Introduction
Os microrganismos são onipresentes e desempenham um papel essencial nos ciclos biogeoquímicos da Terra 1. Atualmente, existem inúmeras abordagens moleculares disponíveis para a caracterização de estrutura da comunidade microbiana e função. O mais comum é a análise do gene 16S rRNA sequ�cias amplificado por PCR a partir de ADN ambiental 2 - 4. Uma desvantagem da análise do gene 16S rRNA é que ela só fornece informações sobre a identidade filogenética e estrutura da comunidade, com pouca informação sobre a função metabólica. Em contraste, abordagens como Metagenômica, metatranscriptomics e metaproteômica fornecer informações sobre a estrutura da comunidade e do metabolismo. Metagenomics, ou a análise do teor de gene de um conjunto de organismos, fornece informação sobre a estrutura e o potencial funcional da comunidade 5 - 8. Embora poderoso, este potencial funcional pode não corresponder ao metabólicaactividades dos organismos. Genótipo de um organismo é representado por seus genes, cada um dos quais pode ser transcrito em RNA e ainda traduzido para proteína, resultando num fenótipo. Assim, para auxiliar na compreensão da actividade funcional microbiano num ambiente, a análise pós-genómico deve ser executada 9. Metatranscriptomics, ou a análise de transcritos de ARN é útil porque revela que os genes são transcritos em qualquer dado ambiente. No entanto, os níveis de mRNA nem sempre coincidir com os seus níveis de proteína correspondentes devido à regulação de translação, meia-vida de ARN, e o facto de várias cópias de proteínas pode ser gerado para cada ARNm de 10.
Por estas razões metaproteômica é agora reconhecida como uma importante ferramenta para microbiologia ambiental. Metaproteomic comum analisa usar uma abordagem proteômica shotgun onde o complemento total perto de proteínas em uma amostra complexa são purificados e analisados simultaneamente, geralmente através de endigestão zymatic em peptídeos e análise em um espectrômetro de massa. Espectrometria de massa tandem subsequente (MS / MS) "impressão digital peptídica" é utilizado para determinar a sequência do péptido e proteína potencial de origem pelo banco de dados de proteínas procura (para uma revisão ver 11). Trabalho Proteômica já percorreu um longo caminho nos últimos 25 anos, graças ao aumento da disponibilidade de dados genômicos e do aumento da sensibilidade e precisão dos espectrômetros de massa permitindo high-throughput identificação e quantificação de proteínas 11,12. Uma vez que as proteínas são o produto final da expressão do gene, dados metaproteomic pode ajudar a determinar quais os organismos são activos em qualquer dado ambiente e proteínas que estão a expressar. Isto é vantajoso quando se tenta determinar como um determinado conjunto de variáveis ambientais afetam o fenótipo de um organismo ou comunidade. Logo no início, metaproteomic estudos baseados em MS MS / no oceano foram utilizados para identificar proteínas específicas em alvolinhagens microbianas, com o primeiro estudo focando a luz conduzida da bomba de protões proteorhodopsin em bactérias marinhas SAR11 13. Mais recentemente, análises comparativas metaproteomic elucidaram padrões de expressão de proteínas diferenciais entre as comunidades complexas. Os exemplos incluem a identificação de mudanças temporais no metabolismo do litoral do Noroeste do Atlântico Oceano 14 ou a Península Antártica 5. Outros estudos descrevem variações nos padrões de expressão de proteínas através de escalas espaciais, por exemplo, ao longo de um transecto geográfica de um giro oceânico baixo em nutrientes para um sistema afloramento costeiro altamente produtiva 15. Para mais comentários de metaproteômica recomendamos Schneider et al. (2010) 9 e Williams et al. (2014) 16. Proteómica alvejados também tem sido empregada nos últimos anos para quantificar a expressão de vias metabólicas específicas no ambiente 17,18.
