضخيم من الحمض النووي البيئية 2-4. عيوب تحليل الجينات 16S الريباسي هو أنه لا يقدم سوى معلومات عن هوية النشوء والتطور وبنية المجتمع، مع القليل من المعلومات عن وظيفة التمثيل الغذائي. في المقابل، تقترب مثل metagenomics، metatranscriptomics وmetaproteomics تقديم معلومات عن بنية المجتمع والتمثيل الغذائي. توفر Metagenomics، أو تحليل المحتوى الجيني لفيف من الكائنات الحية، معلومات عن هيكل والإمكانات الوظيفية للمجتمع 5-8. وعلى الرغم من قوة، وهذه الإمكانات الوظيفية قد لا تتوافق مع الأيضيةأنشطة الكائنات الحية. ويمثل النمط الوراثي للكائن التي كتبها جيناته، كل منها يمكن نسخها إلى RNA وكذلك ترجمت إلى البروتين، مما أدى إلى النمط الظاهري. وهكذا، للمساعدة في فهم النشاط الوظيفي الميكروبي في بيئة وتحليل ما بعد الجينوم يجب أن يتم تنفيذ 9. Metatranscriptomics، أو تحليل النصوص RNA هو مفيد لأنه يكشف الجينات التي تم نسخها في أي بيئة معينة. ومع ذلك، مستويات مرنا لا تتطابق دائما مستويات البروتين يناظرها بسبب تنظيم متعدية، RNA نصف الحياة، وحقيقة أن نسخ متعددة من البروتين يمكن أن تتولد عن كل مرنا 10.
لهذه الأسباب metaproteomics ومن المسلم به الآن كأداة هامة لعلم الأحياء الدقيقة البيئي. يحلل metaproteomic شيوعا استخدام نهج البروتين طلقات نارية حيث يتم تنقية كاملة القريب من البروتينات في عينة المعقدة وتحليلها في وقت واحد، وعادة من خلال ENالهضم zymatic إلى ببتيدات والتحليل على مطياف الكتلة. يستخدم لاحق جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) "البصمات الببتيد" لتحديد تسلسل الببتيد والمحتملين البروتين من أصل بواسطة قاعدة بيانات البروتين البحث (لاستعراض رؤية 11). لقد حان عمل البروتين شوطا طويلا في السنوات ال 25 الماضية بفضل الزيادة في توافر البيانات الجينومية وزيادة حساسية ودقة الطيف الجماعية والسماح لتحديد البروتين الإنتاجية العالية وتقدير 11،12. منذ البروتينات هي المنتج النهائي في التعبير الجيني، يمكن للبيانات metaproteomic تساعد في تحديد الكائنات التي تنشط في أي بيئة معينة وما البروتينات فإنهم يعبرون. هذا هو المفيد عند محاولة تحديد كيف يمكن لمجموعة معينة من المتغيرات البيئية سوف تؤثر على النمط الظاهري للكائن الحي أو المجتمع. في وقت مبكر، واستخدمت دراسات metaproteomic يستند إلى MS-MS / في المحيط لتحديد بروتينات معينة في المستهدفةالأنساب الميكروبية، مع أول دراسة تركز على ضوء مدفوعة مضخة البروتون proteorhodopsin في البكتيريا البحرية SAR11 13. وفي الآونة الأخيرة، توضيح التحليلات metaproteomic المقارنة التفاضلية أنماط التعبير البروتين بين المجتمعات المعقدة. ومن الأمثلة على ذلك تحديد التحولات الزمنية في عملية التمثيل الغذائي في المناطق الساحلية شمال غرب المحيط الأطلسي 14 أو شبه الجزيرة القطبية الجنوبية 5. وقد وصفت دراسات أخرى الاختلافات في أنماط التعبير البروتين عبر النطاقات المكانية، على سبيل المثال، على طول قطاع من الجغرافي من تلفيف المحيط منخفضة في المغذيات إلى نظام الموجات المتقلبة الساحلي مثمرة للغاية (15). للحصول على مزيد من الآراء metaproteomics نوصي شنايدر وآخرون (2010) 9 ويليامز وآخرون (2014) 16. كما تم توظيف البروتينات المستهدفة في السنوات الأخيرة لتحديد التعبير من المسارات الأيضية محددة في البيئة 17،18.
