Introduction
Les microorganismes sont omniprésents et jouent des rôles essentiels dans les cycles biogéochimiques de la Terre 1. Actuellement, il existe de nombreuses approches moléculaires disponibles pour caractériser la structure de la communauté microbienne et la fonction. La plus courante est l'analyse du gène ARNr 16S séquences amplifié par PCR de l'ADN de l'environnement 2 - 4. Un inconvénient de l'analyse du gène ARNr 16S est qu'elle ne fournit des informations sur l'identité phylogénétique et structure de la communauté, avec peu d'informations sur la fonction métabolique. En revanche, les approches telles que la métagénomique, metatranscriptomics et métaprotéomique fournissent des informations sur la structure des communautés et le métabolisme. La métagénomique, ou l'analyse de la teneur en gène d'un assemblage d'organismes, fournit des informations sur la structure et le potentiel fonctionnel de la communauté 5-8. Bien que puissant, ce potentiel fonctionnel peut ne pas correspondre à la métaboliqueactivités des organismes. Le génotype d'un organisme est représenté par ses gènes, dont chacun peut être transcrit en ARN et traduit en outre à la protéine, ayant pour résultat un phénotype. Ainsi, pour aider à la compréhension de l'activité fonctionnelle microbienne dans un milieu, l'analyse post-génomique doit être effectué neuf. Metatranscriptomics, ou l'analyse des transcrits d'ARN est utile car elle révèle que gènes sont transcrits dans un environnement donné. Cependant, les taux d'ARNm ne correspondent pas toujours aux niveaux correspondants de protéines due à une régulation de la traduction, la demi-vie d'ARN, et le fait que des copies multiples de la protéine peuvent être générées pour chaque ARNm 10.
Pour ces raisons métaprotéomique est maintenant reconnu comme un outil important pour la microbiologie environnementale. Metaproteomic commune analyses utiliser une approche protéomique fusil de chasse où le plein complément près de protéines dans un échantillon complexe sont purifiés et analysés simultanément, généralement par le biais frla digestion zymatic en peptides et des analyses sur un spectromètre de masse. Après la spectrométrie de masse (MS / MS) "empreintes de peptide» est utilisé pour déterminer la séquence des peptides et des protéines potentiel d'origine par la base de données de recherche de protéines (pour une revue voir 11). Travaux protéomique a parcouru un long chemin dans les 25 dernières années grâce à l'augmentation de la disponibilité de données génomiques et l'augmentation de la sensibilité et la précision des spectromètres de masse permettant à haut débit l'identification des protéines et la quantification 11,12. Puisque les protéines sont le produit final de l'expression des gènes, les données metaproteomic peuvent aider à déterminer quels organismes sont actifs dans un environnement donné et ce que les protéines qu'ils expriment. Ceci est avantageux lorsque vous essayez de déterminer comment un ensemble particulier de variables environnementales aura une incidence sur le phénotype d'un organisme ou d'une communauté. Dès le début, les études metaproteomic base-MS / MS dans l'océan ont été utilisés pour identifier des protéines spécifiques dans ciblélignées microbiennes, avec la première étude mettant l'accent sur la lumière axée sur la pompe à protons protéorhodopsine dans SAR11 bactéries marines 13. Plus récemment, des analyses comparatives metaproteomic ont élucidé les profils d'expression différentielle des protéines complexes entre les communautés. Les exemples incluent l'identification des décalages temporels dans le métabolisme du littoral Atlantique Nord-Ouest 14 ou la péninsule antarctique 5. D'autres études ont décrit des variations dans les modes d'expression de protéines à travers les échelles spatiales, par exemple, le long d'un transect géographique d'un gyre océanique faible en éléments nutritifs à un système d'upwelling côtier très productif 15. Pour de plus amples commentaires de métaprotéomique nous recommandons Schneider et al. (2010) 9 et Williams et al. (2014) 16. Protéomique ciblée a également été employés au cours des dernières années pour quantifier l'expression des voies métaboliques spécifiques dans l'environnement 17,18.