There são três fases principais na análise metaproteomic. A primeira fase é a preparação da amostra, a qual inclui a recolha da amostra, a lise celular e a concentração de proteína. A recolha de amostras em microbiologia marinho frequentemente implica a filtração da água do mar através de um pré-filtro para remover as células eucarióticas maiores, partículas e bactérias associado a partículas, seguido de filtração para a captura de células microbianas de vida livre, normalmente com o uso de um cartucho de 0,22? M 19,20 unidade de filtro. Estes filtros são encaixada num cilindro de plástico e uma lise celular e protocolo de extracção de proteína que pode ser realizada dentro da unidade de filtro seria uma ferramenta valiosa. Uma vez que a biomassa é obtido, as células devem ser lisadas para permitir a extracção de proteína. Vários métodos podem ser empregues, incluindo a guanidina-HCl e sulfato de lise 21 de sódio dodecilo (SDS), métodos baseados em lise. Apesar de detergentes como SDS são muito eficientes em interromper as membranas e solubilizar muitos tipos de proteína, concentrations tão baixo quanto 0,1% pode interferir com a digestão de proteínas a jusante e análise MS 22. De grande preocupação é os efeitos negativos de SDS sobre a eficiência da digestão de tripsina, poder de resolução de cromatografia líquida de fase reversa e de supressão de iões ou acumulação no interior da fonte de iões 23.
A segunda fase é de fraccionamento e de análise, onde as proteínas são sujeitas a digestão enzimática seguida por análise por LC MS / MS, o que resulta no padrão de fragmentação am / Z que pode ser usada para determinar a sequência de aminoácidos primária do péptido tríptico inicial. Vários métodos de digestão pode ser realizada de acordo com os tipos de detergentes utilizados, bem como o fluxo de trabalho de espectrometria de massa a jusante. No nosso protocolo, electroforese PAGE 1-D seguido pela remoção do SDS a partir do gel é utilizada de modo a remover qualquer contaminação detergente. A análise de proteínas que são difíceis de solubilizar, tais como proteínas de membrana, requer o uso de alta concentrações de SDS ou outros detergentes. Isto leva a problemas de compatibilidade com eletroforese SDS-gel. Se o objectivo de um estudo requer a solubilização destes difícil de solubilizar proteínas, o sistema de tubos-gel pode ser usada 22,24. O método do tubo-gel incorpora as proteínas no interior da matriz de gel, sem a utilização de electroforese. Posteriormente quaisquer detergentes utilizados para a solubilização são removidos antes da digestão de proteínas.
A terceira fase é a análise bioinformática. Nesta fase, os dados de péptidos MS / MS são pesquisados contra uma base de dados de sequências de nucleótidos traduzidas para determinar quais os péptidos e as proteínas estão presentes na amostra. A identificação de péptidos está dependente da base de dados é pesquisado contra. Dados metaproteomic marinhos são comumente procurou contra bancos de dados composta de genomas de referência, dados metagenomic tais como o conjunto de dados de amostragem Oceano Global 25, bem como de células amplificado genomas individuais de li incultaneages 26,27. Identificação de proteínas também pode ser aumentada pela inclusão de sequências metagenomic partir da mesma amostra de dados como o metaproteomic foi derivado 5.
Aqui nós fornecemos um protocolo para a geração de péptidos adequados para a análise baseada em MS MS / a partir de biomassa microbiana recolhido por filtração e armazenados numa solução de estabilização de ARN. O protocolo aqui descrito permite a ADN e proteína a ser isolada a partir da mesma amostra, de modo que todos os passos que conduzem à proteína e as precipitações de DNA são idênticas. De uma perspectiva prática, a filtração é menos necessária uma vez que apenas um filtro é necessário tanto para a extracção do ADN e proteína. Gostaríamos também de reconhecer que este protocolo foi criado através da combinação, adaptação e alteração de dois protocolos previamente publicados. Os passos de lise celular são adaptadas de Saito et ai. (2011) 28 e a tripsina em gel digerir componente é adaptado de ShevcheNKO et ai. (2007) 29.
