Abstract
Antimikrobiell følsomhetstesting (AST) er utført for å bedømme in vitro-aktiviteten av antimikrobielle midler mot forskjellige bakterier. AST resultater, som uttrykkes som minste hemmende konsentrasjon (MIC) brukes i forskning for antimikrobiell utvikling og oppfølging av resistensutvikling og i klinisk setting for antimikrobiell terapi veiledning. Dalbavancin er en semi-syntetisk lipoglycopeptide antimikrobielle middel som ble godkjent i mai 2014 Food and Drug Administration (FDA) for behandling av akutt bakteriell hud og huden struktur infeksjoner forårsaket av Gram-positive organismer. Fordelen med dalbavancin enn dagens anti-stafylokokk terapi er den lange halveringstiden, som gjør det mulig for en gang ukentlig dosering. Dalbavancin har aktivitet mot Staphylococcus aureus (inkludert både meticillinfølsom S. aureus [MSSA] og meticillinresistente S. aureus [MRSA]), koagulase-negative stafylokokker,
Introduction
Dalbavancin er en semi-syntetisk lipoglycopeptide som ble godkjent av FDA i mai 2014 ved behandling av akutte bakterielle hud og hud struktur infeksjoner forårsaket av Gram-positive organismer 1. Det primære målet med detaljering denne metoden i et videoformat er å gi klare retningslinjer til de kliniske laboratorier og forskere for testing og rapportering av nøyaktige og reproduserbare dalbavancin resistens mot.
Bestemmelsen av et antimikrobielt middel MIC ved kommersielle fremgangsmåter blir rutinemessig utført i kliniske laboratorier for vurdering av en agent in vitro aktivitet mot patogene bakterier. Metoden som beskrives her er det kokes mikrofortynningsplater metoden som er anbefalt av CLSI og ISO 2,3,4. Siden dalbavancin kommersielle resistens metoder er for øyeblikket ikke tilgjengelig (på tidspunktet for denne publikasjonen) og disk diffusjon og agarfortynnings metoder er for tiden ikke anbefalt feller dalbavancin, referanse buljong fortynningsmetoder er de aktuelle alternativene 12,14. Ettersom dette referansemetode er ikke en kommersiell og FDA ryddet in vitro diagnostiske metoden, kliniske laboratorier i USA som bruker denne fremgangsmåten for pasienten testing må følge regelverket for et laboratorium utviklet test (LDT). Det er forventet at når dalbavancin bruken øker, vil flere laboratorier har behov for å teste denne forbindelse. Vancomycin testing som et surrogat for bestemmelse av dalbavancin mottakeligheten S. aureus har blitt validert 5. Imidlertid kan dalbavancin være aktive mot vancomycin mellom S. aureus (VISA) og derfor kan klinikere be dalbavancin MIC resultater. I tillegg kan det MIC resultater for andre bakterielle arter bli forespurt.
FDA utsatt stoppunkt for dalbavancin mot S. aureus er etablert på ≤0.12 mikrogram / ml. FDA tildelt bare en susceptiold kategori på grunn av manglende data om resistente isolater. Den normale MIC Fordelingen blant villtype S. aureus isolater er mellom 0,03 til 0,12 ug / ml, med en klar modal MIC på 0,06 ug / ml. En liten variasjon i MIC resultater på grunn av metoden forskjell, i tillegg til den iboende BMD variasjon på ± én fortynning, potensielt kan ha en betydelig innvirkning på mottakelighet prisene. 6 I likhet med andre lipoglycopeptide agenter, kan dalbavancin resistenstesting være utfordrende som følge av oppløselighet og den relativt store størrelsen på molekylet og dets bindingsegenskaper 7,8,9. Referanse BMD metoden beskrevet her innbefatter to spesifikke trinn som er unike for uoppløselige stoffer og / eller lipoglycopeptide midler: (1) bruk av DMSO for fremstilling av stamoppløsninger og (2) tilsetning av 0,002% P-80 i den endelige MIC panel fortynninger. Målet med denne videoen publikasjonen er å gi klarhet i dalbavancin BMD metoden og til spesifikasjonlly fokusere på disse viktige skritt, for å sikre nøyaktige og reproduserbare MIC resultater.
