Protocol
Les protocoles et l'utilisation des animaux de laboratoire ont été approuvés par les soins des animaux et de l'utilisation des comités institutionnels de l'Université de Yamanashi et de l'Université de Waseda. soins aux animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles.
1. Préparation CPEC
- Préparer des appareils et des matériaux suivants: un microscope stéréo, de préférence capable de transmettre l'illumination du fond; une paire de pinces horloger (Dumont N ° 3 ou n ° 4), la flamme stérilisé, des ciseaux d'exploitation droites, flamme stérilisé; deux plats 10 cm en plastique stériles contenant 20 ml glacée moyen Leibovitz L-15; Plats à fond de verre de 35 mm contenant 2 ml RT Leibovitz milieu L-15; un bêcher de 100 ml contenant 70% d'éthanol; souriceaux nouveau-nés.
- Immerger brièvement une souris néonatale dans 70% d'éthanol et euthanasier rapidement par décapitation en utilisant les ciseaux d'exploitation.
- Placez la tête immédiatement Leibovitz milieu L-15 glacée dans le stérile à 10 cm dish.
- Retirer la peau des calvaria utilisant la paire de forceps horloger, ouvrir le crâne pour exposer le cerveau, et puis couper les nerfs crâniens pour isoler l'ensemble du cerveau.
- Transférer le cerveau à un nouveau plat contenant Leibovitz milieu L-15 glacée et observer au microscope stéréo, faire en sorte que le cerveau est complètement immergé dans le milieu.
- Réglez la face dorsale du cerveau vers le haut, et d'orienter le cerveau de sorte que les bulbes olfactifs résident à la position trois heures (pour les droitiers). Maintenez le cerveau en douceur avec la pince à la main gauche.
- En utilisant les pinces à dissection fines (Dumont N ° 3 ou # 4) dans la main droite, couper le corps calleux et sous le parenchyme reliant les hémisphères cérébraux, le long de la fissure longitudinale du cerveau.
- Poussez doucement les hémisphères cérébraux loin aux côtés latéraux et d'exposer la fissure transversale cérébrale.
- Séparer les hémisphères par pincement sur the parenchyme entre l'hémisphère et le thalamus.
- Tirez doucement sur le plexus choroïde ventriculaires latérales qui est attaché à la face latérale de l'hippocampe par le affixa lamina.
- Transférer les plexus choroïde isolés au plat à fond de verre de 35 mm contenant du milieu frais Leibovitz L-15, et superposer un poids (liste des matières) doucement pour maintenir le tissu en place.
2. imagerie en direct de CPEC Cilia
- Confirmez ultraviolet bon (UV) et le filtre (s) déduit (IR) de coupe pour bloquer la lumière inférieure à 400 nm et plus de 700 nm, et que la densité neutre (ND) filtres (25% et 6%) sont insérés dans le trajet de la lumière du microscope inversé.
- Régler la netteté de l'objectif plus ou moins à l'oeil, et ensuite ajuster le condenseur afin que le centre et le foyer pour se conformer à l'éclairage de Köhler. Insérer un contraste interférentiel différentiel approprié (DIC) prisme, un élément DIC, ainsi que des éléments de l'analyseur et le polariseur dans le lichemin lutte pour se conformer à l'optique DIC.
- Régler le contraste de vue par la position du prisme DIC sorte que la structure de la surface du tissu est plus reconnaissable. Si tous les cils des cellules cibles sont mobiles, une vision claire des cils mobiles ne peut pas être obtenue par l'œil en raison de leur mouvement.
- Modifiez le chemin de lumière à la caméra vidéo, et de supprimer les filtres ND pour augmenter la puissance lumineuse.
- Utilisez l'appareil photo en mode de mise au point de régler le champ de vision et de concentration. Au cours de mise au point, dans lequel les images vidéo sont affichées en temps réel sur l'écran, une vue claire des cils mobiles ne sont pas disponibles.