There sont trois phases principales dans l'analyse metaproteomic. La première phase est la préparation des échantillons, qui comprend la collecte de l'échantillon, la lyse des cellules et la concentration de protéine. Prélèvement de l'échantillon en microbiologie marine entraîne souvent la filtration de l'eau de mer à travers un pré-filtre pour éliminer les cellules eucaryotes plus grandes particules et les bactéries de particules associé, suivie d'une filtration pour la capture de cellules microbiennes vivant libres, communément avec l'utilisation d'une cartouche de 0,22 pm unité de filtre 19,20. Ces filtres sont incased dans un cylindre en plastique et une lyse cellulaire et la protéine protocole d'extraction qui peut être effectuée à l'intérieur de l'unité de filtration, il est un outil précieux. Une fois la biomasse est obtenue, les cellules doivent être lysées pour permettre l'extraction de la protéine. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées, y compris la guanidine-HCl sulfate lyse 21 et le sodium dodécyl (SDS) méthodes de lyse à base. Bien que des détergents comme SDS sont très efficaces à perturber les membranes et solubilisation de nombreux types de protéines, concentrations dons aussi faible que 0,1% peut interférer avec la digestion des protéines en aval et l'analyse MS 22. De préoccupation majeure est les effets négatifs de SDS sur l'efficacité de la digestion de la trypsine, la puissance de la chromatographie inverse en phase liquide et la suppression d'ions ou de l'accumulation à l'intérieur de la source d'ions 23 résoudre.
La deuxième phase est le fractionnement et d'analyse, où les protéines sont soumises à une digestion enzymatique suivie d'une analyse LC MS / MS, entraînant schéma de fragmentation am / z qui peut être utilisé pour déterminer la séquence d'acides aminés primaire du peptide tryptique initial. Divers procédés de digestion peut être effectuée en fonction des types de détergents utilisés, ainsi que la spectrométrie de masse en aval flux de travail. Dans notre protocole, une électrophorèse PAGE-D suivie de l'élimination du SDS à partir du gel est utilisé pour enlever toute contamination de détergent. L'analyse de protéines qui sont difficiles à solubiliser, tels que des protéines membranaires, nécessite l'utilisation de haute concentrations de SDS ou d'autres détergents. Cela conduit à des problèmes de compatibilité avec l'électrophorèse SDS-gel. Si l'objectif d'une étude nécessite la solubilisation de ces durs pour solubiliser les protéines, le système de tube de gel peut être utilisé 22,24. Procédé tube gel comprend moins de protéines de la matrice de gel sans l'utilisation d'électrophorèse. Par la suite des détergents utilisés pour la solubilisation sont retirés avant la digestion des protéines.
La troisième phase est l'analyse bioinformatique. Dans cette phase, les données de peptide MS / MS sont recherchées contre une base de données de séquences nucléotidiques traduites de déterminer quels sont les peptides et les protéines présentes dans l'échantillon. L'identification des peptides dépend de la base de données contre il est recherché. Metaproteomic données marines sont généralement recherchées contre les bases de données comprenant des génomes de référence, les données métagénomiques tels que le jeu de données mondial océan échantillonnage 25, ainsi que des génomes de cellules amplifié simples de li incultesneages 26,27. Identification des protéines peut également être augmentée par l'inclusion de séquences metagénomiques partir du même échantillon que les données metaproteomic 5 a été dérivée.
Ici, nous fournissons un protocole pour la production de peptides appropriés pour l'analyse comparative MS / MS à partir de biomasse microbienne recueilli par filtration et stockées dans une solution de stabilisation de l'ARN. Le protocole décrit ici permet d'ADN et de protéines pour être isolés à partir du même échantillon de sorte que toutes les étapes menant à la protéine et les précipitations ADN sont identiques. D'un point de vue pratique, moins filtration est nécessaire, car un seul filtre est nécessaire à la fois pour les protéines et l'extraction d'ADN. Nous tenons également à souligner que ce protocole a été créé grâce à la combinaison, l'adaptation et la modification des deux protocoles précédemment publiés. Les étapes de lyse des cellules sont adaptées de Saito et al. (2011) 28 et la trypsine dans le gel digérer composant est conçu à partir de Shevchenko et al. (2007) 29.