Protocol
MERK: Se CLSI dokumenter M7-A10 og M100-S25 og / eller ISO / FDIS 20776-1 for fullstendige opplysninger om referansen buljong mikrofortynningsplater metode for antimikrobiell resistens 2, 3, 4 referansemetodene tillate for alternativer i noen av de. fremgangsmåter som er spesifikke for inokulum forberedelse og MIC plateproduksjonen for å oppnå det samme sluttresultat. Metoden beskrevet her angår en antimikrobielt middel, dalbavancin, og noen av trinnene representere en potensielt flere måter referanseprosedyren kan gjøres. Hensiktsmessig sikkerhetsregler (i samsvar med biosikkerhetsnivå 2) bør utnyttes 10. MIC panelformat som brukes for formålet med denne video publikasjonen er vist i tabell 1.
1. Lagre dalbavancin Powder
- Ved mottak av diagnostisk karakter dalbavancin pulver, butikken ved -20 o C i et uttørket miljø i en ikke-avriming fryser. Før bruk skal pulveret likevekt tilnå RT før åpning.
2. Forbered MIC Panel fortynninger
- Forbered en stamløsning ikke høyere enn 1600 mikrogram / ml dalbavancin i ryddig (ren) DMSO i sterile glass eller plast rør, og bruke på samme dag med forberedelser eller butikken ved -20 til -60 ° C eller under for fremtidig bruk i en ikke-avriming fryser. Ta hensyn til styrken av dalbavancin som leveres på dokumentasjonen mottatt med pulveret, da veiing pulveret (se ligning en for eksempel 800 mikrogram / ml lager forberedelse).
- Fortynn lager fortynning lik ordningen som er vist i kolonne 1 ("Source Konsentrasjon") i tabell 2 med rent DMSO i sterile glass eller plastrør. Bruk en pipette for å måle fortynningsmiddel og annen pipette for å legge den første dalbavancin aksjen til det første røret. For hvert påfølgende dalbavancin lager konsentrasjon bruke en ny pipette.
- Forbered 100X endelige MIC panel concentrasjonerings fortynninger (mellomliggende konsentrasjoner) med ryddig DMSO. Som vist i kolonner 2-4 i tabell 2, kombinere passende mengder av kilde og DMSO for å oppnå ønsket mellomkonsentrasjon (volumer som skal benyttes vil avhenge av antallet av MIC-paneler som skal gjøres).
- Forbered 0,004% P80: Forbered en fersk arbeidsstamløsning av 2% P80 ved å legge 0,1 ml P80 til 4,9 ml dH 2 O. Steriliser ved føring gjennom et 0,22 pm filter og bruksoppløsningen på samme dag av preparatet. Forbered 0,004% P80 fortynningsmiddel ved å lage en 1: 500 fortynning fra 2% P80 (for eksempel, 0,3 ml 2% P80 til 149,7 ml CAMHB).
- Videre fortynne de mellomliggende konsentrasjoner fremstilt i trinn 2.2 1: 100 i kation reguleres Mueller Hinton buljong (CAMHB) supplert med 0,004% (v / v) polysorbat 80 (P-80) P-80 og / eller LHB (for streptokokker) tilsettes det dobbelte av sluttkonsentrasjon på grunn tilsetning av inokulum (trinn 4.3) vil resultere i et 1: 2 fortynning. Se kolonnene 6 og 7 i tabell 2
3. Forbered MIC Panels
- Dispensere 50 ul av hver dalbavancin-løsning fremstilt i trinn 2.3 til passende brønner på MIC panel og omfatter media bare i en brønn (vekstkontroll i tillegg). En flerkanals pipette med sterile tips kan brukes for dette trinnet.
- Bruk paneler umiddelbart eller forsegle med plastfolie og legg i plastposer og umiddelbart plassere i en ikke-tining fryser ved ≤-20 o C (fortrinnsvis ≤-60 o C) inntil nødvendig. Hvis frosset paneler blir brukt, fjerne sel og plassere individuelle paneler på laboratoriebenken for 15-30 min (til vel innholdet er tint) før du går videre til panelet vaksinasjonen.