- Utilisez l'appareil photo à 200 Hz avec un temps d'exposition de 0,1 ms pour la période souhaitée (secondes à quelques minutes). Après l'acquisition de la pile de l'image, des images uniques seront afficher structures ciliaires claires. Si bords ciliaires sont floues, d'augmenter le taux de trame ou utiliser un temps d'exposition plus courte.
- Enregistrer le mouvement de CPEC cils au sein 25-60 minutes après l'euthanasie en LeibovitzMilieu L-15.
3. Analyse du mouvement ciliaire
- Suivre manuellement battant motifs de chaque cil sur le moniteur de l'ordinateur. Marquer les positions de pointe ciliaire dans chaque image avec le pointeur de la souris, qui sont assemblés pour obtenir des informations trajectoire de chaque cil. Soit analyser les informations trajectoire en utilisant le même logiciel ou l'exportation vers d'autres applications plus générales pour une analyse plus approfondie. L'efficacité de cette étape d'analyse est décrite dans la discussion.
- Classer les trajectoires en deux modes de mouvement, de va-et-vient ou de rotation, par oeil.
- Calculer la fréquence ciliaire de battage (CBF) en utilisant la formule suivante: [CBF = (nombre d'images par seconde) / (nombre moyen d'images pour un seul battement)] 14, qui peut être obtenu à partir d'un schéma pointe ciliaire de mouvement (Figure 3 ). Répéter ce calcul pour de multiples cycles de battement ciliaire, parce que d'autres cils sur la même cellule peut interférer avec le mouvement de chaque cilium, ce qui entraîne l'irrégularité.
- Pour analyser l'uniformité angulaire du battement ciliaire axes dans une seule cellule, définir le θ de l'angle de battement pour chaque trajectoire (Figure 4). Pour trajectoires de va-et-vient, adapter les postes de la pointe des cils à une ligne droite, et de définir l'angle θ que la ligne fait avec axe x. Pour trajectoires de rotation, adapter les postes à une ellipse, et de définir l'angle θ que l'axe majeur de l'ellipse fait avec axe x. Détails de la ferrure sont décrits dans la section des résultats représentatifs.
- Pour une description quantitative de chaque trajectoire, calculer généralisée rapport d'aspect AR. En bref, la trajectoire de rotation - θ et AR définir comme étant le rapport entre la largeur de la distribution le long de x - y et -axes (figure 4B). Les détails sont affichés dans la section des résultats représentatifs, et l'interprétation, L'importance et la limitation du paramètre sont décrites dans la discussion.
4. Préparation d'échantillons pour MEB
Remarque: SEM est une méthode importante pour évaluer l'état des cils sur CPEC d'une manière globale. Pour préparer des échantillons pour SEM, une procédure standard précédemment rapporté 15 est employé avec de légères modifications.
- Avant la dissection du tissu du cerveau, préparer le fixateur dans un flacon en verre de 5 ml avec un bouchon en polyéthylène. Le fixateur est constitué de 2% de paraformaldehyde, 2,5% de glutaraldéhyde (moitié de la solution de 16 Karnovsky) dans 0,1 M de tampon phosphate, pH 7,4.
- Disséquer les tissus du cerveau, comme décrit dans l'étape 1.
- Rincer brièvement le tissu isolé avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans un nouveau plat, puis fixer le tissu dans le fixateur dans le flacon de verre pendant 1 heure à température ambiante. Utilisez pipettes de transfert unique et manipuler les spécimens gently. Après rinçage dans HBSS, le tissu devient collant.
- Pour transférer les échantillons dans la solution de fixateur, lentement expulser une petite quantité de solution contenant le tissu de la pipette de transfert en gouttelettes et ajouter au fixateur.
- Après fixation, jeter le fixateur et rincer le tissu avec tampon phosphate trois fois.
- Plonger le tissu dans une solution de saccharose à 10% pour se laver les aldéhydes restants. Pour assurer l'élimination complète des aldéhydes, plonger les échantillons dans la solution pendant 10 min, puis répéter deux fois avec des produits frais 10% de saccharose. Cette étape est importante pour parvenir à post-fixation correcte dans les étapes suivantes.
