Introduction
Depuis 1973, le modèle de greffe de rein chez la souris a été un précieux outil de recherche, mais des problèmes techniques ont entravé son utilisation généralisée. Au cours des années, plusieurs articles ont été publiés en détail les améliorations / améliorations apportées à cette procédure. Comme un modèle de transplantation d'organes solides principalement vascularisé cette procédure est probablement le deuxième seulement pour le modèle de transplantation cardiaque hétérotopique qui a également été conçu par le laboratoire Russell en 1973 6. Les deux modèles se prêtent à la recherche sur les réponses de rejet allogénique, le développement de la fonction du greffon retardée et les lésions d'ischémie reperfusion.
Une des questions les plus courantes à être rapportés avec la transplantation rénale est l'incidence relativement élevée de thrombose artérielle 4,5,7 que nous avons également vécu dans notre laboratoire. Nous mettons donc à effectuer une revue de la littérature de la formation de thrombus et peut-être trouver la cause de ce problème technique et d'élaborer aussi unsolution possible. La cause la plus probable de la thrombose est le chemin tortueux peu le sang prend de l'aorte bénéficiaire, dans l'aorte rénale des bailleurs de fonds lors de l'artère rénale des bailleurs de fonds. Cette voie provoque une turbulence dans l'artère rénale qui peut conduire à l'activation des plaquettes et la formation de thrombus. Basé sur les observations récentes et une recherche de la littérature pertinente 8-14 nous sommes arrivés avec une nouvelle technique qui a réduit la thrombose de 0%.
La technique décrite ici varie de techniques précédemment rapportées dans la formation d'une artère talon-orteil qui brassard installations améliorées circulation sanguine et réduit considérablement la formation de thrombus. La manchette est formée en divisant l'aorte sous-rénale sur la face de l'ostium des artères rénales à un angle inférieur à 45 ° à l'axe longitudinal de l'aorte (figure 1A et 1B). Cela se traduit par une manchette d'environ 2 mm de longueur. Un patch Carrel veineuse est formé par sectionnant la rénal la veine IVC en augmentant ainsi le diamètre du brassard. Le donneur aorte abdominale talon-orteil brassard sous-rénale est de bout en côté anastomosée au destinataire aorte abdominale et la veine rénale des bailleurs de fonds / patch IVC est de bout en côté anastomosée au destinataire abdominale veine cave inférieure (VCI) . L'uretère est ensuite introduit dans et ancrée à la vessie telle que décrite par Han et al trois.
Pour cette étude des greffes non traités avec des temps d'ischémie chaude seulement (ie., Aucune ischémie froide) sont comparées. Dans ce cas ischémie chaude se réfère au moment de la cessation du flux sanguin dans le rein d'un donneur (étape 1.11 ci-dessous) et la reperfusion du greffon chez le receveur (étape 2.11 ci-dessous). Ischémie froide se réfère au temps que le rein perfusé est pas et est conservé en chambre froide jusqu'à ce que le début de la procédure d'implantation.
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Protocol
Toutes les souris ont été achetés auprès de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) et ont été logés dans des conditions exemptes d'organismes pathogènes à l'Université du Colorado à Denver, Facilité Barbara Davis Animal Center conformément aux directives du NIH et avec l'approbation de l'Université du Colorado à Denver IACUC.
1. donneur de rein récolte
- Stériliser tous les instruments, porter des gants stériles tout au long de la procédure et de maintenir un champ stérile. Effectuer toutes les interventions chirurgicales à l'aide d'un microscope opératoire.
- Enlever chirurgicalement reins de donneurs de souris à partir de pentobarbital anesthésiés (60mg / kg ip) les bailleurs de fonds. Déterminer profondeur de l'anesthésie par pincement pincée, et observer la fréquence respiratoire.
- Clip de la fourrure puis immobiliser la souris en 4 voies restrictions. Préparer la peau avec de la povidone-iode et le drapé de la souris de façon stérile.
- Faire une ligne médiane verticale 2 cm incision abdominale et entrer dans la cavité abdominale. Rentrer l'intestin supérieurement et extériorisersur la poitrine. Gardez l'intestin enveloppé dans de la gaze stérile humide tout au long de la procédure.
- Identifier les grands vaisseaux de l'abdomen et de les mobiliser, d'identifier les branches lombaires et soit cautériser ou de les ligaturer avec 10/0 suture en nylon.