ذره هي ثلاث مراحل رئيسية في التحليل metaproteomic. المرحلة الأولى هي إعداد نموذج، والذي يتضمن جمع العينات، تحلل الخلية وتركيز البروتين. جمع العينات في علم الأحياء المجهرية البحرية غالبا ما ينطوي على ترشيح مياه البحر من خلال ما قبل التصفية لإزالة الخلايا حقيقية النواة أكبر والجزيئات والبكتيريا المرتبطة الجسيمات، تليها الترشيح للقبض على الخلايا الميكروبية تعيش حرة، عادة مع استخدام خرطوشة 0.22 ميكرومتر وحدة تصفية 19،20. وincased هذه المرشحات في اسطوانة بلاستيكية وسيكون لتحلل الخلايا والبروتين بروتوكول الاستخراج التي يمكن القيام بها داخل وحدة مرشح أن يكون أداة قيمة. مرة واحدة يتم الحصول على الكتلة الحيوية، ويجب أن يكون هي lysed الخلايا للسماح لاستخراج البروتين. يمكن استخدام العديد من الطرق، بما في ذلك غوانيدين، حمض الهيدروكلوريك تحلل 21 والصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) وسائل تحلل المستندة. على الرغم من المنظفات مثل SDS هي فعالة جدا في تعطيل الأغشية والانحلال العديد من أنواع البروتين، concentratiإضافات منخفضة كما يمكن أن تتداخل مع 0.1٪ المصب الهضم من البروتين وتحليل MS 22. قلق كبير من الآثار السلبية للSDS على كفاءة الهضم التربسين، حل السلطة من العكسي اللوني المرحلة السائلة والأيونات قمع أو تراكم داخل المصدر أيون 23.
المرحلة الثانية هي تجزئة وتحليل، حيث يتعرضون للبروتينات الهضم الأنزيمي تليها تحليل LC MS / MS، مما أدى إلى نمط تجزئة صباحا / ض التي يمكن استخدامها للتأكد من تسلسل الحمض الأميني الأساسي للالببتيد زيتية الأولي. لا يمكن أن يؤديها أساليب الهضم المختلفة تبعا لأنواع المنظفات المستخدمة، وكذلك المصب سير العمل مطياف الكتلة. في بروتوكول لدينا، ويستخدم 1-D PAGE الكهربائي تليها إزالة SDS من الجل من أجل إزالة أي تلوث المنظفات. تحليل البروتينات التي يصعب إذابة، مثل بروتينات الغشاء، يتطلب استخدام concen عاليةtrations من SDS أو المنظفات الأخرى. وهذا يؤدي إلى مشاكل التوافق مع SDS هلام الكهربائي. إذا كان الهدف من الدراسة يتطلب الإذابة هذه بجد لإذابة البروتينات، ونظام أنبوب هلام يمكن استخدامها 22،24. يتضمن طريقة أنبوب هلام البروتينات داخل المصفوفة هلام دون استخدام الكهربائي. بعد ذلك يتم إزالة أي المنظفات المستخدمة لإذابة قبل هضم البروتين.
المرحلة الثالثة هي تحليل بيوينفورمتيك. في هذه المرحلة يتم البحث في البيانات الببتيد MS / MS ضد قاعدة بيانات للتسلسل النوكليوتيدات ترجمتها لتحديد الببتيدات والبروتينات موجودة في العينة. تحديد الببتيدات يعتمد على قاعدة بيانات يتم البحث عنها ضد. يتم البحث بيانات metaproteomic البحرية عادة ضد قواعد البيانات تتألف من الجينوم المرجعية والبيانات metagenomic مثل مجموعة البيانات العالمية المحيط أخذ العينات 25، فضلا عن خلية تضخيم الجينوم واحدة من لى غير المزروعةneages 26،27. ويمكن أيضا زيادة تحديد البروتين من خلال إدراج تسلسل metagenomic من نفس العينة كما يتضح من البيانات metaproteomic وقد اشتق 5.
