Protocol
הצהרת אתיקה: כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) של האנטר קולג 'של האוניברסיטה של העיר ניו יורק.
1. נהלים טרום ניסוי
- עם ההגעה למתקן בעלי החיים, בתחילה בית 3 עכברי BALB / ג לכלוב עם מצעים העליונים ועץ שבב מסונן. ודא שיש לי העכברים גישה חופשית למזון, אוכל מכרסם פורינה, ומים. מצעים ומזון צריכים להיות מוחלפים פעמיים בשבוע בזמן שיש לנקות כלובי פעם בשבוע.
- לגרום להרדמה כללית בעכברים באמצעות מכשיר אדים isoflurane יחד עם חמצן בקצב זרימה קבוע של 1 ליטר לדקה. המערכת היא עצמאית וכוללת מאדה דיוק.
- בעלי החיים מיקום בקופסא פלסטיק שיש מאדה הדיוק וגז / מערכת הרדמה המחוברת אליו. בתחילה להגדיר את מאדה 2.5 עד בעלי החיים הוא חסרי הכרה, ובשלב זה להפחית את האידוי 2.
- באותו זמן, לעבורקו שסתום, איטום אותו לתיבה ולפתוח אותו לחרטום.
- הזז את בעלי החיים לאזור ההכנה, עם החרטום ממוקם כראוי ומחובר (להרדמת תחזוקה).
- הכן 5 × 10 6 תאי HCC עכבר BNL 1ME A.7R.1 להשתלה לכל עכבר. BNL 1ME A.7R.1 צריך להיות גדל במדיום (10% חום מומת FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 מ"מ L- גלוטמין) דוגרים בצלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם אוויר ו -5% CO 2.
- עם מזרק שיש 20 מחט G, של PBS 100 μl השתל המכיל 5 x 10 6 תאים קרצינומה hepatocellular עכבר BNL 1ME A.7R.1 לאונה של הכבד של עכברים / ג BALB לייצר גידולים הראשוניים. לאחר השתלה, בית העכברים / ג BALB בכלוב עם אותן דרישות הבית כטרום השרשה.
- בנקודת סיום הניסוי, עדות קלינית של קרצינומה hepatocellular היא נצפית כירידה משמעותית במצב גוףציון (בדרך כלל מזוהה לאחר 4 שבועות). בשלב זה, יש סיכוי שגידולים ראשוניים פיתחו בכבד ואילו פיקדונות גרורתי יצרו את הריאות. לאחר מכן, להתחיל התהליך של הבידוד והתפשטות תאים סרטניים במחזור.
2. אוסף של דם מלא למחזור בידוד תאים סרטניים
הערה: כראוי מחוטאת אזור הניתוח ולוודא שהוא נטול עומס. החיטוי כל מכשירי הניתוח או לטבול בחומר חיטוי בהתאם להמלצת יצרן
- להקריב עכברים על ידי המתת חסד הומנית בנקודת סיום ניסוי (עדות קלינית של התפתחות גידולים). מתת חסד של עכברים צריכה לערב CO 2 מחנק. שים לב לעכברים כראוי כדי לאשר הרדמה מופץ בצורה נכונה. פחמן דו חמצני יש לשחרר באיטיות לתוך התא על פני תקופה של 5 - 10 דקות, גורמים לדום נשימה. עקוב ידי exsanguination וcervic intracardiacאל עקירה. 5
- שימוש במחט 25 G מצורפת מזרק 1 מיליליטר לאוסף של כל דם. Heparanize המזרק עם 0.01 מיליליטר הפרין. עור לנקב מייד עם המחט נחותה xyphisternum הזווית של 45 מעלות בכ. קידום מחט לאט לנקב את הלב, ואז להנמיך את הזווית של המחט. הולך ומתפשט המחט ומזרק במקום, ולצייר את 500 μl - 1,000 μl של כל דם מהלב.
- הסר את המזרק ומחט ולהעביר את הדם לתוך צינור ללא pyrogen 1.5 מיליליטר שכותרתו מראש. צנטריפוגה כל הדם שנאסף לתוך 1.5 מיליליטר צינור ללא pyrogen ב1,167 XG במשך 5 דקות.
הערה: צנטריפוגה שמפריד בין כל דגימת הדם לשלוש שכבות: השכבה התחתונה או המטוקריט המורכב מתאי דם אדומים, שכבת ביניים דקה של מעיל באפי, ושכבה עליונה פלזמה. - הסר את הפלזמה בקפידה על ידי pipetting ואיסוף אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר pyrogen ללא נפרד לפירטניסויים אה כגון זיהוי של חומצות גרעין תא ללא 7.