- Immédiatement en aval des vaisseaux rénaux gauche taquiner le veine cave inférieure (VCI) et l'aorte abdominale (AA) en dehors par dissection sur environ 2mm. Ligaturer avec 10/0 nylon et diviser petite artériel et veineux branches des vaisseaux rénaux.
- Maintenant séparer la veine rénale de l'artère rénale attentivement par dissection de ces structures. Cela permet la création d'un timbre précis Carrel à l'extrémité proximale de la veine rénale, qui sera utilisé pour former une anastomose termino-latérale aux destinataires IVC.
- Identifier, ligaturer et de diviser les vaisseaux surrénales gauche. Ceci permet l'accès à l'aorte sus-rénale et une suture en soie 6-0 de est placé autour de l'aorte en vue de la ligature, mais pas lié à ce moment. Mobiliser les reins, les vaisseaux et de l'uretère de la planche de bord environnante. Tourner le rein à la droite et ligaturer / diviser des branches postérieures. Puis retour du rein vers la gauche.
- Maintenant diriger l'attention vers l'uretère. Sans perturber le hile rénal libérer l'uretère de la planche de bord environnante en prenant soin de préserver les vaisseaux de l'uretère. Diviser l'uretère au niveau du canal déférent. Le rein est maintenant prêt pour la récupération.
- Injecter lentement 300 unités d'héparine dans le IVC distale héparinisation ainsi le donateur. Attacher le fil de suture en soie 6-0 de placée autour de la surrénale AA et perfuser le rein gauche via l'aorte abdominale distale avec 0,8 ml de solution saline d'héparine (100 U / ml).
- Une fois la perfusion a cessé de créer un patch Carrel veineuse immédiatement pour éliminer refoulement dans le rein. Rétracter la veine rénale vers le rein révélant l'AA et l'artère rénale dessous.
- Diviser l'aorte adjacente à l'artère rénale la création d'un talon et àe brassard, comme montré dans la figure 1. Retirez les reins, les vaisseaux et de l'uretère du donneur.
- Retirer le rein directement à un destinataire pré-établi (0 min temps froid ischémie) ou stockées à 4 ° C dans une solution de choix pour un temps prédéterminé jusqu'au moment de l'implantation. Euthanasiés par les bailleurs de fonds et exsanguanation dislocation cervicale. Temps total de récupérer donneur de rein est d'env. 15-20 min.
2. Rein Implant Technique
- Anesthésier la souris receveuse avec du pentobarbital (60 mg / kg de la dose initiale IP, dose supplémentaire / kg IP de 25mg si nécessaire). Déterminer profondeur de l'anesthésie par pincement pincée, et observer la fréquence respiratoire. Coupé la fourrure puis immobiliser la souris en 4 voies contraintes et appliquer pommade ophtalmique pour les yeux. Préparer la peau avec de la povidone-iode et le drapé de la souris de façon stérile.
- Faire une ligne médiane verticale 2 cm incision abdominale et entrer dans la cavité abdominale. Retrait de l'intestinsupérieurement et extérioriser sur la poitrine. Gardez l'intestin enveloppé dans de la gaze stérile humide tout au long de la procédure.
- A ce moment effectuer une néphrectomie droite. Ligaturer l'artère et la veine rénales avec 6-0 sutures de soie. Exciser le rein distale par rapport à la suture. Ligaturer l'uretère avec soie 6-0 et ensuite diviser proximale du rein.
- Isoler l'aorte abdominale et veine cave inférieure (VCI) au-dessous des artères rénales. Placez 4-0 liens de coton autour de l'aorte et IVC supérieure puis inférieure vers le site d'anastomose. Identifier et ligaturer des vaisseaux lombaires dans le domaine de nylon 10-0 suture.
- Nouer les liens de coton, d'abord l'inférieur, suivie par le supérieur. De cette manière, un peu de sang est retenu dans la prise de l'aorte aortotomie plus facile.
- Former le aortotomie avec une aiguille de 30G pour entrer dans la lumière de l'aorte. Elargir l'incision avec de fines micro ciseaux pour une longueur d'environ 2mm.
- Faire une fin anastomose de la coiffe aortique donateurs talon-orteill'aorte bénéficiaire de la façon suivante. Placez un nylon 10-0 séjour de suture point dans l'aorte des bailleurs de fonds et de l'angle inférieur de l'incision dans l'aorte bénéficiaire et une cravate.
- Placez un second nylon 10-0 opposée à la première dans l'aorte des bailleurs de fonds et le coin supérieur de l'incision dans l'aorte abdominale et une cravate. Faire une ligne de suture allant de supérieure à inférieure dans la paroi latérale de l'aorte et une cravate contre le séjour point précédemment placé. Puis suturer la paroi interne d'une manière courante et une cravate.