- Plonger le tissu dans une solution de 1% de tétroxyde d'osmium dans un tampon phosphate pendant 30 min, puis placer sur la glace pour la post-fixation. Juger du degré de osmification par la couleur de l'échantillon: quand aldéhydes sont complètement enlevés, l'échantillon est noir.
- Laver les échantillons de tissus postdéterminés abondamment avec double distilléed l'eau plusieurs fois.
- Déshydrater les échantillons par immersion dans des concentrations échelonnées d'éthanol, généralement 65%, 75%, 85%, 95%, 99% et 100%, pendant 10 minutes chaque. Obtenir de l'éthanol anhydre en plaçant des tamis moléculaires dans 99,5% d'éthanol à partir d'une bouteille nouvellement acheté. Répétez avec déshydratation de l'éthanol anhydre à trois reprises.
- Placer les échantillons déshydratés dans de l'acétate d'isoamyle, un réactif de substitution pour un séchage au point critique, pendant 10 min. Répéter deux fois cette étape. Ce réactif évapore rapidement et l'échantillon peut devenir sèche, provoquant la destruction par la tension de surface. Par conséquent, ne pas sécher l'échantillon complètement.
- Après le dernier échange de l'acétate d'isoamyle, enlever la plupart du solvant, immédiatement envelopper le flacon en verre ouvert avec du papier d'aluminium et placez le flacon sur glace sèche. En utilisant une aiguille ou une pince fine, faire plusieurs trous dans la feuille de recouvrement de l'embouchure de la fiole, de telle sorte que le dioxyde de carbone liquide coule facilement dans la fiole dans le sécheur à point critique. Passez à l'étape suivanteaussi vite que possible.
- Dans cette étape, minimiser le report de l'acétate d'isoamyle dans la chambre de la sécheuse, mais ne laissez pas l'échantillon sécher complètement avant séchage au point critique. En outre, ne pas laisser l'échantillon sur de la glace sèche pour une inutilement beaucoup de temps pour éviter la formation de givre sur le flacon.
- Transférer les flacons de verre papillote contenant les échantillons de tissus dans le sèche-linge au point critique qui assure la structure de la surface du tissu reste intact tandis que l'eau contenue dans l'élimination du tissu. Des informations détaillées sur le fonctionnement du sèche point critique peut être obtenu à partir des instructions du fabricant.
- Manipulez les échantillons soigneusement à l'aide d'un cure-dent pour minimiser les dommages mécaniques. Les échantillons de tissus séchées résultantes sont fragiles. Montez les échantillons sur les moignons métalliques et manteau avec de l'or-palladium en utilisant une pulvérisation d'ions.
5. observation par MEB
- Observez par SEM et enregistrer des images avec un appareil photo numériqueéquipé d'un microscope électronique à balayage.
- Transférer des données d'image numériques à un ordinateur pour analyse.
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Representative Results
Vue d'ensemble du flux de production est représenté sur la Figure 1, y compris les images des dispositifs.
Observations de mouvement direct de CPEC
Film 1 montre un film de CPEC isolés à partir d'une souris périnatale et Movie 2 montre une vue agrandie des images dans le film 1. Il convient de noter que des conseils individuels ciliaires sont moins claires dans les images fixes par rapport à ceux dans les films. La figure 2 montre suivi du mouvement de deux cils avec différents modes de mouvement, de va-et-vient et des mouvements de rotation, à partir des données présentées dans les films 1 et 2. Figure 3 montre une simple analyse des trajectoires des cils, dans lequel la différence de phase dans les deux coordonnées est évident dans le mouvement de rotation.
Analyse de CPEC pointe ciliaire trajectoires
De méthodes pour analyser quantitativement queue chaque trajectoire sont représentés sur la figure 4 avec des illustrations schématiques des définitions angle le battant de (A) et un organigramme de l'analyse des résultats représentatifs avec (B).