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Protocol
1. Préparer Réactifs
- Préparer la solution de SDS-extraction: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% de glycerol, 10 mM d'EDTA et 1% de SDS. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C.
- Préparer les réactifs sous licence nécessaires au gel de Polyacrylamide.
- Préparer 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante.
- 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante.
- Préparer 10% de SDS. Stériliser par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante.
- Préparer les solutions nécessaires pour en gel digestion à la trypsine et de l'extraction de peptide.
- Préparer 100 mM de bicarbonate d'ammonium. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C.
- Préparer 1 Les stocks M TNT. En suspension dans 100 mM bicarbonate d'ammonium et conserver à -80 ° C.
- Préparer 550 mm stocks iodoacétamide. Suspendu dans100 mM de bicarbonate d'ammonium et conserver à -80 ° C.
- Préparer 100 ng / ul stocks de trypsine. Aliquote de 60 ul dans 1,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C.
- Préparer la solution d'extraction: l'acide formique à 1%, 2% d'acétonitrile.
- Préparer la solution de remise en suspension: 5% acétonitrile et de l'acide formique à 0,1%.
2. Effectuez lyse cellulaire dans la cartouche filtrante Unité avec cellules conservées dans la stabilisation des ARN Solution
- Expulser la solution de stabilisation de l'ARN à partir de l'unité de filtre à cartouche (1,5 ml) et dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml en utilisant une seringue de 60 ml attaché à l'extrémité du luer-lock du filtre.
- Centrifuger le tube de microcentrifugation de 2 ml pendant 10 min à 17 000 x g pour sédimenter les débris cellulaires. Ceci est fait de telle sorte que le filtre à l'étape 2.3 ne bouche pas.
- Transférer le surnageant dans une unité de filtre ultracentrifugation 10 K pour capturer des protéines provenant de cellules qui ont lysé provenant de la congélation / thaw de l'échantillon. Ne pas jeter le culot. Il sera utilisé dans l'étape 2.5. Effectuer centrifugation de l'unité de filtre ultracentrifugation à 3270 xg pendant 30 min ou jusqu'à ce que le volume soit réduit à 600 ul.
- Faire fondre la pointe d'une pointe de p10 et de bloquer le côté non luer-lock de l'unité de filtration à cartouche avec l'extrémité ouverte de la pointe. Cela permettra d'assurer qu'aucun tampon d'extraction et de la biomasse échappe lors des étapes 2,5-2,7.
- Suspendre le culot dans 1 ml de solution SDS-extraction et la pipette dans l'unité de filtration à cartouche originale. La meilleure façon de pipette dans l'unité de filtration à cartouche est d'empiler une pointe de P200 sur une pointe de p1000 et utiliser cette double pointe pour pipetage.
- Ajouter 1 ml de solution d'extraction SDS à l'unité de filtre à cartouche de sorte que le volume total est d'environ 2 ml et incuber pendant 10 min à la température ambiante tout en tournant dans un four à hybridation. Placer 3 essuie laboratoire froissé au fond d'un tube conique de 50 ml. Parafilm deux extrémités de l'unité de filtre à cartouche ferméeet mettre l'unité de filtre à cartouche dans le tube de 50 ml. Fermer le couvercle et mettre le tube dans le four d'hybridation.
- Après 10 min lieu filtrer le Sterivex sur un flotteur en mousse et fixez-le en place avec une seringue de 5 ml sur la fin de luer-lock. Flotter et incuber dans un bain-marie à 95 ° C pendant 15 min.
- Soit l'unité de filtre à cartouche froide et tourner à la température ambiante pendant une heure (comme à l'étape 2.6).
- Expulser la solution d'extraction / SDS lysat cellulaire sur le filtre avec 60 ml d'une seringue dans la même unité de filtre ultracentrifugation comme précédemment (étape 2.3). Ajouter 1 ml de solution fraîche d'extraction SDS à l'unité de filtration à cartouche et mélanger pendant 30 secondes à la main, puis expulser dans l'unité de filtre ultracentrifuge aide de la seringue de 60 ml. Ceci est pour rincer l'unité de filtre à cartouche pour assurer que toutes les protéines ont été enlevées.
