Medicine

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

Published: October 9, 2015 doi: 10.3791/52861

Dibash K. Das^1,2, Michelle K. Naidoo¹, Adeodat Ilboudo¹, Pascal DuBois¹, Victoria Durojaiye¹, Chen Liu³, Olorunseun O. Ogunwobi^1,2

¹Department of Biological Sciences, Hunter College of The City University of New York, ²Departments of Biology and Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, ³Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida

Protocol

הצהרת אתיקה: כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) של האנטר קולג 'של האוניברסיטה של העיר ניו יורק.

1. נהלים טרום ניסוי

עם ההגעה למתקן בעלי החיים, בתחילה בית 3 עכברי BALB / ג לכלוב עם מצעים העליונים ועץ שבב מסונן. ודא שיש לי העכברים גישה חופשית למזון, אוכל מכרסם פורינה, ומים. מצעים ומזון צריכים להיות מוחלפים פעמיים בשבוע בזמן שיש לנקות כלובי פעם בשבוע.
לגרום להרדמה כללית בעכברים באמצעות מכשיר אדים isoflurane יחד עם חמצן בקצב זרימה קבוע של 1 ליטר לדקה. המערכת היא עצמאית וכוללת מאדה דיוק.
בעלי החיים מיקום בקופסא פלסטיק שיש מאדה הדיוק וגז / מערכת הרדמה המחוברת אליו. בתחילה להגדיר את מאדה 2.5 עד בעלי החיים הוא חסרי הכרה, ובשלב זה להפחית את האידוי 2.
באותו זמן, לעבורקו שסתום, איטום אותו לתיבה ולפתוח אותו לחרטום.
הזז את בעלי החיים לאזור ההכנה, עם החרטום ממוקם כראוי ומחובר (להרדמת תחזוקה).
הכן 5 × 10 ⁶ תאי HCC עכבר BNL 1ME A.7R.1 להשתלה לכל עכבר. BNL 1ME A.7R.1 צריך להיות גדל במדיום (10% חום מומת FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 מ"מ L- גלוטמין) דוגרים בצלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם אוויר ו -5% CO _2.
עם מזרק שיש 20 מחט G, של PBS 100 μl השתל המכיל 5 x 10 ⁶ תאים קרצינומה hepatocellular עכבר BNL 1ME A.7R.1 לאונה של הכבד של עכברים / ג BALB לייצר גידולים הראשוניים. לאחר השתלה, בית העכברים / ג BALB בכלוב עם אותן דרישות הבית כטרום השרשה.
בנקודת סיום הניסוי, עדות קלינית של קרצינומה hepatocellular היא נצפית כירידה משמעותית במצב גוףציון (בדרך כלל מזוהה לאחר 4 שבועות). בשלב זה, יש סיכוי שגידולים ראשוניים פיתחו בכבד ואילו פיקדונות גרורתי יצרו את הריאות. לאחר מכן, להתחיל התהליך של הבידוד והתפשטות תאים סרטניים במחזור.

2. אוסף של דם מלא למחזור בידוד תאים סרטניים

הערה: כראוי מחוטאת אזור הניתוח ולוודא שהוא נטול עומס. החיטוי כל מכשירי הניתוח או לטבול בחומר חיטוי בהתאם להמלצת יצרן

להקריב עכברים על ידי המתת חסד הומנית בנקודת סיום ניסוי (עדות קלינית של התפתחות גידולים). מתת חסד של עכברים צריכה לערב CO ₂ מחנק. שים לב לעכברים כראוי כדי לאשר הרדמה מופץ בצורה נכונה. פחמן דו חמצני יש לשחרר באיטיות לתוך התא על פני תקופה של 5 - 10 דקות, גורמים לדום נשימה. עקוב ידי exsanguination וcervic intracardiacאל עקירה. ⁵
שימוש במחט 25 G מצורפת מזרק 1 מיליליטר לאוסף של כל דם. Heparanize המזרק עם 0.01 מיליליטר הפרין. עור לנקב מייד עם המחט נחותה xyphisternum הזווית של 45 מעלות בכ. קידום מחט לאט לנקב את הלב, ואז להנמיך את הזווית של המחט. הולך ומתפשט המחט ומזרק במקום, ולצייר את 500 μl - 1,000 μl של כל דם מהלב.
הסר את המזרק ומחט ולהעביר את הדם לתוך צינור ללא pyrogen 1.5 מיליליטר שכותרתו מראש. צנטריפוגה כל הדם שנאסף לתוך 1.5 מיליליטר צינור ללא pyrogen ב1,167 XG במשך 5 דקות.
הערה: צנטריפוגה שמפריד בין כל דגימת הדם לשלוש שכבות: השכבה התחתונה או המטוקריט המורכב מתאי דם אדומים, שכבת ביניים דקה של מעיל באפי, ושכבה עליונה פלזמה.
הסר את הפלזמה בקפידה על ידי pipetting ואיסוף אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר pyrogen ללא נפרד לפירטניסויים אה כגון זיהוי של חומצות גרעין תא ללא ^7.
לבידוד של תאי גידול במחזור (CTCs), לאסוף את המעיל באפי לתוך צינור ללא pyrogen נפרד 1.5 מיליליטר בהכנה לתאי דם אדומים תמוגה (RBC). זה הכרחי כדי להסיר RBCs שייר בשכבת המעיל באפי.