نحن هنا نقدم بروتوكول لتوليد الببتيدات مناسبة لتحليل يستند إلى MS-MS / الكتلة الحيوية الميكروبية التي تم جمعها من طريق الترشيح وتخزينها في محلول استقرار RNA. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للDNA والبروتين لتكون معزولة من نفس العينة حتى يتسنى لجميع الخطوات المؤدية إلى البروتين والأمطار DNA متطابقة. من منظور عملي، مطلوب أقل الترشيح منذ مطلوب مرشح واحد فقط لكل من البروتين واستخراج الحمض النووي. ونود أيضا أن نعترف أنه تم إنشاء هذا البروتوكول من خلال الجمع بين والتكيف وتعديل بروتوكولين المنشورة سابقا. يتم تكييفها الخطوات تحلل الخلية من سايتو وآخرون (2011) 28 ويتم تكييف التربسين في جل هضم مكون من ShevcheNKO وآخرون. (2007) 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكواشف
- يعد حل SDS-استخراج: 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، 5٪ الجلسرين، و 10 ملي EDTA و 1٪ SDS. فلتر تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد الكواشف الأسهم اللازمة للهلام بولي أكريلاميد.
- إعداد 1.5 M تريس، HCL الرقم الهيدروجيني 8.8. فلتر تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- 0.5 M تريس، HCL الرقم الهيدروجيني 6.8. فلتر تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 10٪ SDS. فلتر تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد الحلول اللازمة لفي جل التربسين هضم واستخراج الببتيد.
- إعداد 100 ملي بيكربونات الأمونيوم. فلتر تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد 1 أسهم M DTT. علقت في 100 ملي بيكربونات الأمونيوم وتخزينها في -80 ° C.
- إعداد 550 ملي الأسهم iodoacetamide. علقت في100 ملي بيكربونات الأمونيوم وتخزينها في -80 ° C.
- إعداد 100 نانوغرام / ميكرولتر الأسهم التربسين. قسامة 60 ميكرولتر إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 ° C.
- يعد حل استخراج: حمض الفورميك 1٪ و 2٪ الأسيتونتريل.
- إعداد الحل إعادة تعليق: 5٪ الأسيتونتريل وحمض الفورميك بنسبة 0.1٪.
2. تنفيذ خلية تحلل في وحدة تصفية خرطوشة مع خلايا المحفوظة في تحقيق الاستقرار RNA الحل
- طرد الحل استقرار RNA من وحدة تصفية خرطوشة (1.5 مل)، وإلى أنبوب microcentrifuge 2 مل باستخدام حقنة 60 مل تعلق في نهاية بالتركيبة القفل للمرشح.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب microcentrifuge 2 مل لمدة 10 دقيقة في 17000 x ج لتكوير أي حطام الخلوية. ويتم ذلك حتى يتسنى للمرشح في الخطوة 2.3 لا تسد.
- نقل طاف ل10 K وحدة تصفية ultracentrifugal لالتقاط أي البروتينات التي تنشأ من الخلايا التي هي lysed من تجميد / ثاw من العينة. لا تجاهل بيليه. سيتم استخدامها في الخطوة 2.5. أداء الطرد المركزي في وحدة تصفية ultracentrifugal في 3270 x ج لمدة 30 دقيقة أو حتى حجم خفضت إلى حوالي 600 ميكرولتر.
- تذوب غيض من طرف P10 ومنع الجانب غير بالتركيبة قفل وحدة تصفية خرطوشة مع نهاية مفتوحة من طرف. وهذا يضمن أن لا استخراج العازلة والكتلة الحيوية يهرب خلال الخطوات 2،5-2،7.
