Protocol
프로토콜과 실험 동물의 사용은 야마나시와 와세다 대학의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 동물 관리 기관은 지침에 따라 수행 하였다.
1. CPEC 준비
- 다음 장치 및 재료 준비 : 바닥에서 조명을 전송하는 것이 바람직 할 수있는 스테레오 현미경,; 시계 포셉 한 쌍의 (뒤몽 # 3, # 4), 화염 멸균, 직선 운영 가위, 화염 멸균; 20 ml의 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 미디어를 포함하는 두 멸균 10cm 플라스틱 접시; 2 ml의 RT Leibovitz L-15 매체를 포함하는 35mm의 유리 바닥 요리; 70 % 에탄올을 함유하는 100 ml의 비이커; 신생아 마우스 새끼.
- 간단히 70 % 에탄올에 신생아 마우스를 담그고 운영 가위를 사용하여 잘린 빠르게 안락사.
- 멸균 10cm 디에 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 배지에서 즉시 머리를 배치SH.
- 뇌를 노출하기 위해 두개골을 열 절단, 시계 포셉의 쌍을 사용하여 덮개 뼈의 피부를 제거하고 뇌 전체를 분리 두개골 신경을 잘라.
- 얼음처럼 차가운 Leibovitz L-15 미디어를 포함하는 새 접시에 두뇌를 전송하고 뇌가 완전히 매체에 몰입되어 있는지 확인하고, 스테레오 현미경으로 관찰한다.
- 이 위를 향하도록 뇌의 등 부분을 설정하고 후각 전구 (오른 손잡이 인 경우) 세시 방향에 상주하도록 뇌의 방향. 왼쪽 손에 집게로 부드럽게 뇌를 잡습니다.
- 미세 해부 포셉 (뒤몽 # 3, # 4) 오른쪽 손을 사용하여, 대뇌의 종 방향 균열을 따라 대뇌 반구를 연결하는 뇌량과 실질 아래를 잘라.
- 부드럽게 멀리 측면에 대뇌 반구를 밀어 가로 대뇌 균열을 노출.
- 일을 곤란하게하여 반구를 분리반구과 시상 사이의 전자 실질.
- 조심스럽게 라미 affixa에 의해 해마의 측면에 부착 된 측면 심실 맥락총을 잡아 당깁니다.
- 신선한 Leibovitz L-15 매체를 포함하는 35mm의 유리 바닥 접시에 고립 된 맥락총 이동, 중량 (자료 목록) 조심스럽게 제자리에 조직을 유지하는 오버레이.
CPEC 섬모 2. 라이브 영상
- 400 nm 내지 이상 700 nm의, 그 감광 (ND) 필터 (25 %, 6 %)보다 짧은 광 광로에 삽입 차단하는 적절한 자외선 (UV) 및 추론 (IR) 차단 필터 (들)를 확인 거꾸로 현미경의.
- 거의 눈에 의해 대물 렌즈의 초점을 조절하고, 중심 및 포커스 쾰러 조명에 적합 할 수 있도록 한 다음 콘덴서를 조정한다. 적절한 미분 간섭 대비를 삽입 (DIC) 프리즘, 리튬의 DIC 요소뿐만 아니라, 분석 및 편광판 요소GHT 경로는 DIC 광학을 준수합니다.
- 조직 표면의 구조가 가장 인식되도록 DIC 프리즘 위치하여 뷰의 콘트라스트를 조정한다. 표적 세포의 운동성 모든 속눈썹이 경우, 운동성 섬모의 클리어 뷰 인해 안구 운동에 의해 얻을 수 없다.
- 비디오 카메라에 빛의 경로를 변경하고, 광 전력을 증가시키는 ND 필터를 제거한다.
- 보기와 초점 분야를 조정 초점 모드에서 카메라를 사용합니다. 하는 영상이 모니터에 실시간으로 표시됩니다, 집중하는 동안, 운동성 섬모의 밝은 전망을 사용할 수 없습니다.
- 원하는 기간 (분 초) 0.1 밀리의 노출 시간 200 Hz에서 카메라를 사용합니다. 이미지 스택의 취득 후, 하나의 프레임은 분명 섬모 구조를 표시합니다. 섬모 가장자리 흐리게 경우, 프레임 레이트를 증가 시키거나 더 짧은 노출 시간을 사용한다.