Pour définir l'angle θ battant pour les trajectoires de va-et-vient, adapter les postes de la pointe ciliaire au cours de plusieurs cycles pour une ligne droite y = ax + b, et de définir la direction de coups que celle le long de la ligne ajustée. Définir l'angle de battement ici comme θ = Arc tan. Parce raccord ligne échoue souvent à extraire la direction en cas de mouvement de rotation, être compatibles avec les trajectoires de rotation de l'ellipse, et définir la direction que celle le long de l'axe long de l'ellipse équipée. Plus précisément, les positions d'extrémité (X, Y) pendant de multiples cycles de battement sont équipés de la fonction ci-dessous.
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où 
Le montage de l'ellipse comporte cinq paramètres d'ajustement: x 0, y 0, a, b, et θ. Les coordonnées x et - -spatial y du centre de l'ellipse sont x 0 et y 0, respectivement. Les rayons majeur et mineur de l'ellipse sont a et b, respectivement. Angle θ est l'angle que fait l'axe principal de l'axe des x, ou l'angle de battement. Une représentation schématique de ces paramètres est affiché dans le panneau de droite de la figure 4A. La fixation est réalisée en utilisant le logiciel Igor Pro de la définition de la fonction explicite décrit ci-dessus. Puis, un histogramme de battre angle θ pour tous les cils observerd dans la même cellule est représentée sous forme d'histogramme circulaire (figure 2 dans Narita et al. 8). La fréquence est normalisée au nombre de conseils ciliaires analysés. Il est à noter que chaque cil est interprété comme ayant deux θ valeurs dans l'histogramme circulaire, par exemple π / 4 et 3π / 4, ce qui conduit à la répartition symétrique de la direction.
Pour définir généralisée rapport d'aspect AR, les positions de la pointe ciliaire au cours de plusieurs cycles sont tournés par - θ (figure 4B). Conformément à la rotation, à la fois en va-et-vient et de rotation trajectoires se répartir à peu près parallèlement à l'axe des x, dans lequel les largeurs de la distribution A et B, ainsi que les directions x et y des axes, respectivement, sont définies comme étant la moitié de la différence entre le minimum et le maximum. Par conséquent, ces paramètres ne sont plus pertinents pour les rayons majeur et mineur de l'ellipse, a et b. AR est alors défini comme le rapport entre A et B par AR = B / A.
Observations de l'épithélium du plexus choroïde par SEM
SEM permet l'observation de la structure des échantillons de surface fine. La présence des cils sur CPEC est confirmée tout au long de la durée du développement. L'apparition de franges sur CPECs multiple est observée par jour embryonnaire (E) 13, peu de temps après le développement du plexus choroïde commence dans les ventricules latéraux autour de E11. A ce stade, les cellules sont petites avec un aspect immature variable et les conseils ciliaires sont dirigées vers différentes directions. Au E15, une touffe de cils multiple est fondée sur le sommet de la surface apicale, qui sont debout sur des microvillosités environnantes. Au jour postnatal (P) 2, de nombreux cils sont fixés à une position courbée, reflétant la motilité ciliaire observé par imagerie en temps réel. À P14, la plupart des cellules possèdent plusieurs franges qui ne sont pas mobiles ainsi que des microvillosités w vec une texture plus fine par rapport aux étapes précédentes. La figure 5 montre des images MEB de CPECs de cils à ces étapes. Basé sur les films présentés dans la figure 1 et Movie 1, il est évident que les cils mobiles sont facilement reconnaissables par l'imagerie en direct. Cependant, il est difficile de distinguer les franges non mobile par microscopie DIC. Par conséquent, SEM est indispensable de comprendre les états généraux ciliaires.
Figure 1:. Vue d'ensemble du flux de travail (a) microscope stéréo. (B) microscope inversé équipé d'une caméra dispositif à couplage de charge (CCD). (C) l'écran de l'ordinateur lors de l'analyse. (D) par pulvérisation d'ions. (E) des échantillons pour les SEM. Microscope électronique (f) de numérisation.
Film 1.pload / 52991 / Figure_2.mov "target =" _ blank "> Film de la vue de dessus du CPEC et les cils d'un chiot P2 de la souris dans la vidéo microscopie à haute vitesse. En raison de la surface irrégulière du tissu du plexus choroïde, ce cliché contient . la fois de mise au point et les avions hors-focus La zone dans la boîte est développé et montré dans Movie 2 Barre d'échelle:. 2 um.