4. Inokulere MIC Paneler, Utfør Purity og oppsett kimtall
- Velge flere godt isolerte kolonier fra en 18-24 timers blod-agar eller et annet ikke-selektiv agar plate. Trykk på toppen av hver koloni med en steril løkke eller vattpinne og overføring til på 1-5 ml CAMHB eller saline til turbiditet tilsvarer 0,5 McFarland standard. Vurdere turbiditet ved visuell sammenligning med 0,5 McFarland, eller med et fotometrisk enhet.
- Innen 15-30 min med forberedelser, fortynne inokulumet 1: 100 i CAMHB (100 pl i 10 ml CAMHB). For de fleste bakterier som ble testet mot dalbavancin, med unntak av S. pneumoniae, vil denne fortynningen gi en sluttkonsentrasjon på vel 5 x 10 5 CFU / ml (akseptabelt område er 2-8 x 10 5 CFU / ml). For S. pneumoniae bakteriekonsentrasjon basert på sammenligning av turbiditeten til en 0,5 McFarland er typisk betydelig mindre, og derfor fortynne inokulatet 1:25 (400 ul i 10 ml CAMHB + 10% + LHB).
- Innen 15 minutter etter tilberedning inokulum, overfør 50 pl av den endelige inokulum til hver brønn (med unntak av sterilitet kontrollbrønnen) av MIC panel fremstilt i trinn 3. En flerkanals pipette ved hjelp av sterile tips kan brukes for dette trinnet.
- Utfør en renhet sjekkved å overføre og spre en 1-10 ul alikvot fra den positive vekstkontroll brønn ved bruk av en steril sløyfe til en ikke-selektiv agar (f.eks trypticase soya-agar med 5% saueblod).
- Oppsett kimtall ved fjerning av 10 pl fra vekstkontroll godt med en enkelt kanal pipette og sterile spiss og overføring til 10 ml saltløsning (1: 1000 fortynning). Miks og overfører 100 ml med en enkelt kanal pipette og sterile tips til en passende, ikke-selektive agar medium (f.eks trypticase soya agar med 5% saueblod) og spredt over hele agar overflaten med en steril løkke, gjenta to ganger i forskjellige retninger for å sikre jevn fordeling av inokulumet (1:10 fortynning).
5. Inkuber MIC Paneler, kimtall og renhet Plates
- Forsegle hver MIC panel eller en stabel med ikke mer enn 4 paneler i en plastpose, med plast tape eller med en tettsittende plastdekselet før inkubasjon. Alternativt plassere tom MIC panel på top av stabelen på ikke mer enn 4 MIC paneler, plassere en fuktig tørkepapir i en plastboks, sted MIC paneler i plast container og tett beholder, sikkert med lokk.
- Inkuber MIC paneler i en omgivende luftinkubator ved 35 ° C ± 2 ° C i 16-20 timer (stafylokokker og enterokokker) og 20 til 24 t (streptokokker) i løpet av 30 min fra inokulering. Inkuber kimtall og renhetsplater under samme betingelser, bortsett fra inkubatet streptokokker i en 5% CO2 inkubator.
6. Les MIC og kimtall plater; Sjekk Purity Plate
- Les MIC som den laveste konsentrasjon som fullstendig inhiberer bakterievekst i brønnene som detekteres av det blotte øye.
- Telle kolonier på kimtall plate. Multiplisere hver koloni med fortynningsfaktoren (1: 10000) (som er 50 kolonier ekvivalent med 5 x 10 5 CFU / ml). Et akseptabelt område er 20-80 kolonier (2-8 x 10 5 CFU / ml) og blir brukt som en hensiktsximate retningslinje.
- Sjekk renhet plate. Dersom alle kolonier er lik de koloniene som anvendes i trinn 4.1, og inokulumet kan betraktes som ren. Hvis det er noen andre kolonier til stede, så er det et potensial for en forurensning som kan være tilstede i MIC-panelet og testen bør gjentas.
7. Sjekk kvalitetskontrollresultater.
- Se Tabell 3 for forventede områder av CLSI kvalitetskontroll stammer. Bare rapportere resultatene av testen isolater hvis dalbavancin MIC resultater for kvalitetskontroll organismen (e) er innenfor det forventede området.