- Leibovitz의 안락사 후 25-60 분 이내에 CPEC의 섬모의 움직임을 기록L-15 매체.
섬모 운동 3. 분석
- 수동으로 컴퓨터 모니터에 각각의 섬모의 패턴을 치고 추적 할 수 있습니다. 각각의 섬모의 궤적 정보 조립 마우스 포인터, 각 프레임의 표시 모양체 선단 위치. 어느 쪽의 추가 분석을 위해 다른 일반적인 응용 프로그램에 동일한 소프트웨어 또는 내보내기를 사용하여 궤도 정보를 분석 할 수 있습니다. 이러한 분석 단계의 효율의 논의에서 설명된다.
- 눈으로 운동의 두 가지 모드, 앞뒤로 또는 회전으로 궤도를 분류.
- 다음 식을 사용 모양체 비팅 주파수 (CBF)를 계산 : [CBF = (초당 프레임 수) / (하나의 비트에 대한 프레임의 평균 개수)] 모양체 팁 움직임도 얻을 수있다 (14) (도 3 ). 동일한 셀에 다른 섬모 각 ciliu의 움직임을 방해 할 수 있기 때문에, 다수의 섬모 박동주기위한이 계산을 반복M, 불규칙성의 결과.
- 단일 셀 내에서 축 치고 섬모의 각도 균일 성을 분석하기 위해, 각각의 궤도 (그림 4)의 박동 각도 θ를 정의합니다. 전후 궤적 들어 직선 섬모 팁의 위치 맞춤, 및 X 선을 이동시킴으로써 행한다과 이루는 각도가 θ를 정의한다. 회전 궤도를 들어, 타원에 위치를 맞춘 타원의 장축이 X시킴으로써 행한다과 이루는 각도가 θ를 정의한다. 피팅의 세부 사항은 대표 결과 섹션에 설명되어 있습니다.
- 각 궤도의 정량적 설명은 일반화 종횡비 AR을 계산한다. 간단히에 의해 궤도를 회전 - θ과 X를 따라 분포의 폭 사이의 비율로 AR을 정의 -와 y -axes (그림 4B). 세부 사항은 대표 결과 섹션에 표시하고, 해석된다유의성은, 상기 매개 변수의 제한은 논의에서 설명된다.
SEM 4. 샘플 준비
주 : SEM이 종합적으로 CPECs상의 섬모의 상태를 평가하는 중요한 방법이다. 현미경에 대한 표본을 준비하기 위해, 표준 절차는 이전에 (15)는 약간의 수정으로 사용된다보고했다.
- 뇌로부터 조직을 절개하기 전에, 폴리에틸렌 캡 5 mL 유리 바이알에 정착액을 준비한다. 정착은 2 % 파라 포름 알데히드, 0.1 M 인산 완충액, pH가 7.4에서 2.5 % 글루 타르 알데히드 (반 Karnovsky의 솔루션 16)로 구성되어 있습니다.
- 단계 1에 기재된 바와 같이 뇌로부터 조직을 해부.
- 간단히 새로운 접시에 행크 평형 염 용액 (HBSS)으로 격리 된 조직을 린스 한 다음, 실온에서 1 시간 동안 유리 바이알에 정착액의 조직을 고정한다. 일회용 전송 피펫을 사용하여 표본 GE를 처리ntly. HBSS로 세척 후 조직 접착된다.
- 정착액 용액에 시편을 전송하기 위해 천천히 방울로 전달 피펫 조직을 함유하는 용액을 소량 배출 및 고정액에 추가.
- 정착 후, 고정액을 폐기하고 인산 완충액으로 세 번 조직을 헹군다.
- 나머지 알데히드를 씻어 10 % 자당 용액에 조직을 담근다. 알데히드를 완전히 제거되도록 10 분 동안 용액에 샘플이 담궈하고 신선한 10 % 수크로오스로 두 번 반복한다. 이 단계는 후속 단계에 적절한 포스트 고정을 달성하는 것이 중요하다.
