Protocol
О себе Этика: Все исследования на животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) в Хантер-колледже из Городского университета Нью-Йорке.
1. Предварительно эксперимент процедуры
- По прибытии на объект животного, первоначально дом 3 линии BALB / C мышей в клетке с фильтрованной верхней и щепы постельные принадлежности. Убедитесь, что мыши имеют свободный доступ к пище, Purina грызунов и воды. Постельное белье и еда должна быть изменена два раза в неделю, пока клетки должны быть очищены один раз в неделю.
- Вызвать общую анестезию на мышах с использованием изофлуран испаритель вместе с кислородом при постоянной скорости потока 1 л в минуту. Система самостоятельной и включает в себя точность испаритель.
- Позиция животных в пластиковой коробке, которая имеет точность испаритель и газа / обезболивающий систему, связанную с ним. Первоначально установлен испаритель до 2,5 до животное не находится в бессознательном состоянии, в котором точка снизить испарителя до 2.
- В то время, переключитьклапан на линии, уплотнения его в коробку и открытии его в носовом конусе.
- Перемещение животное в области подготовки, с носовой конус расположен правильно и подключен (для обслуживания анестезии).
- Подготовьте 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши ГЦК клетки для имплантации в мышь. BNL 1ME A.7R.1 следует росли в среде (10% инактивированной нагреванием FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) инкубирование клеток в культуральной чашке при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с воздуха и 5% СО 2.
- С шприц, имеющий 20 G иглу, имплантаты 100 мкл PBS, содержащие 5 х 10 6 BNL 1ME A.7R.1 мыши гепатоцеллюлярной карциномы клеток в доле печени BALB / с мышей, чтобы произвести первичные опухоли. После имплантации, дом BALB / с мышей в клетке с теми же требованиями, как дома предварительной имплантации.
- В экспериментальной конечной точки, клинические признаки гепатоцеллюлярной карциномы наблюдается в значительному снижению состояния организмаоценка (обычно обнаруживается после 4 недель). В этот момент, существует вероятность того, что первичные опухоли были разработаны в печени, а метастатические отложениях в легких. После начала процесса выделения и распространения циркулирующих опухолевых клеток.
2. Сбор цельной крови для циркулирующих опухолевых клеток изоляции
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно продезинфицировать область хирургии и убедитесь, что это беспорядок бесплатно. Автоклав все хирургические инструменты или понежиться в качестве дезинфицирующего средства в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя
- Жертвоприношение мышей гуманными эвтаназии при экспериментальном конечной точки (клинические признаки развития опухоли). Euthanization мышей следует привлекать СО 2 удушья. Соблюдайте мышей правильно, чтобы подтвердить анестезии правильно распределены. Двуокись углерода должна быть выпущена медленно в камере в течение определенного периода 5 - 10 мин, в результате чего остановку дыхания. Следуйте внутрисердечной обескровливания и cervicаль дислокации. 5
- Использование 25 г иглу, прикрепленную к 1 мл шприца для сбора цельной крови. Heparanize шприц с 0,01 мл гепарина. Прокол кожи сразу с иглой уступает xyphisternum примерно под углом 45 °. Авансовые иглу медленно, чтобы проколоть сердце, а затем опустите угол иглы. Неуклонно проводить иглу и шприц на месте, и вытянуть 500 мкл - 1000 мкл цельной крови из сердца.
- Извлеките шприц и иглу и передачи кровь в предварительно меченных 1,5 мл апирогенной трубки. Центрифуга цельной крови в 1,5 мл апирогенной трубки при 1167 х г в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: центрифугирования отделяет всего образца крови в три слоя: нижний и гематокрита слой, состоящий из красных кровяных клеток, промежуточного тонкого слоя светлого сгустка крови, и верхний слой плазмы. - Удалить плазму тщательно с помощью пипетки и сбора его в отдельном 1,5 мл апирогенной трубки для FurthER эксперименты, такие как обнаружение бесклеточных нуклеиновых кислот. 7
- Для выделения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), собирают слой светлого сгустка крови в отдельную 1,5 мл апирогенной трубки при подготовке к эритроцитов (RBC) лизиса. Это необходимо для удаления остаточных эритроцитов в Баффи пальто слоя.