- Dersom en MIC på ≥0.25 pg / ml oppnås ved andre kliniske S. aureus isolere, gjenta dalbavancin MIC testing og / eller sende til en referanselaboratorium for bekreftelse.
Representative Results
Standardiserte MIC metoder er nødvendig for å overvåke resistensutvikling, et viktig mål for ulike antimikrobielle overvåkingsprogrammer. Dalbavancin MIC resultater for isolater som er samlet i Europa og USA i 2011-2013 var <0,25 ug / ml til 99,9% av S.aureus og 100% av streptokokker (tabell 4).
For å vurdere betydningen av å bruke friske (forseglet) DMSO, tre eksemplarer testing av dalbavancin BMD MIC for QC stammer S. aureus ATCC 29213, og E. faecalis ATCC 29212 og duplisere testing for S. pneumoniae ATCC 49619 ble utført ved bruk av (1) DMSO fra forseglede ampuller, (2) DMSO fra en 1-liters flaske som var innenfor utløpsdatoen og hadde blitt brukt tidligere i 2 år, og (3) en aliquot av DMSO fra samme 1 L flaske (prøve 2) som fikk stå i et åpent begerglass i 72 timer før bruk. Dalbavancin MIC resultater ved hjelp av paneler laget med alle tre DMSO prøvene var like og wTVen på akseptable QC områder (tabell 5).
Tapet av dalbavancin-aktivitet etter eksponering av stamløsningen til plastisk og uten tilsetning av P-80 har blitt godt dokumentert 7. I 2 ytterligere studier, tillegg av P-80 til de innledende og mellomliggende lagerløsninger (tabell 6) og anvendelse av glass- eller plastrør for fremstilling av de innledende og mellomliggende lagerløsninger (tabell 7) ikke har en virkning på de dalbavancin MIC resultater. Det var heller ingen effekt på dalbavancin MIC resultater når polypropylen og polystyren plater fra tre produsenter ble benyttet (tabell 7).
Tilstedeværelsen av lysert hesteblod i buljongen media for testing av streptokokker har vist seg å ha en overflateaktiv-lignende aktivitet, sammenlignes med P-80 7, 8. Den dalbavancin referansemetoden for streptococcus omfatter både P-80 og lysert hesteblod ,imidlertid, i motsetning til stafylokokker og enterokokker, dalbavancin MIC resultater for streptokokker er de samme (innen +/- 1 fortynning) med og uten tilsetning av P-80.
Som det har blitt presentert tidligere og vist i figur 1, dalbavancin agar fortynning (AD) MIC er vanligvis 2-8 ganger høyere sammenlignet med dagens BMD referanse 12, 13, 14. I motsetning BMD, tilsetning av 0,002% P-80 ikke gjør påvirke dalbavancin AD MIC resulterer 12.
Ligning 1: Eksempel på dalbavancin Stock Solution Forberedelse Forberedelse trinnene for 25 ml 800 mikrogram / ml dalbavancin løsning..