Film 2. Film de la vision élargie de l'échantillon de tissu dans Movie 1. Battre cils montré mouvements de rotation soit ou de va-et-vient. Barre d'échelle: 1 um.
Figure 2:. La reconstitution de la trajectoire du CPEC cils à partir des images de time-lapse dans Movie 2 (A) Cilia avec le mouvement de va-et-vient (en haut) et le mouvement de rotation (en bas). DIC images à partir des données des films sont présentés à 50 msec intervalles (1-8, bar de l'échelle: 1 um). La position de la pointe cible ciliaire est indiqué par une flèche. (B) Les trajectoires (ligne brisée) et les positions des conseils ciliaires (cercles colorés) montrés dans les images sont superposées.
Figure 3:. Deux modes de mouvement CPEC pointe ciliaire reconstitué à partir des données de films représentatifs des mouvements de pointe ciliaire, mouvement de va-et-vient (A) et le mouvement de rotation (B), sur plusieurs cycles sont présentés comme des trajectoires (en haut, barres d'échelle: 0,5 um). les temps de coordonnées y de la position de pointe x et y sont tracées, respectivement (au milieu). Pour démontrer un déphasage entre les deux coordonnées, coordonnées x et ont été normalisées à [-1,1] et superposées (en bas, lignes rouges et bleues, respectivement).
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Figure 4: des représentations schématiques décrivant l'analyse des trajectoires ciliaires pointe (A) Définitions de l'angle θ de coups pour le dos-et-vient (panneau de gauche) et de rotation (panneau de droite) trajectoires.. Paramètres dans la formule décrivant l'ellipse équipée, a, b, x 0 et y 0, sont présentés dans le panneau de droite. (B) Diagramme de l'analyse montage des trajectoires de définir le θ de l'angle de battement et AR. Les résultats réels de la mise en place des trajectoires représentatifs sont présentés dans les panneaux de droite.
Figure 5: image MEB des cils. Micrographies MEB représentatifs de CPEC à E13, E15, P2 et P14. Au cours du temps, CPEC ont augmenté en taille, et microvi développéslli et les cils à la surface apicale. Une touffe de cils au E13 est encore à acquérir la motilité. Au P2, lorsque le rapport des cils avec la motilité a atteint le point le plus élevé, de nombreux cils courbés sont observées. À P14, cils perdent la motilité. Barre d'échelle: 5 um.
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Discussion
Perspectives de cette méthode
Bien que la technique décrite ici ne prévoit pas une analyse plus détaillée des cils que les méthodes déjà publiées, la signification de cette technique réside dans la simplicité du système et l'efficacité des coûts, qui peut être facilement appliquée au dépistage tout type de motilité ciliaire ex vivo. En particulier, TI Workbench fournit une interface simple et conviviale qui permet aux chercheurs d'observer et d'analyser la motilité ciliaire plus facilement. Des méthodes efficaces de suivi automatisés ont pas été développé pour les objets de faible contraste tels que cils tache vidéo améliorée contraste DIC. Bien que la méthode pour suivre le mouvement ciliaire est manuel dans cette technique, la quantité d'effort dans ciliaire analyse de suivi de mouvement est optimale réduite par rapport à l'utilisation de paquets logiciels généraux de but pour l'analyse d'images.
Dissection échantillon
Pour préparer ex échantillons vivo CPEC, manipulations rapides et douces sont nécessaires pour préserver la viabilité des tissus, ce qui assure la motilité des cils ex vivo. Parce que la contamination par les érythrocytes brouille le champ d'observation, rinçage douce, mais complexe, le tissu disséqué avec un tampon phosphate salin est fortement recommandé. Pour éviter un saignement, il faut être prudent pour éviter de déchirer la choroïde postérieure artère qui peut être identifié comme une structure en forme de fil rouge éminent adhéré à la lamina affixa du plexus colloïde.