- Faire une fin anastomose de la veine rénale de donneur au receveur IVC de la façon suivante. Piquer la IVC avec une aiguille de 30G et d'étendre l'incision avec de beaux ciseaux micro. Attachez la veine rénale des bailleurs de fonds dans le coin inférieur de l'incision dans l'IVC, avec nylon 10-0. Faire une ligne de suture courant entre la veine rénale et la veine cave inférieure et une cravate.
NOTE: Il est également extrêmement important que toute l'épaisseur passe de l'aiguille de suture compris le adventit vasculaireIA et l'intima sont atteints. Éversion des bords garantit également qu'il n'y a intima à intima contact, ce qui contribue à l'étanchéité et à la guérison des anastomoses. Alors un agent de coagulation hémostatique peut être utile pour réduire les fuites, nous recommandons que le chirurgien place reposent sur une bonne technique. - Veiller à ce que les anastomoses sont «propres». Autrement dit, que les parois opposées sont pas pris en plaçant des points de suture. Cela entraînera une constriction importante à l'écoulement qui se traduira par un greffage en panne et dans des cas extrêmes, à la paralysie des membres postérieurs.
NOTE: Un autre facteur extrêmement important est de veiller à ce que la tension des lignes de suture anastomotiques est également optimale. Trop lâche et il y aura une fuite irréversible, trop serré et sténose de circuler en résultera. Si artérielle sur le côté cela se traduira par une mauvaise perfusion de la greffe, si sur le côté veineux d'un rein congestionné en résultera. - Relâchez le flux veineux distale 4-0 coton cravate rétablissement. Une fois l'hémostase du veinonous anastomose a été observé progressivement desserrer la cravate 4-0 de coton proximale et observer l'anastomose artérielle pour l'hémostase.
- Retirez les liens de coton de la souris une fois les deux anastomoses sont considérés comme sûrs. Pierce la vessie avec une aiguille 20 G création de deux trous.
- Passer les conseils de pince courbe à travers les trous et tirez l'uretère des bailleurs de fonds à travers la vessie avec la pince avec l'extrémité proximale de l'uretère étant ancrée à la paroi de la vessie avec deux fils de nylon 10-0. Coupez l'excès de longueur de l'uretère saillie de la deuxième trou permettant l'uretère se rétracter dans la vessie et fermer le trou avec deux fils de nylon 10-0.
- Retour de l'intestin à l'abdomen. Fermez la paroi abdominale en deux couches en utilisant 5-0 suture soie dans un mode en cours d'exécution.
- Administrer un bolus de 1,0 ml solution saline stérile normale chaud dans l'abdomen comme la réanimation liquidienne à la clôture, et injecter 0,8 ml de solution saline sous-cutanée post-opératoire normal. Aucune autre supportive mesures sont nécessaires pendant la chirurgie.
- Récupérer l'animal sur une couverture chauffante. Temps implant totale est d'env. 35 à 45 min. Administrer des analgésiques tels que la buprénorphine, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml au début de la procédure et tous les 6-12 h pour 72 h post-op.
3. néphrectomie controlatérale
- Selon les exigences du protocole, plusieurs jours après la procédure d'implantation, effectuent une néphrectomie controlatérale l'isoflurane (5% de l'isoflurane inhalation pour l'induction, 1,5-2,0% pour la maintenance).
- Entrez la cavité abdominale et se rétracter doucement l'intestin à la droite de l'animal. Exposer le rein gauche et de disséquer émoussée du fascia environnantes.
- Ligaturer l'artère rénale, la veine et de l'uretère avec 6-0 sutures de soie puis exciser le rein au-dessus des points de suture et enlever le rein. Le temps opératoire total est d'env. 10 min.
4. Évaluation Graft
- Mesure sérum creatineuf en utilisant le procédé au picrate alcalin (réaction de Jaffe).
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Representative Results
Cette technique chirurgicale permet pour des études de survie / de rejet de greffe, simples ou protocoles expérimentaux assez complexes. Dans les figures ci-dessous, nous démontrons les avantages de l'utilisation de cette technique améliorée d'anastomose artérielle. En utilisant cette technique, nous avons considérablement réduit l'incidence de la thrombose artérielle de 35% à 0% augmentant ainsi la productivité. Nous avons utilisé cette technique pour plus d'un an avec le même résultat de thrombose de 0% entretenue. La figure 1 décrit le procédé pour la formation de la artériel talon-pointe manchette qui est à la base de cette nouvelle technique. Cette manchette prévoit une anastomose plus long et un trajet d'écoulement de sang rectiligne dans le rein. Ces deux points Résultat diminué de manière significative dans turbulence réduisant ainsi la probabilité de l'activation plaquettaire et la formation de thrombus.