Figur 1. Sammenligning av dalbavancin og Vancomycin BMD til AD. Resultatene av studien som sammenlignet dalbavancin og vancomycin BMD og MIC AD resultater for utvalgte Gram-positive bakterielle isolater. Gjennomsnitt (A) dalbavancin og (B) Vancomycin Buljong mikrofortynningsplater og Agar fortynning MIC Resultater i mikrogram / ml for 15 Staphylococcus aureus, 8 Koagulasepositive negative stafylokokker (CNS), 5 Enterococcus faecalis og 14 streptokokker (gruppe A, B og C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL; 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| B | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| C | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL0,12 | DAL 0,25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| D | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| E | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. | |
| F | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| G | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 00,5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| H | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0,03 | DAL 0,06 | DAL 0,12 | DAL 0,25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| DAL | Dalbavancin | |||||||||||
| Konsentrasjoner er angitt i mikrogram / ml etter 50 ul / brønn inokulering | ||||||||||||
Tabell 1. MIC plateformat. Den 96-brønners plateformat som viser plasseringen av dalbavancin fortynninger og positive kontrollbrønner brukt som et eksempel i denne video publikasjonen
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Kilde Kons. (ug / ml) | Volum Source (ml) | Volum DMSO (ml) | Intermediate Kons. i DMSO (ug / ml) | Volume Intermediate Kons. (ml) | Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) | 2X Kons. Etter 1: 100 fortynning i CAMHB (ug / ml) | Endelig Panel Kons. Etter inokulering (ug / ml) |
| 800 | 1.0 | 1.0 | 400 | 0,02 | 1.98 | 4 | 2 |
| 400 | 0.5 | 0.5 | 200 | 0,02 | 1.98 | 2 | 1 |
| 400 | 0.5 | 1.5 | 100 | 0,02 | 1.98 | 1 | 0.5 |
| 400 | 0.5 | 3.5 | 50 | 0,02 | 1.98 | 0.5 | 0,25 |
| 50 | 0.5 | 0.5 | 25 | 0,02 | 1.98 | 0,25 | 0.125 |
| 50 | 0.5 | 1.5 | 12.5 | 0,02 | 1.98 | 0.125 | 0,06 |
| 50 | 0.5 | 3.5 | 6,25 | 0,02 | 1.98 | 0,06 | 0,03 |
| 6,25 | 0.5 </ td> | 0.5 | 3.13 | 0,02 | 1.98 | 0,03 | 0,015 |
| 6,25 | 0.5 | 1.5 | 1.5 | 0,02 | 1.98 | 0,015 | 0,008 |
| 6,25 | 0.5 | 3.5 | 0.8 | 0,02 | 1.98 | 0,008 | 0,004 |
| 0.8 | 0.5 | 0.5 | 0.4 | 0,02 | 1.98 | 0,004 | 0,002 |
| Denne tabellen har blitt forandret fra CLSI M100-S25, tabell 8B 3 | |||||||
Tabell 2. Skjema for Forbereder Fortynninger av vann-uløselig Antimicrobial Agents å bli brukt i buljong fortynninger resistenstesting. Volumene av dalbavancin arbeidsløsninger og fortynningsmidler for utarbeidelse av endelig MICdalbavancin løsninger av 0,002 til 2 ug / ml.
| Quality Control Strain | Forventet dalbavancin MIC (ug / ml) |
| S. aureus ATCC 29213 | 0,03 til 0,12 |
| E. faecalis ATCC 29212 | 0,03 til 0,12 |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 0,008 til 0,03 |
Tabell 3. Forventet dalbavancin MIC Resultater for Kvalitet kontrollstammer 3, 11. CLSI kvalitetskontroll resultater for foreslåtte stammer som skal testes sammen med kliniske isolater for å verifisere riktig metodikk
Tabell 4. Fordeling av dalbavancin MIC resultater (Antall på hver MIC) fra USA og europeiske 2011-2013 Surveillgen Study 15. Dalbavancin MIC resultater fra en undersøkelse publisert av nyere kliniske isolater som en indikator for strøm dalbavancin in vitro-aktivitet.
| Isoler # | Dalbavancin MIC (ug / ml) | ||
| DMSO 1 | DMSO 2 | DMSO 3 | |
| S. aureus ATCC 29213 | 0,12 | 0,06 | 0,06 |
| 0,12 | 0,06 | 0,06 | |
| 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| E. faecalis ATCC 29212 | 0,06 | 0,06 | 0,06 |
| 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| 0,015 | 0,015 | 0,015 | |
| 0,03 | 0,015 | 0,015 | |
| DMSO 1 = Uåpnet flamme forseglet 10 ml ampuller | |||
| DMSO 2 = Ofte åpnet 1L flaske | |||
| DMSO 3 = Ofte åpnet 1L flaske - satt på benken i udekket beger for 72 timer | |||
Tabell 5. dalbavancin MIC resultater (mikrogram / ml) ved hjelp av DMSO Stock og Intermediate fortynninger Forberedelse med DMSO fra 3 kilder. Resultater fra en dalbavancin MIC studie som sammenlignet effekten av å bruke ulike DMSO løsemidler i utarbeidelsen av dalbavancin lager og mellom fortynninger.