- تعليق بيليه في 1 مل من محلول SDS-استخراج وماصة عليه في وحدة تصفية خرطوشة الأصلي. أسهل طريقة لماصة في وحدة تصفية خرطوشة هو كومة تلميح P200 على تلميح P1000 واستخدام هذا غيض مزدوج لpipetting ل.
- إضافة 1 مل من محلول الاستخلاص SDS إلى وحدة تصفية خرطوشة وبالتالي فإن الحجم الإجمالي حوالي 2 مل واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في حين تناوب في فرن التهجين. وضع مناديل 3 مختبر تكوم في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 50 مل. Parafilm طرفي وحدة تصفية خرطوشة مغلقةووضع وحدة تصفية خرطوشة في أنبوب 50 مل. إغلاق الغطاء ووضع أنبوب في الفرن التهجين.
- بعد 10 دقيقة مكان تصفية Sterivex على العوام رغوة وثبته في مكانه مع حقنة 5 مل على نهاية بالتركيبة القفل. تطفو واحتضان في 95 ° C المياه حمام لمدة 15 دقيقة.
- السماح للوحدة تصفية خرطوشة بارد وتدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة (كما في الخطوة 2.6).
- طرد SDS المحللة حل استخراج / خلية من فلتر مع حقنة 60 مل في نفس وحدة تصفية ultracentrifugal كما كان من قبل (الخطوة 2.3). إضافة 1 مل من جديد حل استخراج SDS إلى وحدة تصفية خرطوشة وتخلط لمدة 30 ثانية من جهة، ثم طرد في وحدة تصفية ultracentrifugal باستخدام حقنة 60 مل. هذا هو لشطف وحدة تصفية خرطوشة لضمان أن يتم نقل جميع البروتينات.
- أداء الطرد المركزي في وحدة تصفية ultracentrifugal لمدة 45 دقيقة في 3270 x ج أو حتى وحدة التخزين في وحدة تصفية أقل من 600 ميكرولتر.
- تخلصي من التدفق من خلال وأعلى حتى وحدة تصفية ultracentrifugal مع حل SDS-استخراج الطازجة.
- أجهزة الطرد المركزي في وحدة تصفية لمدة 45 دقيقة أخرى في 3270 ز س.
- كرر الخطوات من 2.11 و 2.12 مرتين أكثر من ذلك. ضمان الحجم النهائي في وحدة تصفية ultracentrifugal 600 على الأكثر ميكرولتر في نهاية تدور النهائي.
- في هذه المرحلة، وتقسيم التركيز في البلدين. وسيتم استخدام جزء واحد لهطول الأمطار DNA والآخر للبروتين هطول الأمطار.
ملاحظة: المبلغ تجزئة يعتمد على مقدار من الكتلة الحيوية التي تم تصفيتها والاستخدامات المقصودة من المنتجات. في حالتنا، نحن تقسيم التركيز مع 10٪ نحو هطول DNA و 90٪ بروتين نحو هطول الأمطار.
هطول الأمطار 3. البروتين
- إضافة 4 مجلدات الميثانول: الأسيتون (50:50) إلى مجلد واحد من التركيز ودوامة لمدة 10 ثانية. احتضان بين عشية وضحاها في -20 ° C.
- تدور باستمرار في 17000 x ج لمدة 30 دقيقة. صب طافوالسماح للبيليه (قد تكون غير مرئية) الجاف في speedvac لمدة 1 ساعة (أو حتى الجافة).
ملاحظة: لا أكثر من تجفيف بيليه لأن هذا قد يجعل من الصعب ل resuspend. - تعليق بيليه في 25 ميكرولتر من محلول SDS-الاستخراج. اتركيه لمدة ساعة واحدة resuspend ثم pipetting صعودا وهبوطا.
- تحديد البروتين باستخدام طقم فحص البروتين وتعليمات الشركات المصنعة.