Microscope
Un microscope inversé équipé d'une optique DIC et une source de transmission de la lumière à haute puissance est essentiel pour cette méthode. Parce que les lampes à mercure sont généralement incapables de commutation fréquemment sous et hors tension, un obturateur devant le boîtier de lampe est nécessaire. Soit un obturateur manuel ou électrique peut être utilisé à cette fin. Pour protéger les spécimens et les yeux de l'observateur from lumière UV et IR, filtres optiques sont nécessaires pour permettre que la lumière visible (400-700 passe-bande ou une combinaison de filtres UV et coupées IR). Les filtres ND sont également nécessaire de modifier la puissance lumineuse qui diffère selon la situation: surveillance par les yeux, se concentrant avec une caméra vidéo, et de haute vitesse d'enregistrement time-lapse. Une lentille d'objectif ayant une ouverture numérique élevée est nécessaire pour une grande résolution. Il existe une certaine distance entre le sommet de la lamelle couvre-objet et le point focal du fait de la morphologie et de l'épaisseur du tissu. Par conséquent, un objectif à immersion dans l'eau plutôt que d'une lentille à immersion d'huile est préféré pour une meilleure qualité d'image. Isolation vibratoire est également nécessaire pour produire des piles d'images stables. Tables dumper-Type Air sont utiles à cette fin, mais un amorti plus simple du microscope en insérant des balles de tennis sous la base de microscope avec une table régulière peut également fonctionner.
Caméra vidéo
Une caméra CCD capable d'au least 200 images / s est nécessaire pour suivre le mouvement des cils. Au cours de la dernière décennie, caméras CCD avec des taux de trame plus rapides que le taux de vidéo standard (25-30 Hz) sont devenues disponibles à des coûts beaucoup plus faibles. modèles de caméra capable de temps plus courts exposer que l'intervalle de trame sont utiles pour réduire le flou dû au mouvement des cils sans augmenter la quantité de données. Un temps d'exposition de 0,1 ms et un intervalle de trame de 5 ms (200 Hz) sont des conditions minimales pour obtenir des images ciliaires de CPEC avec une qualité suffisante.
Logiciel
L'analyse pour suivre le mouvement de chaque cil est temps, surtout quand les paquets logiciels généraux de but pour l'analyse d'image sont utilisés pour suivre chaque pointe ciliaire. Réduire les étapes de tâches répétitives, comme le clic de la souris sur la position de la pointe ciliaire sur le moniteur, en sélectionnant un menu pour enregistrer la position du clic, et en cliquant sur un bouton pour passer à la prochaine trame d'image, résulte en une re significativeduction de temps et d'effort. Dans cette étude, une routine spéciale a été ajoutée au logiciel TI Workbench sur mesure. Dans le mode de suivi ciliaire du logiciel TI Workbench, l'utilisateur continue de bouclage de l'opération en deux étapes simples suivantes: déplacer le pointeur de la souris à la pointe ciliaire et en appuyant sur une touche fléchée sur le clavier pour faire avancer la trame, qui ne nécessite pas le déplacement de la pointeur souris ou les yeux de l'utilisateur pour décaler (pour les menus et les boutons sur l'écran de l'ordinateur) des conseils ciliaires sur l'écran d'ordinateur. Le logiciel conserve une trace des positions de pointe ciliaires, affiche la trajectoire enregistrée pour aider l'utilisateur, et crée une table d'informations de mouvement ciliaire pour une analyse ultérieure. La plupart des logiciels d'usage général pour l'analyse d'image permet macros de programmation pour le traitement de ces tâches répétitives de lot. Cette programmation personnalisée pour réduire les étapes répétées est fortement recommandé.
Analyse des trajectoires
L'extraction de la trajectories a été réalisée en utilisant le logiciel TI Workbench sur mesure, comme décrit ci-dessus. Analyse relativement simple et traitement de l'image ont également été effectuées en utilisant le même logiciel. Pour les analyses de montage, la trajectoire de chaque pointe de ciliaire a été transféré au logiciel Igor Pro. Autres logiciels d'analyse de pointe tels que MATLAB peut également être utilisé à cet effet.