3. מתכון לתאי דם אדומים (RBC) תמוגה מאגר

הפוך פתרון 1 ליטר של חיץ תמוגה RBC.
הפוך 500 מיליליטר של אמוניום כלוריד ו -500 מיליליטר של טריס. אז לערבב כדי ליצור פתרון 1 ליטר של חיץ תמוגה RBC עם ריכוז סופי של 155 מ"מ של אמוניום כלוריד ו -10 מ"מ של טריס.
חיץ הפתרון לpH של 7.5. אחסן את מאגר תמוגה RBC ב2-8 מעלות צלזיוס, ולהביא לRT מייד לפני שימוש.

4. RBC תמוגה של מעיל באפי

הוסף 1 מיליליטר של חיץ תמוגה RBC לצינור 1.5 מיליליטר סטרילי ללא pyrogen מכיל מעיל באפי שנאסף.
מערבבים את התוכן של הצינור על ידיהיפוך מספר רב של פעמים. דגירה התוכן מעורב של הצינור במשך 5 דקות ב RT על הספסל. צנטריפוגה התוכן המעורב במשך 5 דקות ב1,167 x גרם.
לאחר צנטריפוגה, תתקבל גלולה לבנבן. בטל supernatant האדמדם לאט ובזהירות לאקונומיקה 10% ללא כל הפרעה לגלולה. אם גלולה היא לא לבנבן, מחדש לעשות צעדים 3.1-3.5. הגדלת זמן הדגירה במאגר תמוגה RBC עד 10 - 15 דקות יכולה להיות גם מועילה.
בבטחה להיפטר הפסולת הביולוגית פעם טיהור שפכים ביולוגיים באקונומיקת 10% תושלם לאחר 24 שעות.

5. ריבוי בתרבית תאים

הערה: תאי גידול בדרך כלל גדלו במהירות תאי תאי דם לבנים שנמצאים בשפע בשילוב המקורי של תאי זרע לתוך הצלחת. בעקבות שינוי חוזר ונשנה של מדיום, והמעברים הבאים של CTCs, כל תאי הדם הלבנים יוסרו ואוכלוסייה טהורה יחסית של CTCs נשארה.

לאחרהשלכת supernatant לתוך 10% אקונומיקה, לשטוף את הכדור לבנבן ב1 נאגר מלוח פוספט מיליליטר (PBS) לפחות פעם אחת, וגלול במדיום התרבות השלם לריבוי בתרבית תאים.
ברגע לשטוף הושלם, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום מלא BNL 1ME תרבות A.7R.1 (חום 10% מומת FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו2 מ"מ L-גלוטמין) לגלולה וresuspend גלולה במדיום התרבות.
זרעי תערובת resuspended של תאים לתוך צלחת תרבית תאים. דגירה צלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם האוויר ו 5% CO _2.
לשנות את מדיום תרבית תאים בכל יומיים-שלושה. לאחר חמישה עד שבעה ימים, CTCs יהיה דבק בצלחת תרבית תאים והתחיל מתרבים. תאים אלה יישארו קיימא מעבר 25 קטעים ואחרי מחזורי הקפאה להפשרה חוזרים ונשנים ^5.