4. DNA الهطول
- إضافة حل SDS-استخراج إلى جزء التركيز لاستخدامها في هطول الأمطار DNA حتى علامة 500 ميكرولتر. هذه الخطوة هي مجرد زيادة حجم من الحل، مما يجعل من الأسهل للعمل مع.
- إضافة 0.583 كميات من البروتين هطول كاشف (مثل البروتين لجنة السياسة النقدية هطول كاشف) ودوامة لمدة 10 ثانية. يجب أن تشاهد شكل راسب أبيض.
ملاحظة: لقد استخدمنا أيضا الفينول: طرق استخراج الحمض النووي الكلوروفورم، وإنما هو أكثر صعوبة بسبب انخفاض أحجام التداول. حصلنا على عوائد أفضل DNA باستخدامMPC البروتين الهطول الكاشف. - الطرد المركزي في 17000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- نقل طاف لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل آخر وإضافة 0.95 حجم الأيزوبروبانول. عكس 30-40 مرات.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في أقصى سرعة.
- صب بعناية وتجاهل طاف.
- شطف مرتين مع 750 ميكرولتر من الايثانول 70٪.
- إزالة الكثير من الإيثانول وقت ممكن من قبل pipetting، ثم السماح الهواء الجاف.
ملاحظة: لا أكثر من تجفيف DNA لأن هذا قد يجعل من الصعب ل resuspend. - resuspend في 25 ميكرولتر من انخفاض TE العازلة، ودرجة الحموضة 8 (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 0.1 ملي EDTA).
- تحديد الحمض النووي باستخدام طقم فحص dsDNA وتعليمات الشركات المصنعة. أداء agarose هلام (1٪) الكهربائي على 3 ميكرولتر من الحمض النووي للتأكد من جودته.
5. SDS-PAGE جل من البروتينات
- تحضير عينة العازلة (950 ميكرولتر عينة Laemmli العازلة و50 ميكرولتر β المركابتويثانول). </ لى>
- إضافة حجم المقابلة لمدة 15 ميكروغرام من البروتين، أو بحد اقصى 20 ميكرولتر إلى حجم مساو من العازلة العينة وتغلى لمدة 4 دقائق. ويمكن الآن أن يتم تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى يمكن إجراء SDS-PAGE.
- إعداد 10٪ الأكريلاميد حل هلام مع 5٪ هلام الأكريلاميد التراص.
- تحميل الجل مع العينات و4 ميكرولتر من سلم البروتين. تشغيل هلام في ثابت 120 V حتى 250 كيلو دالتون سلم علامة وصلت للتو جل حل.
- وصمة عار الجل باستخدام coomassie وصمة عار على أساس وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
6. في جل التربسين الهضم والببتيد استخراج
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات من هنا حتى 6.10 في خزانة السلامة البيولوجية للحد من التلوث.
- قطع هلام الزائد تحت 10 كيلو دالتون علامة سلم عن كل حارة. وسيتم تحليل كل حارة على MS / MS بشكل منفصل. قطع كل حارة إلى 1 مم × 1 مم المربعات لزيادة مساحة السطح وإخضاع جميع squaالدقة من الممر في أنبوب الصغرى الطرد المركزي انخفاض ملزم. كرر هذا للجميع الممرات. (حامض الخليك 1٪ يمكن استخدامها لمنع جل من الجفاف وأصبح من الصعب على خفض).
ملاحظة: التقليل من التلوث أمر بالغ الأهمية في هذه المرحلة، لذلك يتم تنفيذ هلام تشريح في خزانة السلامة البيولوجية على الزجاج SDS-PAGE العفن هلام تستخدم لجعل هلام. - دي وصمة عار
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر من 100 ملي بيكربونات الأمونيوم في كل أنبوب المنخفض ملزمة، وكأب وثيقة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر من أسيتونتريل، وكأب وثيقة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- نضح وتجاهل 150 ميكرولتر.
- كرر الخطوات من 6.2.1 و6.2.2.
- نضح وتجاهل 95 ميكرولتر.