- Effectuer centrifugation sur l'unité de filtre ultracentrifugation pendant 45 min à 3270 x g ou jusqu'à ce que le volume dans l'unité de filtre est inférieur à 600 ul.
- Jeter l'effluent et le haut de l'unité de filtre ultracentrifugation par une solution fraîche SDS-extraction.
- Centrifuger l'unité de filtrage pour un autre 45 min à 3270 x g.
- Répétez les étapes 2.11 et 2.12 fois plus. Assurer le volume final dans l'unité de filtration ultracentrifugation est au plus 600 pi à la fin de l'essorage final.
- À ce stade, le concentré diviser en deux. Une fraction sera utilisé pour la précipitation de l'ADN et l'autre pour la précipitation des protéines.
Remarque: Le montant de fractionnement dépend de la quantité de biomasse qui a été filtré et les utilisations prévues des produits. Dans notre cas, nous avons divisé le concentré avec 10% vers des précipitations de l'ADN et à 90% par la précipitation des protéines.
3. précipitation des protéines
- Ajouter 4 volumes de methanol: acétone (50:50) à un volume de concentré et vortex pendant 10 s. Incuber pendant la nuit à -20 ° C.
- Isoler à 17.000 g pendant 30 min. Décanter le surnageantet laissez le culot (peut être invisible) sec dans un speedvac pendant 1 heure (ou jusqu'à ce que sec).
Note: Ne pas trop sécher le culot car cela pourrait rendre difficile pour remettre en suspension. - Suspendre le culot dans 25 ul de solution SDS-extraction. Laisser reposer pendant une heure, puis remettre en suspension par pipetage de haut en bas.
- Quantifier la protéine en utilisant un kit de dosage de protéine et les instructions du fabricant.
4. ADN Précipitations
- Ajouter une solution de SDS-extraction de la fraction de concentré pour être utilisé pour l'ADN précipitation jusqu'à la marque de 500 pi. Cette étape consiste simplement à augmenter le volume de la solution, ce qui rend plus facile de travailler avec.
- Ajouter 0.583 volumes d'un réactif de précipitation de protéines (telles que la protéine MPC réactif de précipitation) et vortex pendant 10 s. Vous devriez voir une forme de précipité blanc.
Note: Nous avons également utilisé le phénol: méthodes d'extraction d'ADN chloroforme, mais il est plus difficile en raison des faibles volumes. Nous avons obtenu de meilleurs rendements d'ADN en utilisant laMPC précipitation des protéines réactif. - Centrifuger à 17 000 x g et 4 ° C pendant 10 min.
- Transférer le surnageant dans un autre tube de 1,5 ml et ajoutez 0,95 volumes d'isopropanol. Inversez 30-40 fois.
- Centrifuger pendant 10 min à 4 ° C à la vitesse maximale.
- Décanter avec soin et jeter le surnageant.
- Rincer deux fois avec 750 pi d'éthanol à 70%.
- Retirer autant que possible l'éthanol par pipetage, puis laissez sécher à l'air.
Note: Ne pas trop sécher l'ADN comme cela peut rendre difficile de remettre en suspension. - Remettre en suspension dans 25 ul de tampon TE faible, pH 8 (10 mM de Tris-HCl, 0,1 mM d'EDTA).
- Quantification de l'ADN en utilisant un kit de dosage d'ADNdb et les instructions du fabricant. Effectuer gel d'agarose électrophorèse (1%) sur 3 pi de l'ADN pour vérifier sa qualité.
5. Gel SDS-PAGE de protéines
- Préparer un tampon d'échantillon (950 pi de tampon d'échantillon de Laemmli et 50 pi de β-mercaptoéthanol). </ li>
- Ajouter le volume correspondant à 15 pg de protéine, ou un maximum de 20 pi à un volume égal de tampon d'échantillon et faire bouillir pendant 4 min. Les échantillons peuvent maintenant être stockés à -80 ° C jusqu'à SDS-PAGE peut être effectuée.