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Protocol
1. Prepare Reagentes
- Preparar a solução de extracção SDS-: M de Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, glicerol a 5%, EDTA 10 mM e SDS a 1%. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
- Prepare os reagentes necessários para o banco de gel de poliacrilamida.
- Prepare a 1,5 M de Tris-HCl pH 8,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente.
- 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente.
- Prepare 10% SDS. Filtrar esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente.
- Prepare soluções necessárias para em gel e extracção de tripsina digerir péptido.
- Preparação de 100 mM de bicarbonato de amónio. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C.
- Prepare 1 stocks M TDT. Suspenso em 100 mM de bicarbonato de amónio e armazenar a -80 ° C.
- Prepare 550 mM stocks iodoacetamida. Suspenso em100 mM de bicarbonato de amónio e armazenar a -80 ° C.
- Prepare 100 ng / mL de tripsina stocks. Alíquota de 60 mL em 1,5 mL tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C.
- Preparar a solução de extracção: ácido fórmico a 1%, 2% de acetonitrilo.
- Preparar a solução de re-suspensão: 5% de acetonitrilo e ácido fórmico a 0,1%.
2. Execute Lise Celular na Unidade de Filtro Cartucho com células preservadas em RNA Solução de Estabilização
- Expelir a solução de estabilização de ARN a partir da unidade de filtro de cartucho (1,5 ml) e num tubo de microcentrifugação de 2 ml usando uma seringa de 60 ml ligado na extremidade luer-lock do filtro.
- Centrifuga-se o tubo de microcentrifugação de 2 ml durante 10 minutos a 17,000 xg para sedimentar quaisquer restos celulares. Isto é feito de modo a que o filtro no passo 2.3 não entupir.
- Transferir o sobrenadante para uma unidade de filtro de ultra-centrifuga�o 10 K para capturar quaisquer proteínas provenientes de células que foram lisadas do congelamento / thaW da amostra. Não jogue fora o sedimento. Será utilizado no passo 2.5. Realizar centrifugação da unidade de filtro de ultra-centrifuga�o a 3.270 xg durante 30 minutos ou até que o volume foi reduzido para cerca de 600 ul.
- Derreter a ponta de uma ponta de p10 e bloquear o lado não luer-lock da unidade de filtro de cartucho, com a extremidade aberta da ponta. Isto irá assegurar que nenhum tampão de extracção e biomassa escapa durante os passos de 2,5-2,7.
- Suspende-se o sedimento em 1 ml de solução de extracção SDS e pipeta-la para a unidade de filtro de cartucho original. A maneira mais fácil de pipeta na unidade de filtro de cartucho é empilhar uma dica p200 em uma ponta P1000 e usar essa dupla ponta de pipetagem.
- Adicionar 1 ml de solução de extracção SDS para a unidade de filtro de cartucho, de modo que o volume total é de cerca de 2 ml e incubar durante 10 min à temperatura ambiente, durante a rotação num forno de hibridação. Coloque toalhetes 3 laboratório amassado na parte inferior de um tubo de 50 ml. Parafilme ambas as extremidades da unidade de filtro de cartuchoe colocar a unidade do filtro cartucho para dentro do tubo de 50 ml. Fechar a tampa e colocar o tubo num forno de hibridação.
- Após 10 min lugar a Sterivex filtrar em um floater espuma e prenda-o no lugar com uma seringa de 5 ml na extremidade luer-lock. Flutuar e incubar em um 95 ° C em banho-maria por 15 min.
- Deixe que a unidade de filtro de cartucho fresco e girar à temperatura ambiente durante 1 hora (tal como no passo 2.6).