- جفاف
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر الأسيتونتريل، وكأب وثيقة والانتظار 5 دقائق. نضح وتجاهل 45 ميكرولتر وانتظر 10 دقيقة.
- تخفيض
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر DTT (10 ملي، مخففة في 100 ملي AMMبيكربونات أونيوم)، وكأب وثيقة وانتظر 30 دقيقة عند 37 ° C.
- الألكلة
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر iodoacetamide (55 ملي، مخففة في 100 ملي بيكربونات الأمونيوم)، وكأب وثيق وانتظر 20 دقيقة عند 37 ° C.
- الاستغناء عن 100 ميكرولتر من أسيتونتريل، وكأب وثيقة واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 ° C. نضح وتجاهل 195 ميكرولتر.
- غسل
- الاستغناء عن بيكربونات الأمونيوم 50 ميكرولتر، وكأب وثيقة واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر من أسيتونتريل، وكأب وثيقة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وتجاهل 120 ميكرولتر.
- جفاف
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر الأسيتونتريل، وكأب وثيقة والانتظار 5 دقائق. نضح وتجاهل 45 ميكرولتر.
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر من أسيتونتريل، انتظر 5 دقائق.
- نضح وتجاهل 75 ميكرولتر والانتظار 5 دقائق.
- الهضم
- الاستغناء 25-30 ميكرولتر من 6 نانوغرام / ميكرولتر التربسين (شntil وتغطي جميع أجزاء هلام). انهيار سقف والانتظار مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان بين عشية وضحاها (4،5 ساعة كحد أدنى) عند 37 درجة مئوية.
- ترك الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- استخراج ونقل الببتيد
- الاستغناء عن 30 ميكرولتر من محلول الاستخلاص، وتغطي مع غطاء لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- نضح 30 ميكرولتر والاستغناء عن حجم يستنشق في المسمى أنبوب منخفض ملزم جديد.
- الاستغناء عن 12 ميكرولتر من محلول الاستخلاص و 12 ميكرولتر من الأسيتونتريل في أنبوب الأصلي (مع جل). انهيار سقف واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- نضح 15 ميكرولتر وديعة في أنبوب جديد.
- كرر الخطوات (6.9.3 و 6.9.4).
- وضع أنابيب جديدة في SpeedVac حتى تجف.
- resuspend في 50 ميكرولتر من حل إعادة تعليق. دوامة في المتوسط لمدة 10 دقيقة ل resuspend.
- ماصة حل الببتيد إلى أي نانو / قارورة LC أو لوحات 96-جيدا مناسبة للنانو / LCMS / MS العمل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما مظاهرة، أجرينا البروتوكول على عينتين مياه البحر التي تم جمعها من سطح والكلوروفيل أقصى المحيط الساحلي في شمال كندا. بينما في عرض البحر، صدر 6-7 L من مياه البحر من خلال 3 ميكرون GF / D prefilter، ثم تم جمع الخلايا الميكروبية على 0.22 ميكرون وحدة تصفية خرطوشة بعد بروتوكول والش وآخرون. 