- לבידוד של תאי גידול במחזור (CTCs), לאסוף את המעיל באפי לתוך צינור ללא pyrogen נפרד 1.5 מיליליטר בהכנה לתאי דם אדומים תמוגה (RBC). זה הכרחי כדי להסיר RBCs שייר בשכבת המעיל באפי.
3. מתכון לתאי דם אדומים (RBC) תמוגה מאגר
- הפוך פתרון 1 ליטר של חיץ תמוגה RBC.
- הפוך 500 מיליליטר של אמוניום כלוריד ו -500 מיליליטר של טריס. אז לערבב כדי ליצור פתרון 1 ליטר של חיץ תמוגה RBC עם ריכוז סופי של 155 מ"מ של אמוניום כלוריד ו -10 מ"מ של טריס.
- חיץ הפתרון לpH של 7.5. אחסן את מאגר תמוגה RBC ב2-8 מעלות צלזיוס, ולהביא לRT מייד לפני שימוש.
4. RBC תמוגה של מעיל באפי
- הוסף 1 מיליליטר של חיץ תמוגה RBC לצינור 1.5 מיליליטר סטרילי ללא pyrogen מכיל מעיל באפי שנאסף.
- מערבבים את התוכן של הצינור על ידיהיפוך מספר רב של פעמים. דגירה התוכן מעורב של הצינור במשך 5 דקות ב RT על הספסל. צנטריפוגה התוכן המעורב במשך 5 דקות ב1,167 x גרם.
- לאחר צנטריפוגה, תתקבל גלולה לבנבן. בטל supernatant האדמדם לאט ובזהירות לאקונומיקה 10% ללא כל הפרעה לגלולה. אם גלולה היא לא לבנבן, מחדש לעשות צעדים 3.1-3.5. הגדלת זמן הדגירה במאגר תמוגה RBC עד 10 - 15 דקות יכולה להיות גם מועילה.
- בבטחה להיפטר הפסולת הביולוגית פעם טיהור שפכים ביולוגיים באקונומיקת 10% תושלם לאחר 24 שעות.
5. ריבוי בתרבית תאים
הערה: תאי גידול בדרך כלל גדלו במהירות תאי תאי דם לבנים שנמצאים בשפע בשילוב המקורי של תאי זרע לתוך הצלחת. בעקבות שינוי חוזר ונשנה של מדיום, והמעברים הבאים של CTCs, כל תאי הדם הלבנים יוסרו ואוכלוסייה טהורה יחסית של CTCs נשארה.
- לאחרהשלכת supernatant לתוך 10% אקונומיקה, לשטוף את הכדור לבנבן ב1 נאגר מלוח פוספט מיליליטר (PBS) לפחות פעם אחת, וגלול במדיום התרבות השלם לריבוי בתרבית תאים.
- ברגע לשטוף הושלם, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום מלא BNL 1ME תרבות A.7R.1 (חום 10% מומת FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו2 מ"מ L-גלוטמין) לגלולה וresuspend גלולה במדיום התרבות.
- זרעי תערובת resuspended של תאים לתוך צלחת תרבית תאים. דגירה צלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם האוויר ו 5% CO 2.
- לשנות את מדיום תרבית תאים בכל יומיים-שלושה. לאחר חמישה עד שבעה ימים, CTCs יהיה דבק בצלחת תרבית תאים והתחיל מתרבים. תאים אלה יישארו קיימא מעבר 25 קטעים ואחרי מחזורי הקפאה להפשרה חוזרים ונשנים 5.
6. אימות של Hepatocellular Carcinoma מחזור קו תאים סרטניים
- בצע APolymerase תגובת שרשרת שיטה מבוססת (PCR), כדי להגביר קטע DNA ספציפי אחד של גן העכבר β-גלובין כדי לאשר שהרומן הוקם שורות תאי CTC הן תאי עכבר כמו הקו המקורי המושתל BNL 1ME A.7R.1 HCC. שיטה שתוארה במקור ומאומתים על ידי Steube et al. 5,8
- בצע immunostaining לאלמנט התגובה cAMP סמן hepatocyte הספציפי מחייב חלבון 3 כמו-3 (CREB3L3) באמצעות נוגדן ספציפי. זה יאשר שהרומן CTCs הוקם אכן hepatocytes כמו קו התא המקורי המושתל BNL 1ME A.7R.1. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המתודולוגיה שתוארה כאן הוכיחה כי יכול להיות מבודד CTCs. עכברים מורדמים אנושיים בנקודת סיום ניסוי. מחנק התהליך מעורב פחמן דו חמצני, exsanguination פנים-לב, ונקע בצוואר הרחם. סכמטי של שלבים העיקריים של ההליך הם באיור 2. דגימות דם כל שנאספו על ידי exsanguination פנים-לב עובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל. לאחר ש, צנטריפוגה שימשה כדי לקבוע את שכבת מעיל באפי שהיה נתון לתמוגה RBC. זה היה לאחר מכן על ידי צנטריפוגה צעד אחר לאסוף גלולה לבנבן שנשטפה ב- PBS, וresuspended במדיום תרבית תאים מלא לריבוי בתרבית תאים. בעיה שעלולה לבוא היא שהגלולה שהושגה לא יכולה להיות ברורה בצבע. בעיה זו ניתן לפתור בקלות על ידי שינוי זמן הדגירה במאגר תמוגה RBC על ידי הגדלתו עד 10 - 15 דקות, או אולי על ידי ביצוע פעמים נוספות זה.נציג תמונות של CTCs שמופצות בתרבות משלושה עכברים שונים מוצגים באיור 1, בהשוואה לתאי A.7R.1 BNL 1ME. התפשטות ומורפולוגיה מהירות יעזרו לזהות אם תאים שנזרעו הם CTCs. עם זאת, טכניקות אימות כגון PCR וimmunostaining המתוארים בצעדים 5.1 - נדרשות 5.2 כדי לאשר את הקמת קו CTC קיימא.