- Expelir o lisado solução de extracção / SDS de células fora do filtro com uma seringa de 60 mL para a mesma unidade de filtro de ultra-centrifuga�o como anteriormente (passo 2.3). Adicionar 1 ml de solução de extracção SDS fresco para a unidade de filtro de cartucho e mistura-se durante 30 segundos com a mão, em seguida, para expulsar a unidade de filtro de ultra-centrifuga�o usando a seringa de 60 ml. Isto é para enxaguar a unidade de filtro de cartucho, para garantir que todas as proteínas foram removidas.
- Realizar centrifugação na unidade de filtro de ultra-centrifuga�o durante 45 min a 3270 xg ou até que o volume da unidade de filtro é menor do que 600 ul.
- Rejeitar flow-through eo topo até a unidade de filtro ultra-centrifuga�o com solução de SDS-extração fresco.
- Centrifugar a unidade de filtro para a outra 45 min a 3.270 x g.
- Repita os passos 2.11 e 2.12 duas vezes mais. Assegurar o volume final na unidade de filtro de ultra-centrifuga�o é no máximo 600 jil no final da centrifugação final.
- Neste ponto, o concentrado dividido em dois. Uma fracção será usado para a precipitação de ADN e o outro para precipitação da proteína.
Nota: A quantidade de fraccionamento depende da quantidade de biomassa que foi filtrado e as utilizações pretendidas dos produtos. No nosso caso, nós dividir o concentrado com 10% em relação a precipitação do DNA e de 90% em relação a precipitação da proteína.
3. Protein Precipitation
- Adicionar 4 volumes de metanol: acetona (50:50) a um volume de concentrado e de vórtice durante 10 seg. Incubar durante a noite a -20 ° C.
- Girar a 17.000 xg durante 30 min. Decantar o sobrenadantee deixar o sedimento (pode ser invisível) seco num Speedvac durante 1 h (ou até secar).
Nota: Não mais de secar o sedimento, pois isso pode tornar difícil para voltar a suspender. - Suspende-se o sedimento em 25 ml de solução de SDS-extracção. Deixe descansar por uma hora, em seguida ressuspender pipetando cima e para baixo.
- Quantificar proteína usando um kit de ensaio de proteína e as instruções do fabricante.
4. DNA Precipitation
- Adicionar a solução de SDS-extracção para a fracção de concentrado a ser usado para a precipitação de ADN até a marca de 500 ul. Este passo é simplesmente a aumentar o volume da solução, tornando-o mais fácil de trabalhar.
- Adicionar 0,583 volumes de um reagente de precipitação de proteína (tal como o reagente de precipitação de proteína MPC) e agitar com vortex durante 10 seg. Você deverá ver uma forma precipitado branco.
Nota: Temos também utilizado fenol: métodos de extração de DNA de clorofórmio, mas é mais difícil devido aos baixos volumes. Obtivemos melhores rendimentos de ADN usando oMPC Proteína Reagente de precipitação. - Centrifugar a 17.000 xg e 4 ° C durante 10 min.
- Transferir o sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 0,95 volumes de isopropanol. Inverta 30-40 vezes.
- Centrifugar durante 10 minutos a 4 ° C, à velocidade máxima.
- Decantar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante.
- Lavar duas vezes com 750 ul de etanol a 70%.
- Remover o máximo possível de etanol por pipetagem, em seguida, deixe secar ao ar.
Nota: Não secar sobre o DNA, pois isso pode tornar difícil para voltar a suspender. - Ressuspender em 25 ul de tampão TE baixo, pH 8 (Tris 10 mM-HCl, EDTA 0,1 mM).
- Quantificar o ADN utilizando um kit de ensaio de ADNcd e as instruções do fabricante. Realizar gel de agarose (1%) eletroforese em 3 ul de DNA para verificar a sua qualidade.
5. Gel de SDS-PAGE de proteínas
- Preparar tampão de amostra (tampão de amostra Laemmli 950 ul e 50 ul β-mercaptoetanol). </ li>
- Adicionar o volume correspondente de 15 ug de proteína, ou um máximo de 20 ul de um volume igual de tampão de amostra e ferver durante 4 minutos. As amostras podem agora ser armazenados a -80 ° C até de SDS-PAGE podem ser executadas.