- 30 분 동안 인산염 완충액 1 % 오스뮴 테트 록 사이드의 용액에 담가 조직하고 이후 정용 얼음 위에 놓는다. 샘플에 의한 색 osmification 정도 판사 : 알데히드가 완전히 제거 될 때, 샘플은 흑색이다.
- 더블 distille 광범위 후 고정 조직 샘플을 씻으십시오D 물을 여러 번.
- 에탄올의 농도 구배에 의해 샘플을 침지 탈수, 보통 65 %, 75 %, 85 %, 95 %, 99 %, 100 %, 10 분마다. 새로 구입 한 병에서 99.5 %의 에탄올로 분 자체를 배치하여 무수 에탄올을 얻습니다. 무수 에탄올로 3 회 탈수를 반복합니다.
- 10 분 동안, 이소 아밀 아세테이트, 임계점 건조를위한 대체 시약으로 탈수 샘플을 놓습니다. 두 번이 단계를 반복합니다. 이 시약은 급속히 증발 샘플은 표면 장력에 의해 파괴의 결과로 건조 될 수있다. 따라서, 완전히 샘플을 건조하지 않습니다.
- 이소 아밀 아세테이트의 최종 교환 후, 바로, 용매의 대부분을 제거 알루미늄 호일로 열려있는 유리 병을 포장하고, 드라이 아이스에 병을 놓습니다. 액체 이산화탄소가 임계점 건조기에서 유리 병에 쉽게 흐르도록 바늘 또는 미세 집게를 사용하여, 유리 병의 입구를 덮고있는 호일에 여러 구멍을 확인합니다. 다음 단계로 진행가능한 한 빨리.
- 이 단계에서, 건조기의 챔버로 이소 아밀 아세테이트 이월을 최소화하지만, 시료가 완전히 임계점 건조 전에 건조시키지 않는다. 또한, 유리 병에 서리의 형성을 피하기 위해 불필요하게 오랜 시간 동안 드라이 아이스에 샘플을 두지 마십시오.
- 물 제거는 조직에 포함되는 동안 조직의 표면 구조는 그대로 남아 있도록 임계점 건조기로 조직 샘플을 함유하는 호일 - 래핑 유리 바이알을 전송. 임계점 건조기를 동작에 대한 자세한 정보는 제조업체의 지침에서 얻을 수있다.
- 신중하게 기계적 손상을 최소화하기 위해 이쑤시개를 사용하여 샘플을 처리합니다. 그 결과 건조 조직 샘플은 약합니다. 이온 스퍼터를 이용하여 금 - 팔라듐 금속 스텁과 코트에 샘플을 탑재합니다.
SEM 5. 관측
- SEM에 의해 관찰하고, 디지털 카메라로 화상을 기록주사 전자 현미경에 장착.
- 분석을 위해 PC에 디지털 화상 데이터를 전송.
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Representative Results
흐름의 개요는 이미지 장치를 포함하여,도 1에 도시된다.
CPECs의 라이브 모션 관측
영화 1 산기 마우스로부터 단리 CPECs의 동영상을 도시하고, 동영상이 동영상 1 이미지의 확대도를 도시한다. 그것은 개별 섬모 팁 영화와 비교 정지 화상 불명확하다는 것을 알아야한다.이 프로그램을도 동영상 1 및도 2에 도시 된 데이터로부터 움직임의 다른 모드, 전후 및 회전 운동 두 섬모 운동 추적.도 3은 섬모의 궤적의 간단한 분석을 보여주는 위상차 두 좌표 회전 운동에 명백하다.
CPEC 섬모 팁 궤적의 분석
드 정량적 각 궤도를 분석하는 방법은 꼬리 치는 각도 θ의 정의 (A) 및 대표 결과 (B)를 분석하는 흐름도의 개략도로,도 4에 도시되어있다.
, 전후 궤도 대 박동 각도 θ를 정의 직선 Y = AX + B에 여러 사이클 동안 모양체 팁의 위치를 맞춘 피팅 된 선을 따라 것과 비팅 방향을 정의한다. θ가 아크 탄 = 여기 박동 각도를 정의합니다. 종종 라인 피팅은, 회전 운동의 경우에 방향을 추출 타원의 회전 궤적을 맞춘 피팅 타원의 장축을 따라 것과 같은 방향을 정의하는데 실패하기 때문에. 보다 구체적으로, 다수의 매질 사이클 동안 팁의 위치 (X, Y)는 아래 함수에 장착된다.