20. تم تخزين الخلايا مباشرة في محلول استقرار RNA حتى مزيد من المعالجة. لدى عودته إلى المختبر، أجرينا البروتوكول كما هو عرضه هنا. تم تقسيم المحللة الخلية المركزة. وقد عجلت البروتين من 90٪ من حجم، في حين كان عجلت DNA من 10٪ الباقية من وحدة التخزين. انتشلنا 24-26 ميكروغرام من البروتين و250-308 نانوغرام من الحمض النووي جودة عالية من هذه العينات (الشكل 1). بعد في جل الهضم التربسين واستخراج الببتيد، أخضعنا الببتيدات لتحليل MS / MS باستخدام-LC نانو بالإضافة إلى Orbitrap ايليمطياف الكتلة الشركة المصرية للاتصالات (الحرارية فيشر العلمية، التايم، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). من الببتيدات، ولدت لنا أكثر من 23000 MS / MS الأطياف لكل عينة. ثم تم تحديد الببتيدات والبروتينات من خلال البحث هذه الأطياف مقابل قاعدة بيانات تسلسل مخصصة في المنزل باستخدام أداة المعلوماتية الحيوية PEAKS (BSI، واترلو، ON، كندا). وتتألف قاعدة البيانات من البروتينات وتوقع من الجينوم إشارة البحرية وmetagenomes. أسفر البحث في تحديد حوالي 1000 الببتيدات والبروتينات 700-800 لكل عينة. وبطبيعة الحال، فإن هذه النتائج تعتمد على وفرة الجرثومية الخلية، MS الأجهزة، وقاعدة بيانات البحث البروتين والخوارزميات. ومع ذلك، تظهر هذه النتائج أن هذا البروتوكول لديه القدرة على إنتاج الببتيدات زيتية كافية ومناسبة لتحديد مئات من البروتينات في البيئة. وعلاوة على ذلك، منذ المكتبات metagenomic يمكن بناؤها من اقل من 100 نانوغرام من الحمض النووي 30، لديه هذا البروتوكول أيضا القدرة على توفير كميات كافية من الحمض النوويلتوليد يقابل مجموعات البيانات metagenomic-metaproteomic.
تم تحليل التكوين التصنيفي والوظيفي للmetaproteomes باستخدام مزيج من BLASTp وميغان (Metagenome محلل) حزمة برامج 31،32 (الشكل 2). وكانت البروتينات المخصصة ألفا متقلبات الأكثر ممثلة في ورقة العمل إلى حد كبير، فإن الغالبية العظمى منها تم تعيينها إلى كليد SAR11. وكليد Rhododobacterales الفا متقلبات وأيضا الممثلة للغاية وحددت في معظم الأحيان في المياه السطحية. البروتينات المخصصة لBacteroidetes وزعت بالتساوي بين السطح والكلوروفيل الأقصى، ولكن تم تحديد البروتينات Flavobacteria إلى درجة أكبر في أقصى الكلوروفيل. وتم توزيع البروتينات غاما proteobacterial بالتساوي في جميع أنحاء عمود الماء في حين تم العثور على بروتينات بيتا proteobacterial الغالب في السطح . منمنظور وظيفي، تم التعرف على مجموعة واسعة من المسارات الأيضية. وكانت الهيكلة الرأسية هذه المسارات الأيضية واضحة. على سبيل المثال، تم تحديد البروتينات المرتبطة مع استقلاب الأحماض الأمينية، والتمثيل الغذائي للكربوهيدرات ومسارات تثبيت الكربون بدائيات النواة في المقام الأول على السطح، وعثر الأيض النيتروجين حصرا على السطح. وقد لوحظت الضوئي البروتينات تثبيت الكربون في المقام الأول على أقصى الكلوروفيل في حين تم تحديد البروتينات المشاركة في عملية التمثيل الضوئي بالتساوي بين السطح والكلوروفيل الأقصى. وتبين هذه النتائج أن مجموعة واسعة من البروتينات من شتى الأنواع الميكروبية يمكن الكشف باستخدام بروتوكول المقدمة هنا.
الشكل 1: الحمض النووي الجيني من 2 أعماق في محطة في القطب الشمالي S633 يحتوي المسار الأول 4 ميكرولتر من 1 كيلوبايت DNA لالأفعى، 2 لين يحتوي على 3 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي الجيني من S633_2 م، حارة 3 يحتوي على 3 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي الجيني من S633_20 م والممرات 4-6 تحتوي على 0.5 ميكرولتر (85 نانوغرام)، 2 ميكرولتر (333 نانوغرام) و 4 ميكرولتر ( 667 نانوغرام) من HindIII هضم الحمض النووي امدا.