- Preparar 10% de acrilamida com um gel de resolução de gel de acrilamida a 5% de empilhamento.
- Carregar o gel com amostras e 4 ul de uma escada de proteína. Submeter o gel a constante de 120 V até o marcador de 250 kDa escada acaba de atingir o gel de resolução.
- Corar o gel utilizando uma mancha de Coomassie base de acordo com as instruções do fabricante.
6. Em gel de Tripsina-Digest e Peptídeo de Extracção
Nota: Todos os passos daqui até 6,10 são realizadas em uma cabine de segurança biológica para minimizar a contaminação.
- Corte o excesso de gel sob a marca de 10 kDa escada para cada pista. Cada uma das pistas serão analisados em MS / MS separadamente. Corte cada pista em 1 mm x 1 mm quadrados para aumentar a área de superfície e coloque tudo squares de pista para um tubo de ligação a partir de micro-centrífuga. Repita esse procedimento para todas as pistas. (Ácido acético a 1% pode ser usado para impedir o gel de secar e tornando-se difícil de cortar).
Nota: minimizar a contaminação é crítica nesta fase, de modo que corta gel é efectuada numa câmara de segurança biológica sobre o molde em gel de SDS-PAGE de vidro utilizado para fazer o gel. - De-mancha
- Dispensar 50 ul de 100 mM de bicarbonato de amónio em cada tubo de ligação baixa, perto tampa e incubar a 37 ° C durante 10 min.
- Dispensar 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e incubar a 37 ° C durante 5 min.
- Aspirar e descartar 150 ul.
- Repita os passos 6.2.1 e 6.2.2.
- Aspirar e descartar 95 ul.
- Desidratação
- Dispense 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e esperar 5 min. Aspirar e descartar 45 ul e esperar 10 min.
- Redução
- Dispensar 50 ul de DTT (10 mM, diluída em 100 mM de MVAbicarbonato de ónio), perto tampa e esperar 30 min a 37 ° C.
- Alkylation
- Dispensar 50 uL de iodoacetamida (55 mM, diluída em bicarbonato de amónio 100 mM), tampão de perto e esperar 20 minutos a 37 ° C.
- Dispensar 100 ul de acetonitrilo, perto tampa e incubar durante 5 min a 37 ° C. Aspirar e descartar 195 ul.
- lavagem
- Dispensar bicarbonato de amónio 50 ul, perto tampa e incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Dispensar 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e incubar a 37 ° C durante 5 min. Aspirar e descartar 120 ul.
- Desidratação
- Dispense 50 ul de acetonitrilo, perto tampa e esperar 5 min. Aspirar e descartar 45 ul.
- Dispense 50 ul de acetonitrilo, aguarde 5 min.
- Aspirar e descartar 75 ul e esperar 5 min.
- Digestão
- Dispensar 25-30 ul de 6 ng / uL de tripsina (uté todos os fragmentos de gel são cobertos). Fechar a tampa e esperar 30 minutos à temperatura ambiente.
- Incubar durante a noite (mínimo de 4,5 horas) a 37 ° C.
- Deixe descansar em temperatura ambiente por 30 min.
- Extracção e Péptido Transferência
- Dispensar 30 ul de solução de extracção e cobrir com tampa durante 30 min em gelo.
- Aspirar 30 ul de volume aspirado e dispensar em um novo tubo de ligação de baixo marcado.
- Dispensar 12 ul de solução de extracção, e 12 ul de acetonitrilo para dentro do tubo original (com gel). Fechar a tampa e incubar durante 30 min em gelo.
- Aspirar 15 ul e depósito para o novo tubo.
- Repita os passos (6.9.3 e 6.9.4).