Figure 2. L'analyse immunohistochimique. Section d'un contrôle non-tra (A) acide périodique Schiff tachéerénale nsplanted. (B) Une greffe de rein syngénique au POD 8 en utilisant la technique révisée démontre cellules tubulaires proximales normales, qui sont de forme parallélépipédique, avec un cytoplasme clair et une lumière noyau rond au milieu de la cellule. Il existe des preuves de blessure légère bordure en brosse (flèches), mais la majorité des bordures en brosse sont régulières et bien préservé. Agrandissement: 400x.
Tableau 1. Comparaison de l'incidence de la thrombose et des temps de ischémie chaude entre les deux techniques. Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne ± SD. Pour les comparaisons simples, données normalement distribuées sont évalués en utilisant, test t de Student bilatéral non appariés, et les données non distribuées normalement sont analysés par le test non apparié non paramétrique de Mann-Whitney. Les valeurs de p de moins de 0,05 sont considérées comme statistiquement significant.
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Discussion
La maîtrise de cette technique de greffe est difficile, mais une fois accomplie, il est un outil de recherche très puissant. Le patient chirurgien / chercheur sera récompensé par une attention aux détails et la cohérence de la technique, qui est la clé de la maîtrise de toute intervention chirurgicale, plus encore dans de petits modèles animaux. Les difficultés techniques de maîtrise de la greffe de rein de souris sont nombreux plis, et il est hautement probable que l'expérience dans d'autres petits modèles animaux de transplantation doit être acquise avant d'aborder cette procédure.
Il est important de veiller à ce que les anastomoses sont "propres", à savoir, les parois vasculaires opposés ne doivent pas être pris lors du placement des points de suture afin de maintenir un brevet lumen. Sinon, il y aura une constriction importante à l'écoulement qui fera plus que résultat probable dans une greffe échoué et dans les cas extrêmes conduire à la paralysie des membres postérieurs. Il est aussi extrêmement important que toute l'épaisseur passe de l'aiguille de suture y compris l'adventice vasculaire et l'intima sont atteints que cela se traduit par une bonne evertion des bords assurer qu'il ya un contact intima-à-intima qui contribue à l'étanchéité et la guérison des anastomoses. Alors un agent de coagulation hémostatique peut être utile pour réduire les fuites, nous recommandons que le chirurgien place comptent sur une bonne technique.
Aussi une attention particulière doit être accordée pour assurer la tension des lignes de suture anastomotiques est optimale, trop lâche et il y aura une fuite irréversible, à flux tendu et réduit en résultera. Si artérielle sur le côté cela se traduira par une mauvaise perfusion de la greffe, si sur le côté veineux d'un rein congestionné en résultera. Atteindre cette tension correcte est une question de pratique et de l'expérience avec d'autres modèles de petits microvasculaires animal sera d'une grande aide. Surtout la cohérence de la technique et une attention sans faille aux détails donnera une excellente souris et la survie du greffon, et la fonction de greffe de rein.
t "> Les limites de cette technique ne sont régis que par les usages qui peuvent être appliqués par l'enquêteur. Comme pour toute procédure microvasculaire, tant que la bonne technique est observée, les résultats doivent être reproductibles.L'incidence de la thrombose artérielle par cette technique a été considérablement réduit. Il en résulte au moins 1/3 de toutes les greffes de rein étant convertis de défaillances techniques potentielles de données utilisables, ce qui entraîne une réduction des coûts et une productivité accrue.
Comme un modèle de transplantation entièrement vascularisé, orthotopique les applications futures comprendront rejet / études de tolérance, le phénomène de la fonction et des enquêtes de greffe retardée dans les mécanismes de lésions d'ischémie / reperfusion.
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Acknowledgments
Ce travail a été financé en partie par 1R03DK096151.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5m spool | 18020-50 | ||
| Suture | |||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Drapes | ||
| Biogel from Medex Supply | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | Cotton applicators | ||
| B-D 1cc insulin, #329424 | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | |||
| PDI, #B40600 | |||
| 4/0 Cotton ties | |||
| Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
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