- Préparer 10% d'acrylamide résoudre gel avec un gel d'empilement acrylamide à 5%.
- Chargez le gel avec des échantillons et 4 ul d'une échelle de protéines. Exécutez le gel à 120 V constante jusqu'à ce que le marqueur de 250 kDa échelle vient d'atteindre le gel de résolution.
- Colorer le gel en utilisant un Coomassie base selon les instructions du fabricant.
6. Dans gel trypsine Digest et Peptide Extraction
Remarque: Toutes les étapes d'ici jusqu'à ce que 6.10 sont effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour minimiser la contamination.
- Coupez l'excédent de gel sous la barre des 10 kDa échelle pour chaque voie. Chaque voie sera analysé sur la MS / MS séparément. Couper chaque piste en 1 mm x 1 mm carrés pour augmenter la surface et de placer tous squares de la voie dans un tube à faible liaison micro-centrifugeuse. Répétez cette opération pour toutes les voies. (Acide acétique à 1% peut être utilisé pour prévenir le gel de se dessécher et de devenir difficile à couper).
Remarque: minimiser la contamination est essentiel à ce stade, de sorte gel tranchage est effectué dans une enceinte de sécurité biologique sur le verre SDS-PAGE moule de gel utilisé pour fabriquer le gel. - De-taches
- Distribuer 50 pi de bicarbonate d'ammonium 100 mM dans chaque tube à faible liaison, fermer le bouchon et incuber à 37 ° C pendant 10 min.
- Distribuer 50 ul d'acétonitrile, fermer le bouchon et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
- Aspirer et jeter 150 pi.
- Répétez les étapes 6.2.1 et 6.2.2.
- Aspirer et jeter 95 pi.
- Déshydration
- Distribuer 50 pi acétonitrile, fermer le bouchon et attendre 5 min. Aspirer et jeter 45 pi et attendre 10 min.
- Réduction
- Distribuer 50 pi de DTT (10 mM, dilué dans amm 100 mMbicarbonate onium), fermer le bouchon et attendre 30 min à 37 ° C.
- Alkylation
- Distribuer 50 ul d'iodoacétamide (55 mM, dilué dans du bicarbonate d'ammonium 100 mM), fermer le bouchon et attendre 20 min à 37 ° C.
- Distribuer 100 ul d'acétonitrile, fermer le bouchon et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Aspirer et jeter 195 pi.
- lavage
- Distribuer 50 pi de bicarbonate d'ammonium, fermer le bouchon et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
- Distribuer 50 ul d'acétonitrile, fermer le bouchon et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Aspirer et jeter 120 pi.
- Déshydration
- Distribuer 50 pi acétonitrile, fermer le bouchon et attendre 5 min. Aspirer et jeter 45 ul.
- Distribuer 50 ul d'acétonitrile, attendez 5 min.
- Aspirer et jeter 75 pi et attendre 5 min.
- Digestion
- Distribuer 25-30 pi de 6 ng / ul trypsine (uusqu'à tous les fragments de gel sont couverts). Fermer bouchon et attendre 30 min à température ambiante.
- Incuber pendant la nuit (4,5 heures minimum) à 37 ° C.
- Laisser reposer à la température ambiante pendant 30 min.
- Extraction et transfert Peptide
- Distribuer 30 pi de solution d'extraction et couvrez avec le couvercle pendant 30 minutes sur la glace.
- Aspirer 30 pi et distribuer le volume aspiré dans un nouveau tube à faible liaison marqué.
- Distribuer 12 ul de la solution d'extraction et de 12 ul d'acétonitrile dans le tube initial (par gel). Fermer capuchon et incuber pendant 30 min sur la glace.
- Aspirer 15 pi et le dépôt dans le nouveau tube.
- Répétez les étapes (6.9.3 et 6.9.4).
- Placez nouveaux tubes dans un SpeedVac jusqu'à sec.
- Remettre en suspension dans 50 ul de solution de remise en suspension. Vortex sur milieu pendant 10 min pour remettre en suspension.