6. אימות של Hepatocellular Carcinoma מחזור קו תאים סרטניים

בצע APolymerase תגובת שרשרת שיטה מבוססת (PCR), כדי להגביר קטע DNA ספציפי אחד של גן העכבר β-גלובין כדי לאשר שהרומן הוקם שורות תאי CTC הן תאי עכבר כמו הקו המקורי המושתל BNL 1ME A.7R.1 HCC. שיטה שתוארה במקור ומאומתים על ידי Steube et al. ^5,8
בצע immunostaining לאלמנט התגובה cAMP סמן hepatocyte הספציפי מחייב חלבון 3 כמו-3 (CREB3L3) באמצעות נוגדן ספציפי. זה יאשר שהרומן CTCs הוקם אכן hepatocytes כמו קו התא המקורי המושתל BNL 1ME A.7R.1. ⁵

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המתודולוגיה שתוארה כאן הוכיחה כי יכול להיות מבודד CTCs. עכברים מורדמים אנושיים בנקודת סיום ניסוי. מחנק התהליך מעורב פחמן דו חמצני, exsanguination פנים-לב, ונקע בצוואר הרחם. סכמטי של שלבים העיקריים של ההליך הם באיור 2. דגימות דם כל שנאספו על ידי exsanguination פנים-לב עובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל. לאחר ש, צנטריפוגה שימשה כדי לקבוע את שכבת מעיל באפי שהיה נתון לתמוגה RBC. זה היה לאחר מכן על ידי צנטריפוגה צעד אחר לאסוף גלולה לבנבן שנשטפה ב- PBS, וresuspended במדיום תרבית תאים מלא לריבוי בתרבית תאים. בעיה שעלולה לבוא היא שהגלולה שהושגה לא יכולה להיות ברורה בצבע. בעיה זו ניתן לפתור בקלות על ידי שינוי זמן הדגירה במאגר תמוגה RBC על ידי הגדלתו עד 10 - 15 דקות, או אולי על ידי ביצוע פעמים נוספות זה.נציג תמונות של CTCs שמופצות בתרבות משלושה עכברים שונים מוצגים באיור 1, בהשוואה לתאי A.7R.1 BNL 1ME. התפשטות ומורפולוגיה מהירות יעזרו לזהות אם תאים שנזרעו הם CTCs. עם זאת, טכניקות אימות כגון PCR וimmunostaining המתוארים בצעדים 5.1 - נדרשות 5.2 כדי לאשר את הקמת קו CTC קיימא.

איור 1. ריבוי תאים סרטניים במחזור (CTCs) בתרבית תאים ממודל העכבר orthotopic syngeneic של Hepatocellular Carcinoma גרורה. תאים היו מופצים בתרבות מנות תא x 60 מ"מ 15 מ"מ במדיום תרבות BNL 1ME A.7R.1. תאים סרטניים מתרבים דבקו צלחת ומוצגים משלושה עכברים נפרדים. תאים סרטניים שנותרו קיימא דרך מעברים רציפים. תמונה בניגוד שלב של CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 וCTCOLUF2419 נלקחו ב40X הגדלה (עדשה אובייקטיבית) בהשוואה לתאי BNL 1ME A.7R.1 (הגדלת 40X). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 2. סכמטי של ההליך של בידוד והפצת מחזור תאים סרטניים ממערכת מודל העכברי של הסרטן. כאשר ראיות קליניות של קרצינומה hepatocellular נצפו כהפחתה משמעותית בציון מצב גוף, כל הדם נאסף מעכברים. לאחר כמה centrifugations, תמוגה RBC, וכמה צעדים לשטוף, CTCs היה זרע לתוך תרבות מנות תא להתפשטות. התפשטות תאי גידול נצפתה לאחר כמה ימים. אנא לחץ עליומחדש כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin Sodium Salt 1 g	VWR	89508-852
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml pyrogen-free eppendorf Tubes
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Needle
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack	VWR	BD309659	1 ml syringe tip
Syringe 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	1 ml syringe
VWR Forceps Tissue 6	VWR	82027-446	Forceps
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Cover Glass
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Slide Box
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	PAP pen
Water RNASe and DNAse free 2 L	VWR	101454-204	Nuclease Free Water
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris Buffer
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Ammonium Chloride Buffer
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene	VWR	353002	Tissue Culture Dish
Clorox Germicidal Bleach, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells
Fetal Bovine Serum	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Penicillin Streptomycin
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	13,000 rpm Centrifuge