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어디에 
X 0, 0, Y, A, B, 및 θ : 타원 피팅 다섯 피팅 파라미터들을 포함한다. X - 타원의 중심의 Y 좌표 -spatial는 각각 X 및 Y 0 0이다. 타원의 크고 작은 반경은 각각 A 및 B이다. 각도 θ는 장축 X시킴으로써 행한다 또는 비팅 각도 만드는 각도이다. 이러한 파라미터의 개략도는도 4a의 우측 패널에 도시되어있다. 피팅은 전술 명시 함수를 정의하여 이고르 프로 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 그런 다음, 모든 속눈썹에 대한 각도 (θ)를 꺾고의 히스토그램 관찰같은 셀 D는 (나리타 등의 알 그림 2. 8) 원형 막대 그래프로 그려집니다. 주파수 분석 섬모 팁의 개수로 표준화된다. 그것은 각각의 섬모가 원형 히스토그램에서 두 θ 값을 갖는 것으로 해석되는 것을주의해야한다 예를 들어 π / 4 / 4 3π, 방향의 대칭 분포 선도.
θ (도 4b) - 일반화 된 애스펙트 비 AR을 정의하기 위해, 다수의 사이클 동안 모양체의 선단 위치가 회전된다. 회전에 따라, 전후 및되어 회전 궤적 모두 X시킴으로써 행한다, X 축 및 Y 축을 따라 분배와 B의 폭이, 각각의 절반으로 정의되는 대략 평행 분산 최대 및 최소 사이의 차이. 따라서, 이들 파라미터는 타원, 및 (B)의 크고 작은 반경에 더 적합하다. 다음 AR AR = B / A에 의해 간의 비율 및 B로 정의된다.
SEM으로 맥락막 신경총 상피 세포의 관찰
현미경은 시료의 미세 표면 구조를 관찰 할 수 있습니다. CPECs상의 섬모의 존재는 발달 시간 과정을 통해 확인된다. CPECs 여러 섬모의 출현은 맥락막 신경총 개발 E11 주위의 측면 심실에서 시작 직후, 배아 일 (E) (13)에 의해 관찰된다. 이 단계에서 세포는 성숙 가변 외관 작으며 섬모 팁 여러 방향을 향하고있다. E15에서, 다수의 섬모의 술은 주변의 미세 융모에서 밖으로 서있는 선 단면의 상부에 설치된다. 출생 후 하루 (P)이, 많은 섬모는 라이브 영상으로 관찰 섬모의 운동성을 반영, 구부러진 위치에 고정되어있다. P14에서, 대부분의 세포는 여러 비 운동성이있는 섬모뿐만 아니라 미세 융모 승을 가지고 i 번째 초기 단계에 비해 미세한 텍스처. 5이 단계에서 섬모와 CPECs의 SEM 이미지를 보여줍니다. 도 1에 도시 한 동영상 영화에 기초하여, 운동성 섬모 쉽게 라이브 영상으로 인식되는 것은 명백하다. 그러나, DIC 현미경으로 비 - 운동성 섬모를 구별하기 어렵다. 따라서, SEM 전체 섬모 상태를 이해하는 것이 필수적이다.
그림 1 :. 워크 플로우의 개요 () 스테레오 현미경. 청구 결합 소자 (CCD) 카메라를 갖춘 (b) 거꾸로 현미경. 분석 기간 동안 (C) 컴퓨터 화면. (D) 이온 스퍼터. SEM (마) 표본. (f)의 주 사형 전자 현미경.
영화 1.PLOAD / 52991 / Figure_2.mov "대상 ="_ 빈 "> CPECs의 평면도 및 고속 비디오 현미경 P2 마우스 강아지의 섬모의 영화. 맥락막 신경총 조직의 불규칙한 표면이 스냅 샷이 포함되어 있기 때문에 . 모두 초점과 초점이 맞지 평면 상자의 영역이 확장되고, 영화 2 규모 표시 줄에 표시 :. 2 μm의.