- Coloque novos tubos em um SpeedVac até secar.
- Ressuspender em 50 ul de solução de ressuspensão. Vortex no médio por 10 minutos para voltar a suspender.
- Pipetar para solução de péptido quer nano LC / frascos ou placas de 96 poços adequados para nano / CLTrabalho MS / MS.
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Representative Results
Como demonstração, foi realizado o protocolo em duas amostras de água do mar coletadas da superfície e camada de clorofila máxima do oceano costeiro no Norte do Canadá. Enquanto no mar, 6-7 L de água do mar foi passado através de um 3 um GF / D pré-filtro, em seguida, as células microbianas foram recolhidos para uma unidade de cartucho de filtro de 0,22 um, seguindo o protocolo de Walsh et ai. 20. As células foram imediatamente armazenadas numa solução de estabilização de ARN, até processamento posterior. Ao voltar para o laboratório, foi realizado o protocolo, uma vez que é aqui apresentado. O lisado celular concentrada foi dividida; A proteína foi precipitada a partir de 90% do volume, enquanto o DNA foi precipitado a partir da restante 10% do volume. Recuperamos 24-26 ug de proteína e 250-308 ng de DNA de alta qualidade a partir destas amostras (Figura 1). Após a digestão em gel com tripsina e a extracção de péptidos, que os péptidos submetidos a análise por MS / MS usando um LC-nano acoplado ao Orbitrap Eliespectrômetro de massa te (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). A partir dos peptídeos, geramos mais de 23.000 espectros MS / MS por amostra. Os péptidos e as proteínas foram então identificados através da procura destes espectros contra uma base de dados de sequência de costume em casa utilizando a ferramenta da bioinformática picos (BSI, Waterloo, ON, Canadá). O banco de dados foi composto de proteínas preditas de genomas de referência marinhos e metagenomes. A pesquisa conduziu à identificação de cerca de 1.000 péptidos e proteínas 700-800 para cada amostra. Naturalmente, estes resultados são dependentes de abundância microbiana célula, MS instrumentação e banco de dados de pesquisa de proteínas e algoritmos. No entanto, estes resultados demonstram que este protocolo tem o potencial para produzir péptidos trípticos adequadas adequados para identificar centenas de proteínas no meio ambiente. Além disso, uma vez que metagenomic bibliotecas podem ser construídas a partir de tão pouco como 100 ng de ADN 30, este protocolo também tem potencial para proporcionar quantidades adequadas de ADNpara gerar conjuntos de dados metagenomic-metaproteomic combinados.
Composição taxonômica e funcional dos metaproteomes foi analisada utilizando uma combinação de BLASTp e o MEGAN (metagenoma analisador) 31,32 pacote de software (Figura 2). Proteínas atribuídos a alfa-Proteobacteria foram as mais altamente representadas no conjunto de dados, a grande maioria dos quais foram designados para o clado SAR11. O clado Rhododobacterales de Alpha-proteobactérias também foi altamente representados e identificados com mais freqüência em águas superficiais. Proteínas atribuídos a Bacteroides foram distribuídos uniformemente entre o máximo de superfície e de clorofila, mas as proteínas Flavobacteria foram identificados a um maior grau no máximo clorofila. Proteínas gama-proteobacterial foram distribuídos uniformemente ao longo da coluna de água enquanto que as proteínas proteobacterial-beta foram encontradas predominantemente na superfície . A partir daum ponto de vista funcional, foram identificadas uma vasta variedade de vias metabólicas. Estruturação vertical destas vias metabólicas era aparente. Por exemplo, as proteínas associadas com o metabolismo de aminoácidos, hidratos de carbono e metabolismo vias de fixação de carbono procariótica foram identificados primariamente na superfície, e o metabolismo de azoto, foi encontrada exclusivamente à superfície. Proteínas de fixação de carbono fotossintéticas foram observadas principalmente no máximo clorofila enquanto proteínas envolvidas na fotossíntese foram identificados uniformemente entre a superfície eo máximo de clorofila. Estes resultados demonstram que uma ampla variedade de proteínas a partir de uma diversidade de taxa microbiana pode ser detectada usando o protocolo aqui apresentado.