| Isoler Antall | Replikere Antall | Dalbavancin MIC (ug / ml) | |
| DALB m / P80 i DMSO | DALB w / o P80 i DMSO | ||
| S. aureus ATCC 29213 | 1 | 0,06 | 0,06 |
| 2 | 0,06 | 0,06 | |
| 3 | 0,06 | 0,06 | |
| 4 | 0,06 | 0,06 | |
| S. aureus klinisk DP80-002SA | 1 | 0,03 | 0,03 |
| S. aureus ATCC 700699 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 1 | 0,03 | 0,015 |
| 2 | 0,03 | 0,015 | |
| 3 | 0,03 | 0,015 | |
| 4 | 0,03 | 0,015 | |
| S. pyogenes kliniske: | |||
| DP80-004PY | 1 | 0,015 | 0,015 |
| DP80-005PY | 1 | 0,03 | 0,03 |
| DP80-006PY | 1 | 0,03 | 0,015 |
| DP80-007PY | 1 | 0,06 | 0,03 |
| DP80-008PY | 1 | 0,03 | 0,015 |
| S. agalactiae klinisk: | |||
| DP80-009AG | 1 | 0,06 | 0,12 |
| DP80-010AG | 1 | 0,06 | 0,03 |
| DP80-011AG | 1 | 0,06 | 0,06 |
| DP80-012AG | 1 | 0,06 | 0,06 |
| S. dysgalactiae clinical DP80-013DY | 1 | 0,03 | 0,03 |
| S. pneumoniae klinisk: | |||
| DP80-014SP | 1 | 0,06 | 0,06 |
| DP80-015SP | 1 | 0,03 | 0,03 |
| DP80-016SP | 1 | 0,03 | 0,03 |
| DP80-017SP | 1 | 0,06 | 0,06 |
Tabell 6. dalbavancin MIC resultater ved hjelp av DMSO Stock og Intermediate fortynninger Forberedelse med og uten 0,002% P-80. Resultater av en dalbavancin MIC studie som sammenlignet effekten av å legge 0,002% P-80 til dalbavancin lager og mellom fortynninger.
| Isoler | Replikere Antall Stock fortynningsrør | Mikrotiterplate (Plast Type) | |||||||
| Poly-propylen, Greiner | Polystyren | ||||||||
| Glass | Plast | Plastic 1t | Plastic 1t / Intermediate 1t | Greiner | Corning | Nunc | |||
| S. aureus ATCC 29213 | 1 | 0,06 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | 0,03 | 0,06 | 0,03 |
| 2 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | |
| 3 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | 0,03 | |
| E. faecalis ATCC 29212 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | 0,03 | |
| 2 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | 0,03 | |
| 3 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,03 | 0,03 | 0,06 | 0,03 | |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 1 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,008 | 0,008 | 0,008 | 0,008 |
| 2 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,008 | 0,015 | 0,008 | 0,008 | |
| Glass = Initial lager laget i glass flaske, brukes umiddelbart for å gjøre middels konsentrasjons i plastrør, som brukes umiddelbart for å lage buljong fortynninger. | |||||||||
| Plastic = Initial lager laget i plast sentrifugerør, brukes umiddelbart for å gjøre mellomkonsentrasjoner i plastrør, som brukes umiddelbart for å lage buljong fortynninger. | |||||||||
| Plast 1 time = Initial lager laget i plast sentrifugerør, la sitte på benken i en time og deretter brukt til å lage mellomkonsentrasjoner i plastrør, som brukes umiddelbart for å gjøre konsentrasjoner i buljong. | |||||||||
| Plast 1 time / Intermediate 1 time = Initial lager laget i plast sentrifugerør, la sitte på benken i en time og deretter brukt til å lage mellomkonsentrasjoner i plastrør, la sitte på benken i en time og deretter brukt til å lage konsentrasjoner i buljong. | |||||||||
Tabell 7. dalbavancin MIC resultater ved hjelp av Stock fortynninger Forberedelse i plast og glass rør og MIC Plate plasttyper. Resultater ofa dalbavancin MIC studie som sammenlignet effekten av å bruke plast eller glass rør ved utarbeidelsen av stamløsninger og også effekten av å bruke ulike kilder og typer av plast for mikrotiterplater.