영화 2. 영화 1.의 조직 샘플의 확대도의 영화 섬모 잔은 회전 또는 전후 어느 움직임을 보였다. 스케일 바 : 1 μm의.
그림 2 :. 앞뒤로 이동 (위)과 회전 운동 (아래)와 영화 2 시간 경과 이미지 CPEC의 섬모의 궤도에서 재구성 (A) 섬모. DIC 동영상 데이터의 이미지는 50 밀리 초 간격으로 (1 μm의 1-8, 스케일 바)에서 발표된다. 대상 섬모의 끝의 위치는 화살표로 표시됩니다. (나) 궤도 (파선)과 이미지에 표시된 섬모 팁 (컬러 원)의 위치가 중첩되어있다.
그림 3 :. 동영상 데이터에서 재구성 CPEC의 섬모 팁 운동의 2 가지 모드를 여러 회에 걸쳐 대표 섬모의 끝의 움직임, 전후 운동 (A)와 회전 운동 (B)는, 궤도 (최고, 스케일 바 형식으로 표시하고 있습니다 : 0.5 μm의). x 축과 끝 위치의 y 좌표의 시간 코스는 각각 (가운데)를 그려. 두 좌표 사이의 위상 변화를 설명하기 위해, x 축과 y 좌표는 [-1,1]로 정규화 있었다 (각각 빨간색과 파란색 라인을 아래) 입혔다.
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그림 4 : 섬모 팁 궤적의 분석을 설명하는 개략도 전후 (왼쪽 패널) 및 회전 (오른쪽 패널) 궤도의 박동 각도 θ의 () 정의.. 장착 타원, A, B, X 0, 0 및 y를 설명 식 파라미터, 우측 패널에 도시되어있다. (B) 박동 각도 (θ)와 AR을 정의하는 궤적의 피팅 분석의 차트 흐름. 대표 궤도의 피팅의 실제 결과는 오른쪽 패널에 표시됩니다.
그림 5 : 섬모의 전자 현미경 사진. E13, E15, P2 및 P14에서 CPECs의 대표적인 SEM 현미경 사진. 시간 경과 중에 CPECs는 크기가 증가하고 microvi 개발LLI과 혀끝의 표면에 섬모. E13에서 섬모의 술은 운동성을 획득 아직. 섬모 운동과의 비율이 가장 높은 지점에 도달 P2에서, 많은 굴곡 섬모가 관찰된다. P14에서, 섬모 운동을 잃게됩니다. 스케일 바 : 5 μm의.
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Discussion
이 방법의 관점
여기에 설명 된 기술은 이전에 발행 된 방법보다 섬모의 더 상세한 분석을 제공하지 않지만,이 기술의 중요성은 쉽게 섬모 운동 생체의 종류를 선별에 적용 할 수있는 시스템 및 비용 효율성의 단순성에있다. 특히, TI 워크 벤치 관찰하고 더 쉽게 섬모의 운동성을 분석하는 연구를 할 수있는 간단하고 사용자 친화적 인 인터페이스를 제공합니다. 효과적인 자동화 된 추적 방법은 비디오 강화 된 반면-DIC의 흠없는 섬모의 낮은 대비 개체에 대한 개발되지 않았다. 섬모 운동을 추적하는 방법은, 수동이 기술되어 있지만, 섬모 운동 추적 분석 노력의 양은 최적 화상 분석을 위해 범용 소프트웨어 패키지를 사용하는 것과 비교하여 감소된다.
샘플 해부
전자를 준비하려면X 생체 CPEC 샘플, 신속하고 부드러운 조작은 섬모 생체의 운동성을 보장하는 조직의 생존 능력을 유지하는 데 필요한. 적혈구에 의한 오염이 관찰 분야를 흐리게하기 때문에, 인산염 완충 식염수 해부 조직의 부드러운하지만 복잡한 세척이 좋습니다. 출혈을 방지하기 위해주의를 콜로이드 신경총의 affixa 얇은 판에 부착 된 눈에 잘 띄는 붉은 실 같은 구조로 식별 할 수있는 후방 맥락막 동맥 찢어지지 않도록 운동을해야합니다.