Dans l'étude actuelle, en raison de difficultés dans la catégorisation des trajectoires en va-et-vient ou trajectoires de rotation, les trajectoires ont été classés par l'œil en aveugle, qui ont été confirmés par un autre observateur, résultant en une classification cohérente. Néanmoins, plus mathématiquement rigoureuse des mesures visant à classer les trajectoires sans arbitraire possible serait préférable. Ellipse montage des trajectoires semble être idéal, ce qui pourrait quantifier la mesure de l'ellipticité que le rapport d'aspect de l'ellipse équipée () à la fois en va-et-vient et des mouvements de rotation. Pourtant, Une tentative d'utilisation de la distribution du rapport d'aspect de définir une valeur de seuil pour la classification était inefficace. Le raccord souvent échoué pour les trajectoires de va-et-vient, les paramètres fréquemment échoué à converger, et le raccord convergé était apparemment illusoire. Par conséquent, l'ajustement ellipse n'a pas été adoptée pour classer automatiquement les trajectoires ou de quantifier l'ellipticité de chaque trajectoire. La fixation a été effectuée pour extraire la direction de battement de pointes mobiles en rotation que le grand axe de l'ellipse équipée.
Dans la présente étude, AR a été proposé pour quantifier la mesure où une trajectoire dévie d'une linéaire idéal de mouvement de va-et-vient. Le paramètre est le rapport de la largeur de répartition perpendiculairement à la direction de battage pour que le long de la direction. La valeur doit être nulle lorsque la trajectoire est une ligne droite, et une lorsque la trajectoire est un cercle, ressemblant le rapport d'aspect de l'ellipse mentionné ci-dessus.
Dans la pratique, l'obtention de la valeur de AR peut être relativement facile en faisant tourner la trajectoire, de sorte que la direction de battement devient parallèle au axe des x (figure 4B). Cette quantification conduit à des valeurs sensiblement différentes pour les deux modes de mouvement, ce qui suggère l'utilisation potentielle du paramètre non seulement de quantifier les caractéristiques de chaque trajectoire, mais aussi de classer plus rigoureusement les trajectoires. Toutefois, il convient de noter que la direction de battage elle-même est déjà le résultat d'un processus d'ajustement distincts pour les deux modes dans la méthode actuelle.
Poursuite de l'amélioration de l'analyse, comme un algorithme d'ajustement plus avancé, pourrait résoudre les problèmes de l'arbitraire possible.
Un aspect concernant l'ellipticité de la trajectoire est que le battement de chaque cil CPEC ne peut pas être en cours dans le plan strictement perpendiculaire au plan x - y
Préparation de la SEM
Lors de la préparation pour l'observation SEM, il ya plusieurs points importants qui assurent l'acquisition des images de haute qualité. Tout d'abord, après la fixation par le tétroxyde d'osmium doit être effectué avec soin, notamment de pré-lavage avec une solution de saccharose à 10%. Sans fixation appropriée par la procédure de osmification, les étapes ultérieures ne peuvent pas maintenir ou rétablir l'état des échantillons, conduisant à une baisse de la qualité de la préparation. Parce que fixateurs aldéhydiques sont des agents réducteurs, des aldéhydes restants dans l'échantillon inhibent l'activité de tétroxyde d'osmium, un réactif oxydant solide. Pour assurer l'élimination des aldéhydes superflus dans les échantillons, un lavage soigneux avec la solution de saccharose est impératif. En cas de sous-optimal post-fixation, la couleur de l'échantillon ne change pas du brun au noir. En second lieu, le volume de tétroxyde d'osmium doit être au moins 50 fois plus grande que celle de l'échantillon. Sinon, la fixation suffisante ne peut pas être prévu. En troisième lieu, il est important d'éviter un séchage complet des spécimens, en particulier pendant le processus de déshydratation qui emploie l'éthanol très pur et l'acétate d'isoamyle. Le séchage de l'échantillon détruit les structures fines de surface telles que les cils, résultant en des images pauvres.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes. Ce document vise à communiquer l'méthodologie détaillée pour observer la motilité des cils dans les tissus du plexus choroïde isolés. Nouveautés scientifiques ont été rapportés dans les études antérieures 1,8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
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