Discussion
Følgende metode detaljer presenteres for ekstra hensyn når du forbereder for dalbavancin MIC testing. Utformingen av MIC panelet vil avhenge av hvor mange antimikrobielle midler som skal testes (ie., Dalbavancin alene eller flere midler) og de arter av bakterier som skal undersøkes. De dalbavancin konsentrasjoner bør omfatte de fortolkende brytningspunkt for alle bakteriearter som skal testes og hele spekteret av fortynninger forventet i minst ett QC belastning. Den antimikrobielle fortynningsserie kan organiseres i rader eller kolonner, avhengig av antall av antimikrobielle midler og / eller isolerer / plate og en fremgangsmåte for inokulering. Volumet av dalbavancin pulver suppen og bør beregnes for å sikre at optimale mengder er produsert og avfall er minimal. For eksempel brukes i denne publikasjonen, er volumene basert på utarbeidelse av to MIC paneler. Kasjon justert Mueller Hinton buljong bør forberedes og autoklaveres i henhold til mannenprodusentens instruksjoner og sterilitet av media bekreftet. MIC paneler kan gjøres og brukes på samme dag i forberedelse eller de kan testes med egnede kvalitetskontrollorganismer og validerte paneler lagret frosset for senere bruk. Det er viktig å anvende sterile teknikker gjennom hele prosedyren.
Det er ingen strenge kriterier for verifikasjon av inoculum konsentrasjon med kimtall. Kimtall kan kontrolleres i utgangspunktet for hver art som ble testet og / eller periodisk for å validere fortynningen utføres i trinn 4,2. Det er viktig at gyldigheten av 0,5 McFarland-standard er også kontrollert rutinemessig med E. coli ATCC 25922 ved hjelp av en prosedyre lignende Trinn 4,5. Hvis resultatene er ikke tilsvarer 1-2 x 10 8 CFU / ml, en ny 0,5 McFarland standard bør innhentes. Dersom kimtall fra MIC brønner er utenfor akseptabelt område (2-8 x 10 5 CFU / ml og MIC resultater for den kliniske isolat (e) varierer fra the forventet normalfordeling (f.eks. 0,03 til 0,12 ug / ml for S. aureus) og / eller MIC resultater for kvalitetskontroll isolat (e) er utenfor forventede områder, er validering testing nødvendig og metode modifisering kan være berettiget. Det er foreslått at en validert 0,5 McFarland-standard anvendes for å gjenta kimtall (e), og hvis resultatet er igjen utenfor forventede resultater, bør inokulumet fortynning som utføres i trinn 4.2 justeres tilsvarende, og MIC gjentas. Merk at en renhet sjekk er nødvendig selv om en kimtall utføres fordi kimtall prosedyren bruker en utvannet volum som kanskje ikke nødvendigvis oppdager lavere konsentrasjoner av forurensende organismer.
For en MIC-test for å være gyldig, må akseptabelt vekst forekommer i vekstkontroll brønnen. For de fleste bakterier som skal testes mot dalbavancin (f.eks., Stafylokokker, streptokokker og enterokokker, veksten vil bli sett på som en knapp (typisk> 2 mm) og mindre frderetter benyttet, kan veksten vises som turbiditet i brønnen. I motsetning til enkelte antimikrobielle midler som kan utvise elegant effekt som konsentrasjoner øke, er dalbavancin endepunkter vanligvis godt definert. Det finnes ulike visnings utstyr som er beregnet for å lette lesing mikrofortynningsplater tester, som kan anvendes til å lese dalbavancin inneholdende platene, så lenge det ikke er noe kompromiss i evnen til å skjelne veksten i brønnene.
De kritiske trinnene i protokollen er knyttet til de delene av den prosedyre som er relatert til oppløseligheten av dalbavancin og tilsetning av P80. Det er viktig at den maksimale konsentrasjon av dalbavancin anvendes ikke er større enn 1600 ug / ml, som DMSO blir benyttet som oppløsningsmiddel og at det mellomliggende konsentrasjoner fremstilles i DMSO før fremstilling av kjøttkraft fortynninger, slik at sluttkonsentrasjonen av DMSO i MIC panel brønner ikke er større enn 1%. DMSO er hygroskopisk og derfor er bruken av eldre flasker DMSO var en consideration med hensyn til dalbavancin oppløselighet. Men mens en liten BMD studie med kvalitetskontroll stammer har vist at dette ikke skal være en viktig variabel (se resultater avsnitt), er det lurt å bruke nye eller nylig åpnede flasker med DMSO. Det er også viktig at P80 tilsettes til kjøttkraft i det siste trinnet av medikament-fortynning preparatet, og er ved en sluttkonsentrasjon på 0,002% i MIC brønnen.