현미경
DIC 광학 및 고전력 전송 광원 장착 도립 현미경은이 방법을 위해 필수적이다. 수은 램프는 일반적으로 자주 스위칭 온 및 오프 능력이 있으므로, 램프 하우징의 전면에 셔터가 필요하다. 어느 수동 또는 전기 셔터는이 목적을 위해 사용될 수있다. 시험편과 관찰자의 눈을 보호하기 위해 FR옴 자외선 및 적외선 광은 광학 필터 만 가시 광선 (400-700 대역 통과 또는 UV와 IR 컷 필터의 조합)를 허용해야합니다. 비디오 카메라와 고속 저속 기록 포커싱, 눈으로 모니터링 : ND 필터는 또한 상황에 따라 상이 광 전력을 변경할 필요하다. 높은 개구 수를 가지는 대물 렌즈는 높은 해상도 필요하다. 커버 슬립의 상단 때문에 조직의 형태 및 두께의 초점 사이에 약간의 거리가있다. 따라서, 물에 침지 렌즈보다는 오일 침지 렌즈는 더 나은 이미지 품질에 바람직하다. 제진 안정된 화상 스택을 수득 할 필요가있다. 에어 댐퍼 타입의 테이블은 이러한 목적에 유용하지만,도 작동 할 수 정상 테이블 현미경베이스 아래 테니스 공을 삽입하여 현미경 간단 쿠션.
비디오 카메라
레아에서 가능한 CCD 카메라세인트 200 프레임 / 초는 섬모의 운동을 추적 할 필요가있다. 지난 십년 동안, 표준 비디오 레이트 (25 ~ 30 Hz로)보다 더 빠른 프레임 속도로 CCD 카메라는 훨씬 낮은 비용을 가능하게했다. 상기 프레임주기보다 짧은 노출 시간이 가능한 카메라 모델은 데이터 양을 증가시키지 않고 섬모의 운동으로 인해 블러 링 감소하는데 유용하다. 0.1 밀리의 노출 시간 5 밀리 초 프레임 간격 (200 Hz에서)이 충분한 품질 CPECs 섬모의 화상을 얻기 위해 최소한의 조건이다.
소프트웨어
각각의 섬모의 운동을 추적하는 분석은 이미지 분석을위한 범용 소프트웨어 패키지의 각각의 섬모 팁을 추적하는 데 사용되는 경우, 특히, 시간이 걸린다. 이러한 모니터 모양체 선단 위치에 마우스 클릭 등의 반복 작업의 단계를 줄이기 클릭 위치를 기록하는 메뉴를 선택하고, 버튼을 클릭하면, 다음 이미지 프레임에 상당한 재 결과를 이동시간과 노력의 duction. 본 연구에서는 특별한 루틴은 주문 제작 TI의 워크 벤치 소프트웨어에 추가되었습니다. TI 작업대 소프트웨어 모양체 추적 모드에서, 사용자는 다음과 같은 2 단계의 간단한 조작을 반복 계속 : 이동 요구하지 않는 프레임을 전진 섬모 팁에 마우스 포인터를 이동하여 키보드의 화살표 키를 누름 마우스 포인터 또는 사용자의 눈은 컴퓨터 화면에 모양체로부터 팁 (컴퓨터 화면에 메뉴와 버튼으로) 이동한다. 소프트웨어는 섬모 팁의 위치를 추적 사용자를 돕기 위해 기록 된 궤적을 표시하고, 추가 분석을 위해 모양체 움직임 정보의 테이블을 생성한다. 이미지 분석을위한 대부분의 범용 소프트웨어는 반복 작업의 배치 프로세싱을 위해 매크로 프로그래밍을 허용한다. 반복 단계를 줄이기 위해 이러한 사용자 지정 프로그래밍을하는 것이 좋습니다.
궤도의 분석
trajectori의 추출전술 한 바와 같이 ES, 주문품 TI 작업대 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 비교적 간단한 분석 및 화상 처리도 동일한 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 피팅 분석의 경우, 각각의 섬모의 선단부의 궤적은 이고르 Pro 소프트웨어로 옮겼다. 예컨대 MATLAB 같은 다른 고급 분석 소프트웨어는 또한이 목적을 위해 사용될 수있다.