Figura 1:. O ADN genómico a partir de 2 profundidades em Árctico estação S633 A primeira pista contém 4 ul de uma 1 kb de ADN Lsomador, a pista 2 contém 3 ul de extracção de ADN genómico a partir de S633_2 m, pista 3 contém 3 ul de extracção de ADN genómico a partir de S633_20 m e pistas 4-6 contêm 0,5 uL (85 ng), 2 ul (333 ng) e 4 ul ( 667 ng) de DNA de lambda digerido com HindIII.
Figura 2:. Análise taxonômica e funcional de 2 profundidades na estação Arctic S633 comparação diversidade taxonômica dos Arctic estação de 633 águas de superfície máxima e clorofila (A) criada usando MEGAN. Comparação diversidade funcional dos Arctic estação de 633 águas de superfície máxima e clorofila (B) criados usando MEGAN para consulta contra o banco de dados KEGG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Preservação das amostras é essencial para estudos metaproteomic e trabalho anterior demonstrou que uma solução de estabilização de ARN é um tampão de armazenamento útil para armazenar as células antes da extracção da proteína 28. Idealmente, as amostras iria ser preservado in situ para negar mudanças na expressão de proteínas durante o manuseamento 33,34. Na verdade, in situ têm sido desenvolvidas tecnologias de amostragem e de fixação, que permitem a recolha autónoma e preservação de amostras por instrumentos implantados-navio. No entanto, o acesso a estas tecnologias nem sempre é viável. No caso comum que não é, as amostras devem ser preservados o mais rapidamente possível após a colheita.
Aqui é apresentado um protocolo para a extracção da proteína a partir da solução armazenada células estabilização de RNA recolhidos numa unidade de filtro de cartucho, que é comumente utilizado em microbiologia aquático. O protocolo inclui a lise das células utilizando uma solução de SDS-lise e aquecimento, seguida por um pretapa de concentração otein usando unidades de filtro ultra-centrifuga�o que dobrou como um passo de dessalinização necessário. Deve-se notar que os passos de concentração e de dessalinização não pode ser negligenciado. Verificou-se que um mínimo de três passos de permuta de tampão foi necessária para dessalinizar a nossa concentrado. Devido à elevada concentração de sal da solução de estabilização de ARN, se adequado dessalinização não ocorrer, o excesso de sal vai ser precipitados durante o passo de precipitação de proteína durante a noite e o passo de dessalinização e a precipitação tem que ser repetido. Além disso, se a dessalinização não é realizada adequadamente a 1D-PAGE não vai funcionar e as amostras serão perdidas.
Em seguida, concentrou-se o lisado foi dividido de modo a que tanto a precipitação da proteína e precipitação do DNA pode ser realizada. Isto é útil, uma vez que é muitas vezes desejável que os dados metagenomic e metaproteomic ser gerada a partir das mesmas amostras. Se uma proteína não está representado no banco de dados de sequência de proteína, em seguida, o péptido seránão ser identificado. Incluindo os dados genómicos a partir da mesma amostra, como a proteómica dados reduz o risco de não ser capaz de identificar uma proteína devido à sua ausência da base de dados.
Embora este protocolo foi optimizado para utilização com unidades de filtro de cartucho e validado para trabalhar em comunidades microbianas oceano costeira, ele pode ser adaptado para utilização com outros tipos de amostras ambientais e filtros. No entanto, deve ficar claro que o sucesso deste protocolo é dependente de uma quantidade adequada de biomassa de partida. Portanto em ecossistemas aquáticos onde a biomassa pode ser muito baixa, recomenda-se o aumento do volume de água filtrada em conformidade.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
References
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