BMD prosedyre inkludert her benytter fremstillingen av MIC-paneler med 50 ul / brønn ved dalbavancin og P-80 konsentrasjoner to ganger den endelige konsentrasjon og tilsetning av inokulum med 50 ul / brønn, slik at sluttvolumet / er vel 100 ul. Denne metoden gjør det mulig for en MIC panel format som skal produseres for testing av både S. aureus og S. pneumoniae fordi lysert hesteblod kan tilsettes til inokulum. Alternative fremgangsmåter for fremstilling av MIC-paneler med 100 ul / brønn med tilsetning av opp til 10 pl / brønn, er beskrevet iCLSI og ISO prosedyrer.
Den dalbavancin utsatt stoppunkt for S. aureus er ≤0.12 mikrogram / ml (FDA i pakningsvedlegget). Som vist i nyere overvåking, er de fleste av isolater hemmet av dalbavancin på nivåer på 0,06 mg / ml 15. Med en mottakelig stoppunkt i nærheten av den modale MIC, kan en hvilken som helst variasjon i MIC som et resultat av metoden forskjeller påvirker mottakelighet priser. På grunn av at fremgangsmåten for BMD dalbavancin inneholder noen unike trinn (nærmere bestemt, ved bruk av DMSO i fremstillingen av lager og mellomliggende medikamentfortynninger og 0,002% P80 i MIC brønnen, er det viktig at fremgangsmåten blir fulgt nøyaktig. S. aureus QC organisme (ATCC 29213) med en veldig klar dalbavancin modal MIC på 0,06 ng / ml, har vært en god indikator på metoden variasjon og bør brukes rutinemessig for å validere BMD metoden. Hvis MIC resultatene er med forventet område av 0,03 til 0,12 mikrogram / ml, men blir Tendens til enten lav eller high side av dette område blir ytterligere validering av metoden berettiget.
Tilsetningen av 0,002% P80 er anbefalt for alle relevante Gram-positive organismer (staphylococcci, enterokokker og streptokokker.) Det er imidlertid bemerkelsesverdig at det har vist seg at lysert hesteblod virker i likhet med P-80 i forhold til sin anti-bindende evne og at tilsetningen av P-80 for å CAMHB + LHB ikke har noen ekstra effekt på dalbavancin streptokokker MIC resultater.
Det er for øyeblikket ingen disk diffusjon metode for testing dalbavancin og på grunn av dårlig korrelasjon av BMD og AD resultater, resistenstesting av dalbavancin bruke AD metoden anbefales ikke 12, 14. Den BMD metoden skal brukes for fremtiden vurdering av dalbavancin mottakelighet og som en gullstandard for utvikling av kommersielle antimikrobielle resistenstester.
Disclosures
Sandra McCurdy er ansatt i Varighet Therapeutics; Laboratorie Spesialister, Inc., arbeidsgiver Laura Koeth og Jeanna Fisher ble kontrahert ved Varighet Therapeutics å forberede manuskriptet. Publiserings avgifter for denne artikkelen ble betalt av Laboratorium Spesialister, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
| Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
| Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
| Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
| Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
| 12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Single channelpPipets (Ovation 10 µl - 100 µl) | VistaLab | Brewster, NY | |
| 96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
| 50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16x125 mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 12x17 mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16 ml centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
| Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
| Disposable sterilelLoops (1 µl & 10 µl) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
| Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
| Incubator (ambient) | Sanyo | ||
| Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
| Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
| Lab coats |
References
- Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
- M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , Tenth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, International Organization for Standardization. (2006).
- Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
- Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
- Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
- Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
- Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
- Ribbon Panel, B. lue Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
- Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
- Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , San Francisco, CA. (2012).
- Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
- Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
- Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).