3. Рецепт для красных кровяных телец (эритроцитов) буфера для лизиса
- Сделайте 1 л раствора РБК буфера для лизиса.
- Сделать 500 мл раствора хлористого аммония и 500 мл Трис. Затем смешать, чтобы создать 1 л раствора буфера для лизиса эритроцитов с конечной концентрацией 155 мМ хлорида аммония и 10 мМ Трис.
- Буфер раствора до рН 7,5. Храните буфера для лизиса эритроцитов при от +2 до +8 ° C, и довести до комнатной температуры непосредственно перед использованием.
4. РБК Лизис Баффи пальто
- Добавить 1 мл буфера для лизиса эритроцитов в стерильной апирогенной 1,5 мл пробирку, содержащую собранную поглощающее покрытие.
- Смешайте содержимое пробирки с помощьюинвертирующий несколько раз. Выдержите смешанной содержимое пробирки в течение 5 мин при комнатной температуре на скамейке. Центрифуга смешанные содержимое в течение 5 мин при 1167 х г.
- После центрифугирования осадок беловато будут получены. Откажитесь от красновато супернатант медленно и осторожно в 10% отбеливателя без каких-либо сбоев в гранулы. Если осадок не беловатый, повторно выполните шаги 3.1 - 3.5. Увеличение времени инкубации в буфере для лизиса эритроцитов до 10 - 15 мин и может быть полезным.
- Безопасное распоряжаться биологические отходы сразу обеззараживания биологических отходов в 10% отбеливателя полный после 24 часов.
5. Распространение в клеточной культуре
Примечание: Опухолевые клетки, как правило, быстро растущие клетки лейкоциты, которые в изобилии в исходной смеси клеток, посеянных на блюдо. После повторного изменения среды, и последующих проходов ЦОК, все белые клетки крови удаляются и относительно чистой население ЦОК остается.
- Послеотбрасывая супернатант в 10% хлорной, мыть беловатый осадок в 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), по крайней мере один раз, и ресуспендируют в полной культуральной среде для распространения в клеточной культуре.
- После промывки завершена, добавляют 1 мл полной BNL 1ME A.7R.1 культуральной среде (10% инактивированной нагреванием FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) к осадку и ресуспендируют осадок в культуральной среде.
- Семенной ресуспендированные смесь клеток в культуре клеток блюдо. Инкубируйте клеточной культуры блюдо при 37 ° С в увлажненном инкубаторе с воздуха и 5% CO 2.
- Изменить среду для культивирования клеток каждые два-три дня. После пяти до семи дней, ЦОК будет присоединились к клеточной культуры блюдо и начал пролиферирующих. Эти клетки остаются жизнеспособными за 25 проходов и после повторных циклов замораживания и оттаивания 5.
6. Проверка гепатоцеллюлярной карциномы циркулирующих опухолевых клеток линии
- Выполните APolymerase цепной реакции (ПЦР) основе метода, чтобы усилить только один конкретный сегмент ДНК мыши β-глобина гена, чтобы подтвердить, что роман создан клеточные линии СТС являются клетки мыши, как в оригинальной имплантированного BNL 1ME A.7R.1 HCC линии. Метод был впервые описан и подтверждено Steube др. 5,8
- Выполнение иммунного окрашивания для гепатоцитов-специфическим маркером цАМФ реагировать элемент связывающего белка 3-3 (как CREB3L3) с помощью специфического антитела. Это подтвердит, что роман, установленные ЦОК действительно гепатоцитов, как в оригинальной имплантированного клеточной линии BNL 1ME A.7R.1. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Методика описана здесь показал, что ЦОК может быть выделен. Мышей умерщвляли гуманным в экспериментальной конечной точки. Этот процесс предполагает углерода диоксида удушье, внутри сердца обескровливание и шейки дислокации. Схема основных этапов процедуры, показаны на рисунке 2. Образцы цельной крови с помощью внутри сердечной обескровливания были обработаны с использованием протокола, описанного выше. После чего, центрифугирование используется для определения слой лейкоцитарной пленки, которые подвергали лизису эритроцитов. Затем полученную смесь затем еще стадии центрифугирования для сбора беловатый осадок, который промывают PBS и ресуспендировали в полной среде для культивирования клеток для размножения в культуре клеток. Вопрос, который может придумать, что осадок, полученный может быть неясно, в цвете. Эта проблема может быть легко решена путем изменения времени инкубации в буфере для лизиса эритроцитов за счет увеличения его до 10 - 15 мин, или, возможно, путем выполнения его раза.Типичные изображения ЦОК распространятся в культуре из трех различных мышей показано на рисунке 1, по сравнению с BNL 1ME A.7R.1 клеток. Быстрое распространение и морфология поможет определить, если клетки высевали в ЦОК. Тем не менее, методы проверки, такие как ПЦР и иммунного окрашивания, описанные в шагах 5.1 - 5.2, чтобы подтвердить создание жизнеспособного линии СТС.