- Solution de peptide de la pipette dans des flacons soit des nano LC / ou des plaques à 96 puits appropriés pour la nano / LCTravail MS / MS.
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Representative Results
Comme une démonstration, nous avons effectué le protocole sur deux échantillons d'eau de mer prélevés dans la surface et le maximum de la chlorophylle de l'océan côtier dans le Nord canadien. En mer, l'eau de mer 7/6 L a été passé à travers un 3 um GF / D préfiltre, puis les cellules microbiennes ont été recueillis sur un filtre à cartouche de 0,22 pm en suivant le protocole de Walsh et al. 20. Les cellules ont été immédiatement stockés dans une solution de stabilisation de l'ARN jusqu'à ce que le traitement ultérieur. De retour au laboratoire, nous avons effectué le protocole tel qu'il est présenté ici. Le lysat cellulaire concentrée a été divisée; protéine a été précipitée à partir de 90% du volume, tandis que l'ADN a été précipité à partir des 10% restants du volume. Nous avons récupéré 24-26 ug de protéine et de 250 à 308 ng d'ADN de haute qualité à partir de ces échantillons (Figure 1). Après l'en-gel de la digestion de la trypsine et de l'extraction de peptide, nous avons soumis les peptides à l'analyse MS / MS en utilisant un nano-LC couplée à la Orbitrap Elispectromètre de masse te (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). De les peptides, nous avons généré plus de 23.000 spectres par échantillon MS / MS. Peptides et protéines ont ensuite été identifiées par une recherche de ces spectres contre une base de données interne de séquence personnalisée en utilisant l'outil de bioinformatique de pics (BSI, Waterloo, ON, Canada). La base de données a été constituée de protéines prédites de génomes et métagénomes de référence marins. La recherche a abouti à l'identification de près de 1000 peptides et protéines 700-800 pour chaque échantillon. Naturellement, ces résultats dépendent de l'abondance de cellules microbiennes, MS instrumentation et base de données de recherche de protéines et algorithmes. Néanmoins, ces résultats démontrent que ce protocole a le potentiel pour produire des peptides tryptiques adéquates aptes à identifier des centaines de protéines dans l'environnement. En outre, puisque les bibliothèques métagénomiques peuvent être construits à partir d'aussi peu que 100 ng d'ADN 30, ce protocole a également le potentiel de fournir des quantités suffisantes de l'ADNpour générer des ensembles de données métagénomiques-metaproteomic appariés.
Composition taxonomique et fonctionnelle des metaproteomes a été analysé en utilisant une combinaison de BLASTp et MEGAN (Metagénome analyseur) progiciel 31,32 (Figure 2). Protéines affectées à Alpha-protéobactéries étaient le plus fortement représenté dans le jeu de données, la grande majorité d'entre eux ont été affectés à la clade SAR11. Le clade Rhododobacterales d'Alpha-protéobactéries a été également fortement représenté et identifié le plus souvent dans les eaux de surface. Les protéines assignées à Bacteroidetes ont été distribués de manière égale entre la surface et la chlorophylle maximale, mais les protéines flavobactéries ont été identifiés à un degré supérieur au maximum de la chlorophylle. Les protéines gamma-protéobactéries ont été distribués uniformément dans toute la colonne d'eau tandis que les protéines bêta-protéobactéries ont été trouvées de manière prédominante dans la surface . Deun point de vue fonctionnel, une large gamme de voies métaboliques ont été identifiées. Structuration verticale de ces voies métaboliques était apparente. Par exemple, les protéines associées au métabolisme des acides aminés, le métabolisme des glucides et des voies de fixation de carbone procaryote ont été identifiés principalement à la surface, et métabolisme de l'azote a été trouvée exclusivement en surface. Les protéines de fixation de carbone ont été observés principalement photosynthétiques à un maximum de chlorophylle tandis que les protéines impliquées dans la photosynthèse ont été identifiés de manière uniforme entre la surface et le maximum de la chlorophylle. Ces résultats montrent qu'une grande variété de protéines à partir d'une diversité de taxa microbienne peut être détectée en utilisant le protocole présenté ici.