현재의 연구에서 앞뒤로 또는 회전 궤도로 궤도 분류에 어려움 때문에, 궤도는 일관성있는 분류의 결과로, 또 다른 관찰자에 의해 확인되었다 눈을 멀게 패션에 눈으로 분류되었다. 그럼에도 불구하고, 가능한 모든 독단하지 않고 궤도를 분류하는 더 수학적으로 엄격한 조치가 바람직 할 것이다. 궤적의 피팅 전후 및 회전 운동 양자 모두에 장착 타원 ()의 종횡비로 타원율의 정도를 수치화 할 수있는 것으로 보인다 이상적인 타원. 그러나분류를위한 임계 값을 정의하는 화면 비율의 분포를 사용하는 시도가 비효율적이었다. 자주 앞뒤로 궤도에 실패했습니다 피팅, 매개 변수가 자주 수렴에 실패하고, 통합 피팅 분명히 착각이었다. 따라서, 타원 피팅 자동 궤도를 분류 또는 각 궤도의 타원율을 수치화하기 위해 채택되지 않았다. 피팅 장착 타원의 장축과 같은 회전 이동형 팁 비팅 방향 추출을 행했다.
현재 연구에서, AR은 궤도가 이상적인 선형 왕복 이동 일탈 정도를 정량화하기 위해 제안되었다. 파라미터는 수직 방향을 따른 것과 비팅 방향 분포의 폭의 비율이다. 궤적 위에서 언급 한 타원의 종횡비를 닮은 원형 때 궤적 한 직선이며, 경우에 값은 0이어야한다.
고해시킴으로써 행한다 X 방향 (도 4b)에 평행이되도록 실제적으로, AR 값을 획득하는 단계, 회전 궤적을 비교적 쉽게 할 수있다. 이 정량화 파라미터의 잠재적 사용하는 각 궤도의 특성을 정량화하기 위해,뿐만 아니라, 더 엄격한 궤적을 분류 할뿐만 아니라 제안 운동 두 모드에 대한 고유 값에 상당히 리드. 그러나, 비팅 방향 자체가 이미 현재에있어서 두 가지 모드에 대한 고유 피팅 프로세스의 결과임을 주목해야한다.
분석의 추가의 개선은, 이러한 고급 피팅 알고리즘도 가능 임의성의 문제를 해결할 수있다.
궤적의 타원율 관한 태양은 각각의 섬모의 CPEC 구타 X 엄격 수직 인 평면에서 일어나는되지 않을 수 있다는 것이다 - Y
SEM 준비
SEM 관찰을위한 제조시, 높은 품질의 이미지의 취득을 위해 몇 가지 중요한 점이있다. 첫째, 산화 오스뮴으로 후 고정은 10 % 자당 용액으로 미리 세척을 포함,주의 깊게 수행해야합니다. osmification 절차에 의해 적절한 고정없이 후속 단계는 제제의 낮은 품질로 이어지는 유지하거나 시험편의 상태를 복원 할 수 없다. 알데히드 고정 제 환원제되므로 시료 내의 잔존 알데히드는 산화 오스뮴, 강산 화제의 활성을 억제한다. 표본에서 불필요한 알데히드의 제거를 보장하기 위해, 자당 용액에주의 세척은 필수적이다. 최적의 PO 경우세인트 고정은 시편의 색상은 갈색에서 검은 색으로 변경되지 않습니다. 둘째, 산화 오스뮴의 체적은 적어도 샘플보다 큰 50 배이어야한다. 그렇지 않은 경우, 충분한 정착 기대할 수 없다. 셋째, 특히 고순도의 에탄올과 이소 아밀 아세테이트를 이용하는 탈수 과정에서, 시험편의 완전한 건조를 방지하는 것이 중요하다. 시료의 건조 불량 화상 발생 등 섬모로 미세한 표면 구조를 파괴한다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 이 논문은 고립 된 맥락총 조직에서 섬모의 운동성을 관찰하는 자세한 방법을보고하는 것을 목적으로한다. 과학 참신는 이전의 연구 1,8에서보고되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
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