خلقت التحليل التصنيفي وظيفية من 2 أعماق في محطة في القطب الشمالي S633 مقارنة التنوع التصنيفي للمحطة 633 المياه السطحية والكلوروفيل أقصى القطب الشمالي (A) باستخدام MEGAN: الرقم 2. مقارنة التنوع الوظيفية للمحطة 633 المياه السطحية والكلوروفيل أقصى القطب الشمالي (B) التي تم إنشاؤها باستخدام MEGAN للاستعلام على قاعدة بيانات KEGG. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحفاظ على عينة هو المفتاح لدراسات metaproteomic وأظهرت الأعمال السابقة أن الحل استقرار RNA هو عازلة تخزين مفيد لتخزين الخلايا قبل البروتين استخراج 28. من الناحية المثالية، سوف يتم الحفاظ على عينات في الموقع لنفي التحولات في تعبير البروتين أثناء التعامل مع 33،34. في الواقع، في الموقع تم تطوير تقنيات أخذ العينات والتثبيت، والتي تسمح لجمع مستقلة والحفاظ على العينات عن طريق أدوات نشر السفينة. ومع ذلك، الحصول على هذه التكنولوجيات ليس ممكنا دائما. في حالة الشائعة التي لم يكن، وينبغي الحفاظ على العينات في أقرب وقت ممكن بعد جمع.
هنا نقدم بروتوكول لاستخراج البروتين من حل تخزين الخلايا استقرار RNA التي تم جمعها على وحدة تصفية خرطوشة، والذي يستخدم عادة في علم الأحياء المجهرية المائية. ويتضمن البروتوكول تحلل الخلية باستخدام محلول SDS-تحلل والتدفئة، تليها العلاقات العامةخطوة تركيز otein باستخدام وحدات تصفية ultracentrifugal أن تضاعف كخطوة تحلية اللازمة. وتجدر الإشارة إلى أن الخطوات التركيز وتحلية لا يمكن تجاهلها. وجدنا أن هناك حاجة لا تقل عن ثلاث خطوات الصرف عازلة لتحلية التركيز لدينا. نظرا لتركيز الملح العالية من الحل استقرار RNA، إذا لم تحدث تحلية المناسبة، سيتم عجل الكثير من الملح خلال ليلة وضحاها البروتين هطول خطوة وستكون الخطوة تحلية وهطول الأمطار يجب أن تتكرر. بالإضافة إلى ذلك، إذا لم يتم تنفيذ تحلية بشكل صحيح سوف 1D-PAGE لا تعمل وسيتم فقدان العينات.
بعد ذلك، تم تقسيم المحللة مركزة بحيث يمكن أن يؤديها كل من هطول الأمطار البروتين والحمض النووي. وهذا مفيد لأنه غالبا ما يكون من المرغوب فيه أن يتم إنشاء البيانات metagenomic وmetaproteomic من نفس العينات. إذا لم يتم تمثيل البروتين في قاعدة البيانات تسلسل البروتين ثم سوف الببتيدلا يمكن تحديدها. بما في ذلك بيانات الجينوم من نفس العينة كما يقلل من البيانات البروتين من خطر عدم التمكن من تحديد بروتين بسبب غيابها عن قاعدة البيانات.
على الرغم من هذا البروتوكول والأمثل للاستخدام مع وحدات تصفية خرطوشة والتحقق من صحتها للعمل على المجتمعات الميكروبية المحيط الساحلي، فإنه يمكن تكييفها للاستخدام مع أنواع أخرى من العينات البيئية والمرشحات. ومع ذلك، فإنه يجب أن يكون واضحا أن نجاح هذا البروتوكول يعتمد على كمية كافية من بدء الكتلة الحيوية. لذلك في النظم الإيكولوجية المائية حيث قد تكون الكتلة الحيوية منخفضة جدا، ونحن نوصي زيادة حجم المياه التي تمت تصفيتها وفقا لذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
- Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
- Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).
- Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
- Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
- Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
- Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
- Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
- Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
- Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
- Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al.
- Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
- Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
- Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
- Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
- Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
- Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
- Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
- Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
- Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
- Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
- Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
- Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).
- Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
- Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
- Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).
- Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C.
- Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
- Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
- Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).