Figure 1:. L'ADN génomique de 2 profondeurs à la station Arctic S633 La première voie de 4 pi d'un ADN de 1 kb ladditionneur, piste 2 contient 3 ul d'extraction d'ADN génomique à partir de S633_2 m, piste 3 contient 3 ul d'extraction d'ADN génomique à partir de S633_20 m et les pistes 4-6 contiennent 0,5 pi (85 ng), 2 ul (333 ng) et 4 pi ( 667 ng) digéré par HindIII d'ADN lambda.
Figure 2:. Analyse taxonomique et fonctionnelle des 2 profondeurs à la station Arctic S633 Comparaison de la diversité taxonomique de l'Arctique poste 633 eaux de surface et la chlorophylle maximales (A) créée en utilisant MEGAN. Comparaison de la diversité fonctionnelle de l'Arctique poste 633 eaux de surface et la chlorophylle maximales (B) créé en utilisant MEGAN pour interroger la base de données contre KEGG. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Exemple de préservation est essentielle pour metaproteomic études et des travaux antérieurs ont démontré que la solution de stabilisation de l'ARN est un tampon de stockage pour stocker des cellules utile avant l'extraction des protéines 28. Idéalement, les échantillons seraient conservés in situ pour annuler des changements dans l'expression des protéines pendant la manipulation 33,34. En effet, in situ technologies d'échantillonnage et de fixation ont été développés, qui permettent la collecte autonome et la conservation des échantillons par les instruments de bord déployée. Toutefois, l'accès à ces technologies est pas toujours possible. Dans le cas le plus courant qu'il n'y a pas, les échantillons doivent être conservés dès que possible après la collecte.
Ici, nous présentons un protocole d'extraction de protéines à partir de cellules de la solution stockée de stabilisation de l'ARN prélevés sur une unité de filtre à cartouche, qui est couramment utilisé en microbiologie aquatique. Le protocole comprend la lyse des cellules en utilisant une solution de lyse SDS et le chauffage, suivie d'une protein étape de concentration en utilisant des unités de filtre double ultracentrifugation que comme une étape de dessalage est nécessaire. Il faut noter que les étapes de concentration et de dessalage ne peuvent pas être négligés. Nous avons trouvé qu'un minimum de trois étapes d'échange de tampon a été nécessaire pour dessaler notre concentré. En raison de la forte concentration en sel de la solution de stabilisation de l'ARN, si approprié dessalage ne se produit pas, trop de sel est précipité au cours de l'étape de précipitation de protéine pendant une nuit et l'étape de dessalage et la précipitation devra être répété. En outre, si le dessalement ne sont pas correctement effectué le 1D-PAGE ne fonctionnera pas et les échantillons seront perdues.
Ensuite, le lysat concentré a été divisé de sorte que les deux précipitation des protéines et précipitation de l'ADN peuvent être effectuées. Ceci est utile car il est souvent souhaitable que les données metagénomiques et metaproteomic être générés à partir des mêmes échantillons. Si une protéine est pas représenté dans la base de données de séquences de protéines, puis le peptidene pas être identifié. Y compris les données génomiques de la même échantillon que les données protéomiques réduit le risque de ne pas être en mesure d'identifier une protéine en raison de son absence de la base de données.
Bien que ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec les unités de filtres à cartouche et validé à travailler sur les communautés microbiennes de l'océan côtier, il peut être adapté pour une utilisation avec d'autres types d'échantillons environnementaux et des filtres. Cependant, il doit être clairement indiqué que le succès de ce protocole dépend d'une quantité adéquate de partir de la biomasse. Par conséquent, dans les écosystèmes aquatiques où la biomasse peut être très faible, nous recommandons d'augmenter le volume d'eau filtrée en conséquence.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
| RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
| Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
| SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
| 10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
| MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
| Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
| Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
| Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
| 30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
| Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
| B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
| Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
| Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
| NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
| HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
| Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
| Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
| Protein LoBind Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
| 2 ml ROBO vial 9 mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
| PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |
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