איור 1. ריבוי תאים סרטניים במחזור (CTCs) בתרבית תאים ממודל העכבר orthotopic syngeneic של Hepatocellular Carcinoma גרורה. תאים היו מופצים בתרבות מנות תא x 60 מ"מ 15 מ"מ במדיום תרבות BNL 1ME A.7R.1. תאים סרטניים מתרבים דבקו צלחת ומוצגים משלושה עכברים נפרדים. תאים סרטניים שנותרו קיימא דרך מעברים רציפים. תמונה בניגוד שלב של CTCOL1MEA081211, CTCOL1MEACTC082911 וCTCOLUF2419 נלקחו ב40X הגדלה (עדשה אובייקטיבית) בהשוואה לתאי BNL 1ME A.7R.1 (הגדלת 40X). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. סכמטי של ההליך של בידוד והפצת מחזור תאים סרטניים ממערכת מודל העכברי של הסרטן. כאשר ראיות קליניות של קרצינומה hepatocellular נצפו כהפחתה משמעותית בציון מצב גוף, כל הדם נאסף מעכברים. לאחר כמה centrifugations, תמוגה RBC, וכמה צעדים לשטוף, CTCs היה זרע לתוך תרבות מנות תא להתפשטות. התפשטות תאי גידול נצפתה לאחר כמה ימים. אנא לחץ עליומחדש כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Heparin Sodium Salt 1 g | VWR | 89508-852 | |
BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS | VWR | 89511-254 | 1.5 ml pyrogen-free eppendorf Tubes |
Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in | VWR | BD305125 | 25 G Needle |
Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack | VWR | BD309659 | 1 ml syringe tip |
Syringe 1 ml leur lok Pk 100 | VWR | BD309628 | 1 ml syringe |
VWR Forceps Tissue 6 | VWR | 82027-446 | Forceps |
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100 | VWR | 25608-924 | Cyromold |
Cryo-oct compund 4 oz | VWR | 25608-930 | Oct compound |
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72 | VWR | 48311-703 | Slides |
VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm | VWR | 48-382-128 | Cover Glass |
VWR Slide Box True North Fm Pu | VWR | 89140-278 | Slide Box |
Super HT PAP Pen | VWR | 89427-058 | PAP pen |
Water RNASe and DNAse free 2 L | VWR | 101454-204 | Nuclease Free Water |
Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g | VWR | 97061-796 | Tris Buffer |
Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg | VWR | 97062-048 | Ammonium Chloride Buffer |
Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene | VWR | 353002 | Tissue Culture Dish |
Clorox Germicidal Bleach, Regular | VWR | 89501-620 | Clorox Bleach |
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium & magnesium (500 ml) | Thermo Fischer Scientific | 21-040-CV | PBS, 1x |
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose & L-glutamine without sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 10-017-CV | DMEM 1x media for BNL 1ME A.7R.1 cells |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer Scientific | 35-010-CV | FBS |
Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Thermo Fischer Scientific | 30-002-Cl | Penicillin Streptomycin |
Sorvall Biofuge pico | Thermo Fischer Scientific | 75002411 | 13,000 rpm Centrifuge |
References
- Ashworth, T. R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death. Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).
- van de Stolpe, A., den Toonder, J. Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future. Cancers. 6, 1195-1207 (2014).
- Sheng, W., et al. Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).
- George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. "Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer. Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).
- Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma. PloS one. 8, e63765 (2013).
- Cheng, B., et al. Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture. International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).
- Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction. Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).
- Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S.
Cancer micrometastases. Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009). - Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).
- Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).
- De Giorgi, U., et al. Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).
- Eloubeidi, M. A., et al. Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications. The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).
- O'Toole, D., et al. Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration. Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).