Рисунок 1. Распространение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в культуре клеток из Ортотопическая Сингенные мышиной модели гепатоцеллюлярной карциномы Клетки размножали в 15 мм х 60 мм чашки для культивирования клеток в BNL 1ME A.7R.1 культуральной среде Метастазы.. Пролиферирующие опухолевые клетки придерживался блюдо и показаны с трех разных мышей. Опухолевые клетки остаются жизнеспособными через непрерывных пассажей. Фазового контраста изображения CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 и CTCOLUF2419 были приняты на 40-кратном увеличении (Объектив) по сравнению с BNL 1ME A.7R.1 клеток (40-кратном увеличении). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Схема процедуры выделения и распространяющихся циркулирующих опухолевых клеток от рака мыши модельной системы. При клинических признаков гепатоцеллюлярной карциномы наблюдалось значительного снижения оценка состояния тела, цельной крови брали из мышей. После нескольких центрифугирования, РБК лизиса, и несколько стадий промывки, то ЦОК высевали в чашки для культивирования клеток для размножения. Пролиферации опухолевых клеток наблюдалось после нескольких дней. Пожалуйста, нажмите онповторно, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Salt 1 g | VWR | 89508-852 | |
| BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS | VWR | 89511-254 | 1.5 ml pyrogen-free eppendorf Tubes |
| Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in | VWR | BD305125 | 25 G Needle |
| Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack | VWR | BD309659 | 1 ml syringe tip |
| Syringe 1 ml leur lok Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml syringe |
| VWR Forceps Tissue 6 | VWR | 82027-446 | Forceps |
| Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
| Cryo-oct compund 4 oz | VWR | 25608-930 | Oct compound |
| VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 | VWR | 48311-703 | Slides |
| VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | Cover Glass |
| VWR Slide Box True North Fm Pu | VWR | 89140-278 | Slide Box |
| Super HT PAP Pen | VWR | 89427-058 | PAP pen |
| Water RNASe and DNAse free 2 L | VWR | 101454-204 | Nuclease Free Water |
| Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g | VWR | 97061-796 | Tris Buffer |
| Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg | VWR | 97062-048 | Ammonium Chloride Buffer |
| Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene | VWR | 353002 | Tissue Culture Dish |
| Clorox Germicidal Bleach, Regular | VWR | 89501-620 | Clorox Bleach |
| PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml) | Thermo Fischer Scientific | 21-040-CV | PBS, 1x |
| DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 10-017-CV | DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer Scientific | 35-010-CV | FBS |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Thermo Fischer Scientific | 30-002-Cl | Penicillin Streptomycin |
| Sorvall Biofuge pico | Thermo Fischer Scientific | 75002411 | 13,000 rpm Centrifuge |
References
- Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
- van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future. Cancers. 6, 1195-1207 (2014).
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
- George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS one. 8, e63765 (2013).
- Cheng, B., et al. Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture. International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
- Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction. Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).
- Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S.
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).
- Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).
- De Giorgi, U., et al. Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).
- Eloubeidi, M. A., et al. Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications. The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).
- O'Toole, D., et al. Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration. Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).
